馮倩倩，王 也，王曉偉，徐晶晶，史艷芬，黃崎鑫，鐘定榮*

（1.中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院研究生院，北京 100006；2.中日友好醫(yī)院病理科，北京 100029；3.中日友好醫(yī)院心臟科，北京 100029）

甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是甲狀腺癌最常見的病理類型，約占甲狀腺癌的70%～80%。雖然PTC 預后較好且相對惡性度低，但仍有約30%發(fā)生局部復發(fā)，5%發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移[1]。一些研究推薦，對于存在PTC 復發(fā)風險因素（如腫瘤較大、甲狀腺外侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、較小年齡和男性）的患者，應進行遠處轉(zhuǎn)移的篩查[2]。但許多沒有臨床復發(fā)風險特征的病例也可能出現(xiàn)局部復發(fā)或遠處轉(zhuǎn)移，因此尋找新的預測遠處轉(zhuǎn)移的指標具有重要意義。本研究中，我們比較了2 種生物標志物Cyclin D1、Ki-67 以及5種分子標志物在PTC遠處轉(zhuǎn)移與未轉(zhuǎn)移組織中的表達，以探討它們預測PTC遠處轉(zhuǎn)移的臨床價值。

1 資料與方法

1.1 病例選擇

收集中日友好醫(yī)院2015年9月—2022年12月手術(shù)切除或局部病灶穿刺獲得的確診為轉(zhuǎn)移性PTC 的病例共18 例，發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的原發(fā)病灶直徑≥2cm；12 例來自肺，4 例來自骨，1 例來自腦，1例來自縱隔。其中男8 例，女10 例；年齡26～82歲，平均57.1±16.0 歲。對照組為中日友好醫(yī)院同期行甲狀腺切除術(shù)、確診為PTC 未發(fā)生轉(zhuǎn)移的病例25例，病灶直徑≥2cm。其中男9例，女16例；年齡20～66 歲，平均45.7±13.7 歲。所有病例的病理診斷均由2 位病理醫(yī)生進行獨立診斷。本研究獲中日友好醫(yī)院臨床研究倫理委員會批準（2023-KY-004）。

1.2 免疫組織化學檢測

1.2.1 試劑、儀器及操作步驟

Cyclin D1抗體購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，Ki-67抗體購自北京中杉金橋公司。第二抗體使用全自動免疫組織化學染色儀配套試劑盒，購自德國Leica公司。儀器應用Leica全自動免疫組組織化學儀染色。操作步驟按說明書進行。

1.2.2 判斷標準

Cyclin D1 抗體的計分方法，在清晰背景下，出現(xiàn)黃色、棕色或褐色顆粒的細胞核染色視為陽性反應。我們根據(jù)陽性細胞百分比評定著色細胞的比例：無著色細胞得0 分，≤25%得1 分，26%～50%得2 分，51%～75%得3 分，＞75%得4 分。根據(jù)陽性細胞的著色特征評定染色強度：無著色得0分，淡黃色得1分，棕黃色得2分，棕褐色得3分。將染色強度與著色細胞比例的得分相加，總分＜5分定義為低表達組，≥5分定義為高表達組。

Ki67 按照陽性細胞百分比計分：著色細胞比例在0～3%，定義為低表達組；著色細胞比例≥3%，定義為高表達組。

1.3 分子檢測

1.3.1 主要試劑及儀器

每例選取樣本中腫瘤占比＞30%的蠟塊，連續(xù)切5～8 個10μm 蠟卷，直接封存于EP 管中行基因檢測。核酸提取試劑盒、人類KRAS/NRAS/BRAF基因及TERT/HRAS基因突變聯(lián)合檢測試劑盒，均購自廈門艾德生物醫(yī)藥科技股份有限公司，儀器應用ABI7500實時熒光定量PCR儀。

1.3.2 擴增程序及結(jié)果判讀

第一階段：95℃5min 1 個循環(huán)；第二階段：95℃25s，64℃20s，72℃20s，15 個循環(huán)；第三階段：93℃25s，60℃35s，72℃20s，31 個循環(huán)。信號收集：第三階段60℃時收集FAM 和HEX 信號，執(zhí)行實時PCR，保存文件。結(jié)果判讀參照說明書判讀標準。

1.4 統(tǒng)計學方法

應用SPSS22.0 進行數(shù)據(jù)處理，計數(shù)資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗，通過χ2值計算列聯(lián)系數(shù)進行相關(guān)性分析，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Cyclin D1 及Ki-67 在PTC 遠處轉(zhuǎn)移組和對照組的表達

Cyclin D1 及Ki-67 陽性染色均主要定位于細胞核（圖1～4，見封二）。表1 示，PTC 遠處轉(zhuǎn)移組和對照組中Cyclin D1高表達率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；2 組中Ki-67 高表達率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表1 PTC遠處轉(zhuǎn)移組和對照組Cyclin D1、Ki-67表達及相關(guān)基因突變情況n（%）

圖1 Cyclin D1 在甲狀腺乳頭狀癌遠處轉(zhuǎn)移組中高表達（EnVision 法，×400）。

圖2 Cyclin D1 在對照組中低表達（EnVision法，×400）。

圖3 Ki-67在甲狀腺乳頭狀癌遠處轉(zhuǎn)移組中高表達（EnVision法，×400）。

圖4 Ki-67在對照組中低表達（EnVision法，×400）。

2.2 5 基因（KRAS、NRAS、BRAF、TERT 和HRAS）在PTC遠處轉(zhuǎn)移組和對照組中的檢測結(jié)果

遠處轉(zhuǎn)移組患者中檢測到5 項甲狀腺癌相關(guān)基因突變15例次（圖5～7），其中BRAF V600E突變率55.6%（10/18），TERT突變率22.2%（4/18），NRAS突變率5.6%（1/18）；BRAF V600E和TERT啟動子共突變3 例，BRAF V600E、TERT 和NRAS 3 種基因同時突變1 例。TERT 及NRAS 突變均伴隨BRAF V600E突變，未檢測到KRAS、HRAS突變。

圖5～7 甲狀腺乳頭狀癌遠處轉(zhuǎn)移病例的基因突變擴增曲線

對照組25例患者中檢測到5項甲狀腺癌相關(guān)基因突變15例次，均為BRAF V600E基因突變，突變率60%，未檢測到KRAS、NRAS、TERT 和HRAS基因突變。表1 示，PTC 遠處轉(zhuǎn)移組TERT突變率22.2%（4/18）明顯高于對照組（0%），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；BRAF V600E 和NRAS 突變率在2組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.3 PTC 遠處轉(zhuǎn)移病例Cyclin D1、Ki-67 表達與臨床特征及基因突變的關(guān)系

表2 示，PTC 遠處轉(zhuǎn)移組病例的BRAF V600E、TERT基因突變與Cyclin D1和Ki-67表達強度之間并無相關(guān)性（P＞0.05）。其臨床特征（性別、年齡）與Cyclin D1 和Ki-67 表達強度之間也無相關(guān)性（P＞0.05）。

表2 Cyclin D1、Ki-67表達與PTC遠處轉(zhuǎn)移病例臨床特征及BRAF V600E、TERT突變的關(guān)系n（%）

3 討論

3.1 Cyclin D1蛋白表達與PTC遠處轉(zhuǎn)移的關(guān)系

Motokura 等人[3]在甲狀旁腺腺瘤中首次發(fā)現(xiàn)了Cyclin D1 基因。該基因位于11q13 位置，全長120kb，有5 個外顯子和4 個內(nèi)含子組成，編碼295個氨基酸殘基。進一步研究發(fā)現(xiàn)，Cyclin D1蛋白的過度表達可以推動細胞從G1 期進入S 期，引起細胞增殖，導致腫瘤的發(fā)生[4]。已有研究發(fā)現(xiàn)Cyclin D1 蛋白在PTC 中的表達明顯高于結(jié)節(jié)性甲狀腺腫，且與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)[5]，這表明Cyclin D1 的高表達在PTC 的轉(zhuǎn)移和侵襲過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。Lee 等[6]在PTC 中發(fā)現(xiàn)Cyclin D1 過度表達與腫瘤侵襲性、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和細胞增殖密切相關(guān)；有研究[7]發(fā)現(xiàn)Cyclin D1 在PTC 中均有表達，但在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTC 患者中強陽性率為56.2%，在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTC 患者中強陽性率為25.0%。本研究中Cyclin D1 在PTC 遠處轉(zhuǎn)移組病例中以高表達為主，對照組中以低表達為主，2 組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），與以往的研究結(jié)果基本一致。因此，我們推斷Cyclin D1 高表達與PTC 遠處轉(zhuǎn)移的關(guān)系十分密切，臨床上可以通過檢測Cyclin D1 的蛋白表達，來預測PTC 是否更易發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移、是否具有更高的侵襲性。

3.2 Ki-67蛋白表達與PTC遠處轉(zhuǎn)移的關(guān)系

Ki-67 作為一種重要的免疫組織化學標記物，其功能與有絲分裂密切相關(guān)，在細胞增殖中不可缺少，可以識別出G0期以外的G1、S、G2和M期的細胞，經(jīng)常用于評估不同實體瘤發(fā)展過程中的細胞增殖指數(shù)[8]。Ki-67 的高表達與多種癌癥的侵襲性增加有關(guān)[9]。諸多文獻闡明Ki-67 的高表達與乳腺癌和前列腺癌的預后不良有關(guān)[10，11]。然而，目前對Ki-67 的高表達與甲狀腺癌之間的關(guān)系還沒有達成共識。Pan 和Guadagno 等[12，13]分別進行薈萃分析，他們發(fā)現(xiàn)Ki-67 高表達與患者年齡、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、甲狀腺外侵犯和TNM 分期顯著相關(guān)。此外，他們還證實，與Ki-67 低表達的患者相比，Ki-67 高表達的患者無病生存期更短，死亡風險更高。Pan 等[14]結(jié)合15項研究的數(shù)據(jù)總結(jié)Ki-67 的表達水平在大腫瘤（＞4cm）中高于小腫瘤（＜4cm）（合并OR=1.86）；Ki-67 的表達水平在陰性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組低于陽性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（合并OR=2.49）。本研究發(fā)現(xiàn)Ki-67在PTC 遠處轉(zhuǎn)移組的表達高于PTC 未轉(zhuǎn)移組，2組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），與上述研究結(jié)果基本一致?？赡苁怯捎贙i-67 是與細胞增殖相關(guān)的核抗原，因此Ki-67 高表達可能代表PTC細胞增殖快、惡性度高、侵襲性更強。

3.3 基因突變與PTC遠處轉(zhuǎn)移的關(guān)系

BRAF V600E 和TERT 啟動子突變，已被證實與PTC的侵襲性及不良預后有關(guān)[15]。Yang等[16]研究發(fā)現(xiàn)，BRAF V600E 和TERT 啟動子突變共存與年齡、腫瘤大小、是否甲狀腺腺外侵犯、T 分期、AJCC 分期及腫瘤復發(fā)/遠處轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)（P＜0.05）。在我們的18 例PTC 遠處轉(zhuǎn)移病例中，有3例檢測到了BRAF V600E 和TERT 啟動子共突變，1 例檢測到BRAF V600E、TERT 和NRAS 3 種基因同時突變。在對照組中沒有檢測到TERT 啟動子突變，這與以往的研究結(jié)果相符，進一步提示，當PTC 患者檢測出BRAF V600E 和TERT 啟動子共突變時，可能預示著更高的侵襲性和更易發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移。另有研究顯示，Cyclin D1的表達強度在BRAF V600E 突變組中更強，呈現(xiàn)正相關(guān)[17]。我們的研究中沒有發(fā)現(xiàn)Cyclin D1 表達與BRAF V600E 和TERT 啟動子突變的相關(guān)性，可能與樣本量較少有關(guān)。

綜上所述，Cyclin D1、Ki67 的表達以及甲狀腺癌5 項基因的突變在PTC 發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移及未發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移患者中存在明顯的差異，這些指標對預測PTC患者是否發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移有重要意義。