李 萍，賈春曉，寧方堯，溫 韜，陳 延

（1.廣西工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530004；2.廣西壯族自治區(qū)產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院，廣西南寧 530004）

啤酒以麥芽為主要原料經(jīng)酵母發(fā)酵而成，富含 多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（如維生素、礦物質(zhì)、碳水化合物、氨基酸和酚類(lèi)化合物），也被稱(chēng)為液體面包，是世界上消費(fèi)最廣泛和最受歡迎的酒精飲料[1]，是居民飲食的重要組成部分。與其他酒精飲料相比，啤酒中的嘌呤含量相對(duì)較高，為40～136 mg/L[2]。高嘌呤食品在體內(nèi)代謝變化容易導(dǎo)致人血液中尿酸含量增高，形成高尿酸血癥、痛風(fēng)、高血壓、糖尿病等多種代謝慢性疾病[3]。研究表明，啤酒的長(zhǎng)期飲用是引起高尿酸血癥[4]的重要原因，啤酒與痛風(fēng)[5]之間存在高度依賴性。精釀啤酒作為高端啤酒市場(chǎng)的主要代表，是一種具有獨(dú)特風(fēng)味和釀造方式的個(gè)性化啤酒產(chǎn)品。近年來(lái)，我國(guó)精釀啤酒的銷(xiāo)量以每年40%的速度增長(zhǎng)，很受消費(fèi)者歡迎。因此，精釀啤酒中嘌呤的準(zhǔn)確檢測(cè)具有重要意義，可為精釀啤酒的生產(chǎn)和消費(fèi)提供科學(xué)指導(dǎo)。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)啤酒中嘌呤的含量尚無(wú)精確、統(tǒng)一的測(cè)定方法。嘌呤主要以結(jié)合態(tài)形式存在于啤酒中，為了測(cè)定啤酒中的嘌呤含量，應(yīng)先水解4種嘌呤堿。嘌呤含量的主要檢測(cè)方法包括高效液相色譜、氣相色譜、反相離子對(duì)色譜、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜和毛細(xì)管電泳[6-7]。其中，高效液相色譜（HPLC）是最常用的檢測(cè)啤酒等酒精飲料中4 種嘌呤的方法[8-9]。青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)營(yíng)養(yǎng)研究所[10]建立了測(cè)定啤酒4 種嘌呤的高效液相色譜法，測(cè)得腺嘌呤25.95 mg/L、鳥(niǎo)嘌呤21.60 mg/L、次黃嘌呤435 mg/L，回收率分別為95.8 %、91.3 %、90.6 %和91.3%；江南大學(xué)[11]研究了反相離子對(duì)色譜法測(cè)定市售普通啤酒中4 種嘌呤的方法，方法的精密度為1.41 %～2.42 %，4 種嘌呤物質(zhì)的回收率為91.2%～100.3%。由于嘌呤屬弱堿性物質(zhì)，在液相色譜柱中的分離度差，僅依靠紫外檢測(cè)器的保留時(shí)間定性，會(huì)存在區(qū)分準(zhǔn)確度低的問(wèn)題。

本研究通過(guò)液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）檢測(cè)了6 種市售精釀啤酒中的鳥(niǎo)嘌呤、腺嘌呤、黃嘌呤和次黃嘌呤4 種嘌呤物質(zhì)的含量。在探究樣品前處理?xiàng)l件的基礎(chǔ)上，通過(guò)實(shí)驗(yàn)篩選適用于精釀啤酒嘌呤檢測(cè)的流動(dòng)相種類(lèi)、pH 值等色譜檢測(cè)條件，建立HPLC-MS/MS 測(cè)定精釀啤酒中嘌呤類(lèi)物質(zhì)含量的方法，為開(kāi)發(fā)低嘌呤精釀啤酒提供可靠的檢測(cè)方法和研究思路，以指導(dǎo)痛風(fēng)病人的健康膳食，同時(shí)為食品安全生產(chǎn)提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

酒樣：6款精釀啤酒樣品（市售）。

試劑及耗材：腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞98.0%），中國(guó)藥品生物制品檢定所；甲醇（色譜純），美國(guó)Honeywell公司；甲酸、三氟乙酸、高氯酸、磷酸、鹽酸、硫酸（色譜純），阿拉丁試劑（上海）有限公司；試驗(yàn)用水為超純水。

儀器設(shè)備：Agilent 1290 6460A 超高效液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀，美國(guó)Agilent 公司；Milli-Q超純水機(jī)，美國(guó)Millipore公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 嘌呤標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

將適量的腺嘌呤、黃嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤和次黃嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品，分別置于刻度試管中，超聲溶解，制備濃度約1000 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，在4 ℃下保存。取適量的4 種標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液按5 μg/L、10 μg/L、50 μg/L、100 μg/L、250 μg/L、500 μg/L 的濃度梯度依次稀釋?zhuān)? ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 樣品中嘌呤酸法提取條件的優(yōu)化

將啤酒樣品進(jìn)行超聲脫氣，1.0 mL 樣品放入10 mL 帶塞子的試管中，加入適量的酸溶液，搖勻，置于一定溫度下，水解一段時(shí)間后取出，冷卻至室溫。將pH 值調(diào)整為中性，定容，過(guò)0.22 μm 濾膜，保存以進(jìn)行分析。

酸種類(lèi)的篩選：分別采用三氟乙酸與甲酸（1∶1）混合液、高氯酸、鹽酸、磷酸、硫酸5 種酸溶液對(duì)樣品進(jìn)行酸水解，水解結(jié)束后保存以分析嘌呤總含量。

嘌呤提取工藝的單因素試驗(yàn)：分別往樣品中加入3 mL、4 mL、5 mL、6 mL、7 mL 酸溶液，搖勻，分別置于80 ℃、85 ℃、90 ℃、95 ℃、100 ℃下，水解0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h，水解結(jié)束后保存以分析嘌呤總含量。

嘌呤提取工藝的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)：酸種類(lèi)及其最佳條件通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)確定后，以嘌呤總含量為響應(yīng)值，使用Box-Behnken 設(shè)計(jì)方法設(shè)計(jì)響應(yīng)面法，采用Design expert 8 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和回歸分析[12]。研究了酸處理?xiàng)l件對(duì)總嘌呤含量的影響，探索最佳工藝條件。

1.2.3 液相色譜條件優(yōu)化

將水解后的樣品，使用液相色譜儀進(jìn)行分離。采用Shim-pack GIST C18（2.1 mm×100 mm，2.0 μm）[13]色譜柱。在該色譜柱上，考察流動(dòng)相種類(lèi)（甲醇-含0.1 %甲酸和0.5 mmol/L 乙酸銨水溶液、甲醇-0.5 mmol/L 乙酸銨水溶液、甲醇-水）和pH 值（3.2、3.4、3.6、3.8、4.0、4.2）對(duì)分離效果的影響，流速0.4 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量20 μL。

1.2.4 質(zhì)譜條件[14]

離子源：電噴霧離子源（ESI）。掃描模式：正離子模式。檢測(cè)模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）。離子源參數(shù)：霧化器流量3.0 L/min，加熱器流量10.0 L/min，接口溫度300 ℃，脫溶劑溫度250 ℃，DL 溫度250 ℃，加熱塊溫度400 ℃，干燥器流量10 L/min。

1.2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

測(cè)試嘌呤標(biāo)準(zhǔn)溶液，用峰面積(Y)和樣品濃度(X)進(jìn)行線性回歸。將4 種嘌呤標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋到不同濃度，上機(jī)檢測(cè)，以相應(yīng)濃度為3 倍信噪比(S/N)的檢測(cè)限(LOD)。根據(jù)所建立的方法，以10 μL 的注射量，將相同的混合標(biāo)準(zhǔn)劑連續(xù)注射6 次，測(cè)定方法的精密度(RSD)。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

采用IBM SPSS Statistics 2.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析以及最小顯著差數(shù)法統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性分析（P＜0.05），，采用Origin8.5繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸種類(lèi)的選擇

本研究分別考察了精釀啤酒經(jīng)過(guò)三氟乙酸與甲酸（1∶1）混合液、高氯酸、鹽酸、磷酸、硫酸5 種酸溶液處理后的總嘌呤含量。如圖1 所示，采用三氟乙酸與甲酸（1∶1）混合液處理后，總嘌呤的含量高于其他4 種酸溶液，這說(shuō)明經(jīng)過(guò)三氟乙酸與甲酸（1∶1）混合液水解后，樣品中嘌呤損失小，與林欽恒研究結(jié)果一致[15]。研究表明[16]，高濃度的高氯酸會(huì)降解嘌呤，磷酸只能提取鳥(niǎo)嘌呤和腺嘌呤，鹽酸處理會(huì)對(duì)嘌呤造成損傷。因此，采用三氟乙酸與甲酸（1∶1）混合液作為精釀啤酒的酸處理溶液。

圖1 酸的種類(lèi)對(duì)總嘌呤含量的影響

2.2 嘌呤提取工藝的單因素實(shí)驗(yàn)

選擇三氟乙酸與甲酸（1∶1）混合液對(duì)啤酒中的總嘌呤類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行提取。嘌呤水解時(shí)具有不穩(wěn)定性，為了使其既能被充分水解而又不會(huì)被水解過(guò)度，需要對(duì)水解條件進(jìn)行優(yōu)化。研究表明[17]，酸的用量、水解時(shí)間和水解溫度對(duì)嘌呤提取有顯著影響。如圖2A 所示，總嘌呤含量隨著料液比的增加而增加，在1∶5 時(shí)達(dá)到最高，然后趨于穩(wěn)定，因此，添加的酸的量是樣品體積的5 倍。水解時(shí)間對(duì)總嘌呤含量的影響如圖2B 所示，隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)，樣品中總嘌呤含量先升高后降低，這可能是由于水解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)嘌呤過(guò)度水解，導(dǎo)致總含量降低。當(dāng)水解時(shí)間為1 h 時(shí)總嘌呤含量最高，因此精釀啤酒的水解時(shí)間選擇為1 h。水解溫度對(duì)總嘌呤含量的影響如圖2C 所示，樣品中總嘌呤含量隨著水解溫度的增加而升高，并于95 ℃時(shí)達(dá)到最高，之后略有下降，可能是由于一些嘌呤堿在高溫下會(huì)被破壞。

圖2 水解條件對(duì)總嘌呤含量的影響

2.3 嘌呤提取工藝的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取A-料液比為1∶5、B-水解溫度95 ℃、C-水解時(shí)間為1 h，采用Box-Behnken 設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，對(duì)各因素水平進(jìn)行編碼，并以Y-總嘌呤含量作為響應(yīng)值。設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素及水平見(jiàn)表1，結(jié)果見(jiàn)表2。采用Design-Expert 8 軟件對(duì)表2 中的數(shù)據(jù)進(jìn)行極性多元回歸擬合，得到以總嘌呤含量為響應(yīng)值的二次回歸方程模型：

表1 Box-Behnken設(shè)計(jì)的因素和水平

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

Y-總嘌呤=95.77+10.59*A+1.46*B+7.27*C+0.53*A*C+1.42*B*C-23.67*A2-2.93*B2-13.81*C2+2.86*A2*B-1.09*A*B2-5.13*A*C2

回歸方程的方差分析如表3 所示，相關(guān)系數(shù)R2為0.9112，說(shuō)明嘌呤總含量的二次回歸方程與實(shí)驗(yàn)結(jié)果吻合較好；模型的P 值（＜0.0001）遠(yuǎn)小于0.01，說(shuō)明響應(yīng)回歸模型已經(jīng)達(dá)到了極顯著的水平；失擬項(xiàng)P=0.0694＞0.05，差異不顯著，說(shuō)明方程擬合良好，實(shí)驗(yàn)誤差較??；該模型的校正系數(shù)R2為0.9975，表明方程擬合程度較好；模型的修正系數(shù)RAdj2=0.9906 表明該模型可以很好地反映總嘌呤含量的關(guān)系。

表3 以總嘌呤含量為響應(yīng)值的回歸方程方差分析表

在該模型中，A-料液比、B-水解溫度和C-水解時(shí)間極顯著影響總嘌呤含量（P＜0.01）；二次項(xiàng)A2、B2和C2極顯著影響總嘌呤含量（P＜0.01）；AB顯著影響總嘌呤含量（P＜0.05），AC 和BC 對(duì)總嘌呤含量的影響不顯著（P＞0.05）。各因素對(duì)總嘌呤含量的影響顯著情況：A-料液比＞C-水解時(shí)間＞B-水解溫度。

圖3 為由Design Expert 8 軟件繪制的三組因素交互作用的響應(yīng)面曲面和等高線。響應(yīng)面圖越陡，兩個(gè)因素對(duì)響應(yīng)值的交互作用就越明顯，反之不明顯。從圖3 中可以看出，交互項(xiàng)中A-料液比和B-水解溫度引起總嘌呤含量變化幅度較大，表明二者交互作用對(duì)總嘌呤含量影響顯著；A-料液比和C-水解時(shí)間、B-水解溫度和C-水解時(shí)間的交互作用引起總嘌呤含量變化幅度較小，表明二者交互作用對(duì)總嘌呤含量影響不顯著。根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果，得到酸水解的最佳條件為料液比1∶5.22(v/v)、溫度89.04 ℃、水解時(shí)間1.2 h。在此條件下，總嘌呤含量最大值為97.64 μg/L，優(yōu)化后的總嘌呤含量為96.77 μg/L，與模型預(yù)測(cè)值接近，較優(yōu)化前提高了近12%，說(shuō)明回歸方程能準(zhǔn)確反映各因素對(duì)嘌呤總含量的影響。

圖3 三因素交互作用對(duì)總嘌呤含量影響的響應(yīng)面結(jié)果圖

2.4 色譜條件的優(yōu)化

采用高效液相色譜法（HPLC）分離了混標(biāo)中的4 個(gè)嘌呤，本研究探索了不同流動(dòng)相類(lèi)型和流動(dòng)相的pH 值對(duì)分離效應(yīng)的影響。如表4 所示，在不同種類(lèi)的流動(dòng)相條件下，混標(biāo)經(jīng)過(guò)色譜柱后，從左到右依次為腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤。與甲醇-水流動(dòng)相體系相比，腺嘌呤和鳥(niǎo)嘌呤在甲醇-0.1 %甲酸、0.5 mM 乙酸銨和甲醇-0.5 mM 乙酸鈉流動(dòng)相體系中的保留時(shí)間相對(duì)接近，難以完全分離。甲醇可以調(diào)節(jié)體系的極性，改變嘌呤與流動(dòng)相的結(jié)合能力，破壞嘌呤物質(zhì)和配體基團(tuán)的親和力，增加流動(dòng)相的洗脫強(qiáng)度，從而提高分離精度[18]。

表4 不同流動(dòng)相種類(lèi)下4種嘌呤的保留時(shí)間 (min)

嘌呤屬于生物堿，均具有弱堿性，流動(dòng)相的pH值對(duì)4 種嘌呤的分離效果影響較大。如表5 所示，采用甲醇-水作為流動(dòng)相，分別在pH 值為3.4、3.6、3.8、4.0、4.2的條件下考察4種嘌呤的分離效果。當(dāng)pH4.0 時(shí)，分離效果較佳，因此，選擇pH4.0 作為色譜分離條件。

表5 不同pH下的嘌呤保留時(shí)間 (min)

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線

將配制好的4 種嘌呤的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液在優(yōu)化后的色譜條件下依次進(jìn)樣，在正離子檢測(cè)模式下進(jìn)行電離和一級(jí)質(zhì)譜掃描，得到不同濃度的混標(biāo)溶液總離子流圖，見(jiàn)圖4。4 種嘌呤分離度良好，響應(yīng)靈敏，出峰順序和保留時(shí)間分別為腺嘌呤0.852 min、鳥(niǎo)嘌呤0.969 min、次黃嘌呤1.334 min、黃嘌呤1.598 min。以標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度（X，μg/L）作為橫坐標(biāo)，定量離子峰的面積（Y）作為縱坐標(biāo)，通過(guò)線性回歸分析得出回歸方程。如表6 所示，4 種嘌呤的線性回歸方程的相關(guān)系數(shù)均在0.9998 以上，具有良好的相關(guān)性；檢出限為0.08～1.5 μg/L，相比于目前常用的高效液相色譜法[19]，檢測(cè)靈敏度得到了提高。

表6 4種嘌呤的標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合情況

圖4 不同濃度的嘌呤混標(biāo)總離子流圖

圖5 市售精釀啤酒中嘌呤總離子流圖

2.7 加標(biāo)回收率與精密度

隨機(jī)選擇一種精釀啤酒進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，在測(cè)得樣品本底值的基礎(chǔ)上，加入相對(duì)本底值20%～100%濃度的嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品，平行測(cè)定6 次，通過(guò)IBM SPSS Statistics 2.0 計(jì)算平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（δRSD）。如表7 所示，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（δRSD）在0.9 %～2.4 %之間。次黃嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、腺嘌呤、黃嘌呤的加標(biāo)回收率分別為95.38 %、87.64%、79.54%、87.50%，優(yōu)化后的方法準(zhǔn)確度符合一般檢測(cè)的要求[20]。

表7 樣品的加標(biāo)回收率和精密度

2.8 樣品含量的檢測(cè)

采用優(yōu)化后的HPLC-MS/MS 方法對(duì)6 種市售精釀啤酒進(jìn)行4 種嘌呤含量的測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表8。6種市售精釀啤酒中的鳥(niǎo)嘌呤含量最高，為1.78～3.21 mg/L，次黃嘌呤為0.42～1.05 mg/L，腺嘌呤為1.01～1.50 mg/L，黃嘌呤為0.38～1.35 mg/L，總嘌呤含量均為3.57～5.68 mg/L。相比較普通啤酒的40～136 mg/L 的總嘌呤含量[21]，精釀啤酒屬于低嘌呤飲料，更加安全可靠，適合中老年人飲用。

表8 市售精釀啤酒中嘌呤含量 (mg/L)

3 結(jié)論

本研究建立了HPLC-MS/MS 法同時(shí)檢測(cè)精釀啤酒中4 種嘌呤含量的方法，經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，本方法完全適用于精釀啤酒中4 種嘌呤含量的測(cè)定。通過(guò)單因素和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了嘌呤酸水解條件，研究發(fā)現(xiàn)采用三氟乙酸與甲酸(1∶1)的混合物水解樣品，料液比為1∶5.22(v/v)，溫度為89.04 ℃，水解時(shí)長(zhǎng)為1.2 h時(shí)，精釀啤酒總嘌呤含量最高。在pH4的甲醇-水流動(dòng)相體系中，4 種嘌呤的分離效果最好，HPLC-MS/MS 法同時(shí)測(cè)定精釀啤酒中次黃嘌呤、腺嘌呤、黃嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤4 種嘌呤含量最精確。該方法加標(biāo)回收率大于80 %，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（δRSD）在0.9 %～2.4 %之間。相較HPLC 法，HPLC-MS/MS 操作方便、準(zhǔn)確度和精密度高，并且可以一次性檢測(cè)全部嘌呤類(lèi)物質(zhì)，是分析精釀啤酒中嘌呤類(lèi)物質(zhì)的理想方法。

隨著人們生活質(zhì)量的提高，研究安全穩(wěn)定的低嘌呤食品符合當(dāng)下綠色飲食的發(fā)展方向，快速、靈敏的嘌呤檢測(cè)方法可為大眾健康飲食提供科學(xué)依據(jù)。采用HPLC-MS/MS 法對(duì)6 種市售精釀啤酒中4 種嘌呤含量進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)市售精釀啤酒中的總嘌呤含量均為3.57～5.68 mg/L，相比較普通啤酒的40～100 mg/L 的總嘌呤含量，精釀啤酒更加安全可靠，適合中老年人飲用。