林慧琳,葉玲清,葉海梅,黃智瑜,陳偉偉,,鄭奎城,

單增李斯特菌(Listeriamonocytogenes,Lm)為革蘭陽性、兼性厭氧、G+C 含量低的無芽胞桿菌,是一種重要的人獸共患病原菌[1]。該菌廣泛存在于自然環(huán)境、各類食品中,對惡劣環(huán)境具有較強抵抗力,具有嗜冷、嗜鹽性,可污染食品加工、運輸、儲存等多個環(huán)節(jié)[2-3]。Lm致病力與其攜帶的毒力基因密切相關,在Lm感染人體的一系列過程中均涉及毒力基因的調控,這些毒力基因主要分布在毒力島 1(LIPI-1:prfA、plcA、hly、mpl、actA、plcB)、毒力島 2 (LIPI-2:inlA、inlB、inlC到inlH)及調控基因iap;少量分布在毒力島 3(LIPI-3:llsA、llsG、llsH、llsX等)、及毒力島 4(LIPI-4:ptsA等)[4]。此外,Lm致病力還與抗生素的敏感性有關,雖耐藥情況不像其他食源性病原菌(如金黃色葡萄球菌)那樣嚴重,但近年有加重趨勢,有必要不斷監(jiān)測Lm藥物敏感性[5]。

當人體食入被Lm污染的食物時可能會引起李斯特菌病,嚴重時會導致流產、死胎、腦膜炎及敗血癥,病死率高達20%～30%;易感人群主要為新生兒、孕婦、65 歲以上的老年人等免疫力低下的人[6-8]。研究表明李斯特菌病的暴發(fā)和散發(fā)病例主要與即食食品有關[9]:如2017年1月到2018年7月[10],南非暴發(fā)了世界上最大的李斯特菌病事件,共確診 1 060 例、216 人死亡,食品污染源為即食加工熟肉制品。盡管我國GB29921-2021、GB31607-2021等相關標準要求熟肉制品、乳制品等不得檢出Lm,但從各地開展的食品監(jiān)測來看,即食食品中存在Lm污染的現象仍不乏存在。隨著即食產品多樣化、規(guī)模化生產及人們生活方式、飲食習慣的改變,即食食品帶來的Lm感染風險日趨嚴峻,因此對該菌進行監(jiān)測具有重要的公共衛(wèi)生學意義。本文對2011—2021年福建省即食食品中Lm污染監(jiān)測數據及其分離株特征進行分析,旨在了解污染狀況、菌株毒力基因攜帶情況、耐藥及分子特征,并為相關部門采取防控措施提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 樣品采集 綜合考慮福建省地域分布、國家食品安全風險監(jiān)測計劃要求等因素,2011—2021年在福建省9 個監(jiān)測地區(qū)的區(qū)縣、農村及城市,按照多級分層隨機抽樣方法,在多類地點均無菌采集16類,共計8 166 份即食食品,其中福州市、莆田市、泉州市、廈門市、漳州市、三明市、南平市、龍巖市、寧德市分別采集1 350、1 010、736、739、635、917、947、984、848份,并及時送檢。

1.1.2 菌株來源 2011—2021年福建省采集的8 166份即食食品中檢測出、并經保存、增菌復活成功的83株Lm,其中26株分離自壽司、19株分離自中式涼拌菜、6株分離自熟制米面制品、3株分離自盒飯及熱菜、21株分離自熟肉制品、6株分離自生食水產品、1株分離自非發(fā)酵豆制品、及1株分離自其他類別。Lm參考菌株(ATCC 19115)作為陽性對照菌株進行實驗質量控制。

1.1.3 主要儀器與試劑 李氏增菌肉湯LB(LB1,LB2)、血瓊脂平板和鼠李糖、木糖生化管(北京陸橋);李斯特菌顯色培養(yǎng)基(法國科瑪嘉); VITEK生物鑒定板(法國生物梅里埃);DNA 提取試劑盒(北京天根);PCR引物(上海生工生物工程合成);PCR擴增儀(美國ABI);水平電泳槽(美國Bio-Rad);Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad);革蘭陽性菌96孔藥敏檢測板(珠海美華),所有試劑均在有效期內。

1.2 方 法

1.2.1 單增李斯特菌檢驗 所采集樣品按GB 4789. 30《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 單核細胞增生李斯特氏菌檢驗》中的方法進行檢測Lm。

1.2.2 DNA模板提取 將-80 ℃保存的Lm與參考菌株接種于腦心浸液肉湯中,37 ℃過夜培養(yǎng),培養(yǎng)物按照DNA提取試劑盒要求進行模板提取。

1.2.3 毒力基因檢測 選擇Lm的13個毒力基因進行PCR擴增,分別為prfA、mpl、plcA、hly、plcB、iap、actA、inlA、inlB、inlC、inlJ、llsX、ptsA,引物合成參照文獻[11-16], PCR擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳,100V 30 min,Gel red染色后使用凝膠成像系統(tǒng)觀察擴增結果。

1.2.4 藥物敏感性檢測 采用美國臨床和實驗室標準協(xié)會(CLSI)推薦的微量肉湯稀釋法,結合臨床用藥和研究需要,共選擇15種抗生素,使用商品化藥敏板進行藥敏檢測,每次試驗均采用 ATCC29213作為質控菌株,藥敏結果參照CLSI 相關解釋標準進行判定。

1.2.5 血清學分型 根據Doumith M等[17]建立的多重PCR方法,對活化成功的83株Lm分離株進行血清學分型。

1.2.6 多位點序列分型(MLST) 根據法國巴斯德研究所提供的用于Lm的MLST方法(https://bigsdb.pasteur.fr/listeria/primers-used/),將PCR產物送至上海生工生物技術服務公司進行雙向測序,將測序序列與數據庫進行比對,確定每個管家基因的等位基因號,abcZ-bglA-cat-dapE-dat-ldh-lhkA7 個等位基因號的組合即為該菌株的ST型,并按照abcZ-bglA-cat-dapE-dat-ldh-lhkA順序拼接好每株菌的序列,利用MEGA軟件進行聚類,構建進化樹。

1.2.7 統(tǒng)計分析 使用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計分析,率的比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法,P<0.05差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 即食食品中Lm檢出情況 2011—2021年共采集16類即食食品,以壽司的檢出率最高為6.26%,其次是中式涼拌菜、熟肉制品,分別為5.6%、1.87%。16類即食食品的Lm檢出率差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=217.68,P<0.01),見表1。

表1 不同類別即食食品中單增李斯特菌檢出情況Tab.1 Detection of Listeria monocytogenes in various categories of ready-to-eat foods

2.2 毒力基因檢出情況 對83株菌株進行13種毒力基因檢測,毒力基因prfA、mpl、plcA、hly、iap、actA、inlA、inlB、inlC、inlJ的檢出率均為100%,plcB、llsX、ptsA檢出率分別為55.42%、16.87%、22.89%。83株Lm菌株中攜帶10種(缺失plcB-llsX-ptsA)、11種(缺失llsX-ptsA)、12種(僅缺失ptsA)毒力基因的比例分別為100%(83/83)、55.42%(46/83)、1.20%(1/83),見表2。

表2 83株單增李斯特菌實驗結果信息Tab.2 Experimental results for 83 Listeria monocytogenes isolates

2.3 藥敏試驗結果

2.3.1 總體耐藥特征 對83株菌株進行藥敏試驗,菌株頭孢西丁(FOX)的耐藥率最高為100%,其次是苯唑西林(OXA)、四環(huán)素(TET)、紅霉素(ERY),分別為15.66%、13.25%、10.84%;對克林霉素(CLI)、環(huán)丙沙星(CIP)、達托霉素(DAP)耐藥的菌株也均有出現,此外,還出現對克林霉素、環(huán)丙沙星、紅霉素、氯霉素(CHL)中介的菌株,其中對克林霉素的中介率達67.47%。但所有菌株均對氨芐西林(AMP)、青霉素(PEN)、萬古霉素(VAN)、復方新諾明(T/SUL)、慶大霉素(GEN)、亞胺培南(IPM)、紅霉素/克林霉素(ERY/CLI)敏感,見表3。

表3 83株單增李斯特菌總體耐藥情況Tab.3 Overall resistance of 83 Listeria monocytogenes isolates

2.3.2 總體耐藥譜 對2種及以上抗菌藥物耐藥的菌株有28株,耐藥率為33.73%(28/83),其中多重耐藥率為13.25%(11/83);耐藥譜以耐2種且以耐OXA-FOX最常見;此外,在1份熟肉制品、1份熟制米面制品、2份壽司樣品中檢出四重耐藥株,耐藥譜均為OXA-ERY-TET-FOX,見表2。

2.4 血清學分型結果 83株Lm分離株被分為4種血清型,分別為1/2a(40株,48%)、1/2b(33株,40%)、1/2c(6株,7%)、4b(4株,5%)型,其中以1/2a 和1/2b型為優(yōu)勢血清型,見表2。

2.5 MLST基因分型結果 對83株Lm進行MLST基因分型,共鑒定出16種序列型(ST)。以ST87為優(yōu)勢型別,其次是ST8,ST101,分別占比24.10%(20/83)、15.66%(13/83)、12.05%(10/83),并發(fā)現一個新的ST型待提交數據庫審核。ST型與血清型之間對應關系密切,除ST9對應1/2c、1/2b型外,其余ST型均只對應一種血清型。

7個管家基因中,不超過 1 個等位基因編號不同的2株Lm被認為屬于同一個克隆群(clonal complexes,CCs)[18]。此次分型將菌株分為14個CC群,大部分CC群與ST型一一對應,以CC87、CC8、CC101分布廣泛,分別對應ST87、ST8,ST101(表4),83株Lm聚類結果見圖1。

注:從左到右依次為菌株編號、樣品類別、菌株分離地區(qū)(FZ:福州;PT:莆田;QZ:泉州;XM:廈門;ZZ:漳州;NP:南平;LY:龍巖;SM:三明;ND:寧德)、分離年份、血清型、ST型、CC群 ▲:新ST型。圖1 83株單增李斯特菌最小進化樹圈Fig.1 Minimal evolutionary circle of 83 Listeria monocytogenes isolates

表4 83株單增李斯特菌血清型、ST型和CC群分布Tab.4 Distribution of 83 Listeria monocytogenes serotypes, ST and CC groups

3 討 論

Lm是一種重要的食源性病原體,目前仍對全球公共衛(wèi)生構成重要威脅。本研究合計采集8 166份即食食品,共檢出102株Lm,污染率為1.25%,與河南省[19]的結果接近(1.34%),低于Chen Y等[20]對我國21個省份部分即食食品的采樣報道(10.8%);也低于國外Koskar J等[21]對愛沙尼亞即食食品的監(jiān)測結果(3.6%),這可能與本次監(jiān)測的即食食品類別較多有關,其中焙烤及油炸類食品、乳與乳制品、生食果蔬及制品等類別未檢出Lm,故整體檢出率較上述地區(qū)低,也可能與每個地區(qū)衛(wèi)生條件或地理位置的差異有關。此次研究表明,福建省部分市售即食食品存在較嚴重的Lm污染,尤其以壽司(6.26%),涼拌菜(5.26%)污染率高,主要因為這類冷加工即食食品一般不經過高溫處理,而Lm的生長溫度范圍寬,對低溫有較強的耐受性,即使在冷藏條件下也能生長;其次熟肉制品的污染率也較高,這與盛放熟肉的器具多為開放或半開放式,極易造成加工后二次污染有關[22],提示日后應加強對上述食品的監(jiān)管力度,從源頭上進行污染控制,同時應加強健康教育,使消費者,尤其是高危人群,盡可能食用加熱過的食物。

Lm為一種胞內寄生菌,其所致的感染涵蓋4個過程:黏附與侵襲、逃離吞噬體、宿主細胞內增殖、細胞間傳播。在這一系列過程中,毒力基因的存在、表達起到重要的調控作用,缺失將導致其致病性的消失或下降[23]。其中hly、plcA、plcB毒力基因共同作用使液泡膜裂解,Lm得以逃離吞噬體進入細胞質;llsX(LIPI-3) 則能夠增強Lm溶血與細胞毒活性,并在感染過程中改變宿主微生物群;LIPI-4增強Lm的神經和胎盤向性[20],通過檢測llsX和LIPI-4基因片段(ptsA)可用來識別具有潛在高毒性的Lm分離株[16]。本次研究顯示福建省即食食品中Lm分離株的LIPI-1、LIPI-2攜帶率較高,毒力基因缺失現象并不嚴重,僅有部分分離株缺失plcB,而有研究[24]表明缺失plcB基因不影響Lm的體外生長,可認為此次分離株具有潛在致病性。此外,在中式涼拌菜、壽司、熟肉制品中檢出llsX、ptsA基因,提示上述即食食品會對消費者健康構成威脅,食用會增加李斯特菌病的感染風險,應引起相關部門關注。

目前,臨床上治療人類李斯特菌病的首選方案為氨芐西林或青霉素單獨使用或與慶大霉素等氨基糖苷類藥物聯(lián)合使用。本研究對即食食品中的83株Lm進行藥敏試驗,所有分離株均對頭孢西丁天然耐藥,這一結果與劉洋等[25]報道江西熟肉制品的耐藥情況一致。除頭孢西丁外,仍有28株Lm對其他抗菌藥物存在耐藥,耐藥率為33.73%,高于閆韶飛等[5]報道的中國23個省市的即食食品Lm分離株藥敏結果(11.53%)、也高于鄭雅雯等[26]的結果(21.7%)。耐藥株主要對苯唑西林、四環(huán)素、紅霉素、氯霉素、環(huán)丙沙星耐藥,這與涂文君等[27]報道重慶市雞肉中Lm分離株對四環(huán)素、紅霉素、氯霉素、環(huán)丙沙星敏感性較高相反,與趙悅等[28]報道的較為一致。其中,對四環(huán)素耐藥(13.25%,僅次于苯唑西林)的菌株中約一半是熟肉制品,可能與近年來動物飼料中出現四環(huán)素添加使用有關[29]。但未出現對李斯特菌病一線治療藥物耐藥的現象,故暫不影響臨床的首選治療。盡管如此,仍在4份熟肉制品、3份壽司、3份中式涼拌菜、1份熟制米面制品檢出包含多種耐藥譜的多重耐藥株與1株達托霉素耐藥株,這印證了近年來國內外食品分離株耐藥譜逐漸變寬[30],也表明上述類別食品中的Lm分離株耐藥情況不容樂觀。

多重PCR將Lm的血清型分為1/2a群(1/2a,3a)、1/2b群(1/2b,3b,7)、1/2c群(1/2c,3c)、4b群(4b,4d,e),其中3a、3b、7、3c、4d、e較為罕見,因此Lm的血清型可分為1/2a、1/2b、1/2c及4b型。本次Lm分離株包含上述4種血清型,以1/2a(40株)、1/2b型(33株)為主,此外還檢測到 4株4b型,而這3種正是散發(fā)及暴發(fā)李斯特菌病的常見血清型,尤其在歐洲和北美,1/2a 血清型與李斯特菌病的暴發(fā)更頻繁地聯(lián)系在一起[31]。但血清學分型對Lm分辨能力過低,MLST 是在測序的基礎上為研究菌群基因結構而設計的一種高分辨率分型技術,其結果能夠用于構建系統(tǒng)發(fā)育樹,確定菌株間的關系,且可在不同實驗室間進行比較,因此一定程度上滿足了Lm流行病學研究發(fā)展的要求[32]。本次研究首次在福建省使用MLST分型對Lm進行研究,83株Lm分為14個CC群、16個ST型,其中包含一個新的ST型。Wang Y等[33]對2000—2008年分離自中國12個省市的各類食品來源212株Lm進行分析,得到優(yōu)勢型ST9、ST8和ST87;章樂怡等[23]對溫州市2007—2017年97株各類食品與病例Lm分離株進行分析,得到優(yōu)勢型別ST87、ST121和ST9;Wu S等[34]在2012—2014年對24個城市采集并分離到的80份即食食品進行分型,得到ST8、ST1、ST87為優(yōu)勢型別;成夢雅等[35]對上海市2013-2014年86株食源性Lm分型,得到優(yōu)勢型別ST8、ST155、ST87,優(yōu)勢CC群CC8、CC155和CC87;李薇薇等[36]對2017年中國239株即食食品Lm分離株進行分析,得到CC8、CC101和CC87為優(yōu)勢CC群,對應ST8、ST101和ST87;康立超等[30]對2013—2019 年新疆各類食品63株Lm進行分型,得到ST8、ST9、ST121、ST87 為優(yōu)勢型,CC8、CC9、CC1和CC121為優(yōu)勢CC群;可見本研究得到的優(yōu)勢CC群CC87、CC8、CC101,優(yōu)勢型別ST87、ST8,ST101與全國范圍流行的相符,并與李薇薇等[36]的結果一致。本研究聚類結果顯示,相同采樣點不同年份、相同年份不同采樣點來源的菌株聚在一起、出現相同型別菌株,如本次福州2014—2017年均檢出ST87;此外,相同時間、同一采樣點、相同或者不同類別食品也出現相同型別菌株。提示上述型別在不同年份持續(xù)存在,加之食品的流通,使得同一型別流行不同地區(qū),但是否存在持續(xù)污染、交叉污染有待進一步結合生產環(huán)節(jié)、加工環(huán)節(jié)、零售市場等各個環(huán)節(jié)的流行病學資料進行研究[37]。值得注意的是毒力基因ptsA陽性的菌株均為ST87,2重及以上耐藥株也以ST87、ST8、ST121、ST101為優(yōu)勢型別,而Lu B等[38]對大陸2008—2019年29個醫(yī)院的李斯特菌病病例分析,發(fā)現ST87最常見,其次是ST1、ST8;Tsai YH等[39]對臺灣2014—2019年收集的411例李斯特菌病病例分析,也發(fā)現ST87最常見;此外,ST8對應的CC8是2011—2013年瑞士李斯特菌病病人分離株的主要克隆群[40]。可見福建省即食食品中Lm對應ST型分離株具有潛在的暴發(fā)流行風險, 尤其應加強ST87的監(jiān)測,而ST87菌株大多分布在本次研究的高風險食品類別壽司、中式涼拌菜及熟肉制品中,更進一步表明應加強對這3類食品的管控。

綜上所述,壽司、中式涼拌菜及熟肉制品中的Lm檢出率較高,分離株具有潛在致病性、感染風險,且耐藥情況不容樂觀,相關部門應切實加強對即食食品中Lm的監(jiān)管,尤其是上述高風險類別食品,加大監(jiān)管力度及規(guī)范抗生素的合理使用。

利益沖突：無