楊小春，呂建，孫景毅，汪文月，王媛媛

（1.河北港口集團(tuán)有限公司港口醫(yī)院消化科，河北 秦皇島 066000；2.河北港口集團(tuán)有限公司港口醫(yī)院消化內(nèi)鏡中心，河北 秦皇島 066000；3.河北省滄州市中心醫(yī)院腎病血液凈化科，河北 秦皇島 061000；4.河北港口集團(tuán)有限公司港口醫(yī)院心內(nèi)科，河北 秦皇島 066000；5.北京大學(xué)第三醫(yī)院秦皇島醫(yī)院消化科，河北 秦皇島 066000）

肢體缺血再灌注不僅會引起局部缺血組織損傷，而且也容易導(dǎo)致遠(yuǎn)隔器官組織損傷，其中肝臟是易受累器官之一[1]。肢體缺血再灌注引起的遠(yuǎn)隔組織器官損傷的機(jī)制十分復(fù)雜，目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為氧化應(yīng)激與其具有密切關(guān)系[2]。臨床研究表明，布托啡諾可通過抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)有效減輕下肢骨科手術(shù)患者使用止血帶所造成的缺血再灌注損傷[3]。銀杏葉提取物注射液降低肢體缺血再灌注損傷患者氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而改善缺血再灌注引起的肺損傷[4]。熊果酸，又名烏索酸，烏蘇酸，是存在于多種天然植物中的一種五環(huán)三萜類化合物，在心肌、肝臟等組織器官缺血再灌注損傷中的作用多有報道[5-6]。然而，熊果酸是否在肢體缺血再灌注引起的遠(yuǎn)端器官損傷中發(fā)揮作用鮮有報道。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase pathway，MAPK）信號通路是重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，與多種生理病理過程有關(guān)，研究表明，重組人腦利鈉肽通過抑制p38 MAPK 通路降低氧化應(yīng)激反應(yīng)，具有減輕心肌缺血再灌注損傷的作用[7]。此外，熊果酸通過抑制p38 MAPK 信號通路可抑制Huh-7 細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[8]。因此，本研究探討熊果酸是否能通過調(diào)節(jié)p38 MAPK信號通路降低氧化應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞凋亡，從而保護(hù)肢體缺血再灌注引起的肝損傷。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

健康清潔級雄性SD 大鼠50 只，8 周齡，體質(zhì)量180~200 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2021-0011。飼養(yǎng)期間大鼠自由飲食飲水，室內(nèi)溫度（22±2）℃，空氣濕度50%~60%，12 h明暗交替。該研究經(jīng)本院實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會審批（2021111501）。

1.2 試劑和儀器

熊果酸（質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98%）購自上海源葉生物科技有限公司（批號：B21403）；MAPK 信號通路激活劑茴香霉素（anisomycin）購自上海碧云天生物科技有限公司（批號：SC0132）；HE 染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司（批號：G1120）；TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所（批號：G002-1-2）；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）以及乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒購自上海原鑫生物科技有限公司（批號：YX-SH-A0093、YX-SHCA092、YX-SH-A0144）；超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）和丙二醛（MDA）試劑盒購自上?？瓢┥锟萍加邢薰荆ㄅ枺篊B10431-Hu、CB10643-Hu、CB10401-Hu）；兔抗鼠p-p38 MAPK、p38 MAPK、p-ERK、ERK 抗體購自美國Abcam公司（批號：ab211061、ab308333、ab192591、ab32537）；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔二抗購自美國ThermoFisher 公司（批號：31470）；AS-800 全自動生化分析儀購自南京頤蘭貝生物科技有限公司；1704150 型蛋白轉(zhuǎn)膜裝置購自美國Bio-Rad 公司；BX51 型光學(xué)顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.3 模型制備與分組給藥

將50 只雄性大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對照組、模型組、熊果酸組、激活劑組和熊果酸+激活劑組，每組10 只。熊果酸組大鼠于造模前一周開始灌胃80 mg/kg[9]熊果酸混懸液（生理鹽水配制），1次/d，連續(xù)7 d；激活劑組大鼠于造模前一周腹腔注射anisomycin 2 mg/kg[10]，1 次/2 d，共注射3 次；熊果酸+激活劑組大鼠80 mg/kg 熊果酸混懸液灌胃，1 次/d，連續(xù)7 d，同時腹腔注射anisomycin 2 mg/kg，1次/2 d，共注射3次；模型組和正常對照組大鼠分別灌胃等容量的生理鹽水。于末次給藥2 h 后，建立肢體缺血再灌注肝損傷模型。除正常對照組外，其余組大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉，固定于鼠板上，雙側(cè)后肢脫毛，根部環(huán)扎橡皮筋夾閉，阻斷血流4 h，當(dāng)觀察到大鼠趾掌處顏色變蒼白，且皮溫發(fā)涼時模型制備成功[11]，之后松開橡皮筋持續(xù)灌注血流4 h，正常對照組大鼠僅在雙后肢根部掛繞橡皮筋，不阻斷血流。

1.4 ELISA法檢測肝損傷指標(biāo)

再灌注完成后，頸椎脫臼法將大鼠處死，取腹腔靜脈血5 mL于抗凝管中，3 000 r/min離心10 min，取上清液為待測樣品。嚴(yán)格按照ELISA 試劑盒說明書進(jìn)行操作，計算ALT、AST和LDH含量。

1.5 氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測

采血完成后，冰上迅速剝離大鼠肝組織，取適量組織置于EP 管中，加生理鹽水，剪碎，勻漿，3 000 r/min 離心10 min，取上清液，嚴(yán)格按照試劑盒說明書測定組織中SOD、MDA和GSH-Px活性。

1.6 肝組織HE染色

取部分肝組織，置于4%（φ）多聚甲醛中固定，脫水，包埋，切片，二甲苯透明，梯度乙醇脫水，伊紅染液染色，蘇木素染液染色，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察肝組織病理學(xué)變化。

1.7 肝組織TUNEL染色

取石蠟切片，蛋白激酶K 工作液37 ℃孵育30 min，3%過氧化氫室溫孵育10 min，TdT 酶反應(yīng)液37 ℃避光孵育60 min，HRP 標(biāo)記的鏈霉親和素37 ℃避光孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，顯微鏡下觀察陽性細(xì)胞數(shù)，呈棕黃色顯示的即為陽性細(xì)胞，計算細(xì)胞凋亡率=陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.8 蛋白印跡法檢測MAPK信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)

取適量肝組織，液氮中研磨，加裂解液裂解，4 ℃12 000 r/min 離心10 min，取上清液，BCA 法測定蛋白濃度。取50 μg 蛋白電泳分離，將分離后的蛋白濕轉(zhuǎn)到PVDF 膜上，p-p38 MAPK、p38 MAPK、p-ERK 和ERK 抗體（1∶1 000）4 ℃孵育過夜，二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h，ECL法顯色，Image J分析條帶灰度值，計算目的蛋白相對表達(dá)量。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS26.0軟件分析數(shù)據(jù)，所有數(shù)據(jù)以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝臟損傷指標(biāo)檢測結(jié)果

與正常對照組比較，模型組血漿中ALT、AST和LDH 含量升高（P<0.05）；與模型組比較，熊果酸組血漿中ALT、AST 和LDH 含量降低，而激活劑組血漿中ALT、AST 和LDH 含量升高（P<0.05）；與熊果酸組比較，熊果酸+激活劑組血漿中ALT、AST 和LDH含量升高（P<0.05）；與激活劑組比較，熊果酸+激活劑組血漿中ALT、AST 和LDH 含量降低（P<0.05）。見表1。

表1 各組大鼠血漿中ALT、AST和LDH含量比較Table 1 Comparison of the contents of ALT,AST and LDH in plasma of rats in each group(,n=10)

表1 各組大鼠血漿中ALT、AST和LDH含量比較Table 1 Comparison of the contents of ALT,AST and LDH in plasma of rats in each group(,n=10)

與正常對照組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05；與熊果酸組比較：?P<0.05；與激活劑組比較：▲P<0.05。

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2.2 肝臟氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測結(jié)果

與正常對照組比較，模型組肝組織的SOD 和GSH-Px 活性降低，MDA 含量升高（P<0.05）；與模型組比較，熊果酸組肝組織的SOD 和GSH-Px 活性升高，MDA 含量降低，而激活劑組肝組織的SOD 和GSH-Px 活性降低，MDA 含量升高（P<0.05）；與熊果酸組比較，熊果酸+激活劑組肝組織的SOD 和GSH-Px 活性降低，MDA 含量升高（P<0.05）；與激活劑組比較，熊果酸+激活劑組肝組織的SOD 和GSH-Px 活性升高，MDA 含量降低（P<0.05）。見表2。

表2 各組大鼠肝組織中MAD含量和SOD、GSH-Px活性比較Table 2 Comparison of MAD content and SOD and GSH-Px activities in liver tissue of rats in each group(,n=10)

表2 各組大鼠肝組織中MAD含量和SOD、GSH-Px活性比較Table 2 Comparison of MAD content and SOD and GSH-Px activities in liver tissue of rats in each group(,n=10)

與正常對照組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05；與熊果酸組比較：?P<0.05；與激活劑組比較：▲P<0.05。

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2.3 肝組織HE染色結(jié)果

正常對照組大鼠肝細(xì)胞形態(tài)大小正常；模型組和激活劑組大鼠部分區(qū)域肝細(xì)胞水腫、脂肪變性、片狀壞死，且伴有大量中性粒細(xì)胞浸潤，肝竇結(jié)構(gòu)消失；熊果酸組大鼠肝組織病理損傷減輕，肝細(xì)胞輕度水腫，無片狀壞死，少量中性粒細(xì)胞浸潤；熊果酸+激活劑組大鼠肝組織病理損傷程度較激活劑組減輕，但是較熊果酸組加重。見圖1。

圖1 肝組織HE染色（400×）Figure 1 HE staining of liver tissue

2.4 肝組織TUNEL染色結(jié)果

與正常對照組比較，模型組肝細(xì)胞凋亡率升高（P<0.05）；與模型組比較，熊果酸組肝細(xì)胞凋亡率降低，激活劑組肝細(xì)胞凋亡率升高（P<0.05）；與熊果酸組比較，熊果酸+激活劑組肝細(xì)胞凋亡率升高（P<0.05）；與激活劑組比較，熊果酸+激活劑組肝細(xì)胞凋亡率降低（P<0.05）。見表3、圖2。

圖2 肝組織TUNEL染色（400×）Figure 2 TUNEL staining of liver tissue（400×）

表3 各組大鼠肝組織細(xì)胞凋亡率比較Table 3 Comparison of apoptosis rate of liver tissue cells of rats in each group(,n=10)

表3 各組大鼠肝組織細(xì)胞凋亡率比較Table 3 Comparison of apoptosis rate of liver tissue cells of rats in each group(,n=10)

與正常對照組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05；與熊果酸組比較：?P<0.05；與激活劑組比較：▲P<0.05。

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2.5 蛋白印跡法檢測結(jié)果

與正常對照組比較，模型組肝組織中p-p38 MAPK 和p-ERK 蛋白表達(dá)水平升高（P<0.05）；與模型組比較，熊果酸組肝組織中p-p38 MAPK 和p-ERK 蛋白表達(dá)水平降低，激活劑組肝組織中p-p38 MAPK 和p-ERK 蛋白表達(dá)水平升高（P<0.05）；與熊果酸組比較，熊果酸+激活劑組肝組織中p-p38 MAPK 和p-ERK 蛋白表達(dá)水平升高（P<0.05）；與激活劑組比較，熊果酸+激活劑組肝組織中p-p38 MAPK 和p-ERK 蛋白表達(dá)水平降低（P<0.05）。見表4、圖3。

圖3 肝組織中蛋白表達(dá)電泳圖Figure 3 Electrophoretic image of protein expression in liver tissue

表4 各組大鼠肝組織中p-p38 MAPK、p38 MAPK、p-ERK和ERK蛋白表達(dá)水平比較Table 4 Comparison of p-p38 MAPK，p38 MAPK，p-ERK and ERK protein levels in liver tissues of rats in each group(,n=10)

表4 各組大鼠肝組織中p-p38 MAPK、p38 MAPK、p-ERK和ERK蛋白表達(dá)水平比較Table 4 Comparison of p-p38 MAPK，p38 MAPK，p-ERK and ERK protein levels in liver tissues of rats in each group(,n=10)

與正常對照組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05；與熊果酸組比較：?P<0.05；與激活劑組比較：▲P<0.05。

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3 討論

本研究通過橡皮帶環(huán)繞結(jié)扎大鼠雙后肢建立肢體缺血再灌注肝損傷模型，肝組織病理染色結(jié)果顯示：模型組大鼠部分區(qū)域肝細(xì)胞水腫、脂肪變性、片狀壞死，且伴有大量中性粒細(xì)胞浸潤，肝竇結(jié)構(gòu)消失，熊果酸組大鼠肝組織病理損傷減輕，肝細(xì)胞輕度水腫，輕度片狀壞死，少量中性粒細(xì)胞浸潤；且模型組大鼠肝損傷指標(biāo)血漿中ALT、AST和LDH 水平均高于正常對照組，熊果酸組大鼠各指標(biāo)則低于模型組，說明肢體缺血再灌注可引起大鼠肝損傷，而熊果酸對肝臟具有一定保護(hù)作用。而Xu 等[12]的研究表明，熊果酸可減輕缺血再灌注引起的心肌損傷，發(fā)揮心肌保護(hù)作用。為進(jìn)一步探討熊果酸發(fā)揮肝臟保護(hù)作用的具體機(jī)制，本研究給予肢體缺血再灌注大鼠MAPK 信號通路激活劑，結(jié)果顯示：激活劑組大鼠肝臟病理損傷較模型組加重，血漿ALT、AST 和LDH 水平較模型組升高；而與激活劑組比較，熊果酸+激活劑組大鼠肝組織病理損傷減輕，ALT、AST 和LDH 水平降低，說明激活MAPK 信號通路可加重肢體缺血再灌注大鼠肝損傷，而熊果酸可部分抵消激活劑的作用。

氧化應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞凋亡是造成組織器官再灌注損傷的主要機(jī)制之一。Mei 等[13]研究表明薯蕷皂苷通過SIRT1/Nrf2 信號通路抑制氧化應(yīng)激，減輕體內(nèi)外腦缺血再灌注損傷。Yu 等[14]研究發(fā)現(xiàn)miR-98-5 p 通過抗氧化應(yīng)激和抗凋亡減輕腦缺血再灌注損傷。本研究結(jié)果顯示：模型組大鼠肝細(xì)胞凋亡率較正常對照組升高，熊果酸組大鼠肝細(xì)胞凋亡率低于模型組；模型組抗氧化指標(biāo)肝組織SOD 和GSHPx 活性較正常對照組降低，氧化指標(biāo)肝組織MDA含量較正常對照組升高，而熊果酸組肝組織SOD 和GSH-Px 活性較模型組升高，MDA 含量較模型組降低，說明熊果酸可降低肢體缺血再灌注引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)，抑制肝細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果與Di等[15]報道的熊果酸可降低氧化應(yīng)激反應(yīng)，改善順鉑造成的聽力功能障礙的結(jié)果一致。本研究中激活劑組肝細(xì)胞凋亡率較模型組升高，肝組織SOD 和GSH-Px活性較模型組降低，肝組織MDA 含量較模型組升高，說明激活MAPK 信號通路促進(jìn)肝臟氧化應(yīng)激反應(yīng)和肝細(xì)胞凋亡；與激活劑組比較，熊果酸+激活劑組肝細(xì)胞凋亡率降低，肝組織SOD 和GSH-Px 活性升高，肝組織MDA 含量降低，說明熊果酸可拮抗激活劑對肢體缺血再灌注肝損傷大鼠氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用。

氧化應(yīng)激反應(yīng)涉及多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其中MAPK 信號通路在維持機(jī)體內(nèi)氧化-抗氧化動態(tài)平衡中發(fā)揮重要作用，p38 和ERK 是MAPK 家族中重要的2條通路。肢體缺血再灌注使遠(yuǎn)端器官受到缺血刺激，打破機(jī)體氧化-抗氧化平衡，組織能量代謝紊亂，抗氧化能力減弱，大量自由基產(chǎn)生并堆積，從而激活p38和ERK通路[16-17]。p38通路與炎癥、氧化應(yīng)激等反應(yīng)過程的調(diào)控密切相關(guān)，而ERK 通路主要與細(xì)胞分裂、生長和增殖有關(guān)[18-19]。本研究結(jié)果表明：模型組肝組織中p-p38 和p-ERK 蛋白表達(dá)升高，熊果酸可降低二者磷酸化水平；激活劑組肝組織中p-p38 和p-ERK 蛋白表達(dá)水平較模型組升高，熊果酸+激活劑組二者水平降低，說明熊果酸可部分拮抗激活劑對MAPK 信號通路的激活作用。

綜上所述，熊果酸對肢體缺血再灌注引起的肝損傷具有保護(hù)作用，其可能是通過抑制MAPK 信號通路降低氧化應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞凋亡發(fā)揮作用。本研究的不足之處是缺乏細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的佐證，此外對熊果酸發(fā)揮肝損傷保護(hù)作用的具體機(jī)制研究不夠深入，因此仍需要進(jìn)一步完善。