張俊君,王瑩瑩,楊 囡,王麗娟,劉 剛,秦 龍

單增李斯特菌(Listeriamonocytogenes,Lm)是一種重要的食源性人獸共患病原菌,在自然界普遍存在,且不易被凍融、強(qiáng)烈光照等因素殺死,抗熱能力強(qiáng),可在范圍較廣的pH條件下生長(zhǎng),具有嗜冷性,能在4 ℃的溫度下存活和繁殖,形成生物膜可長(zhǎng)期在食品生產(chǎn)加工企業(yè)存活,是威脅冷藏食品安全的主要病原菌之一[1]。近年來(lái)由單增李斯特菌引起的食物中毒事件在國(guó)內(nèi)外常有發(fā)生,主要是通過(guò)食用被污染的食物進(jìn)行傳播[2-3],易感人群包括老人、新生兒、孕婦和免疫缺陷人群,可導(dǎo)致發(fā)熱性胃腸炎、敗血癥、腦膜炎、流產(chǎn)、新生兒感染等,病死率較高[4-5]。許多國(guó)家將單增李斯特菌列為進(jìn)出口食品的必檢項(xiàng)目[6],我國(guó)于2001年建立了全國(guó)食源性致病菌監(jiān)測(cè)網(wǎng),在全國(guó)范圍內(nèi)開(kāi)展不同種類(lèi)食品中單增李斯特菌污染狀況監(jiān)測(cè)。

本研究對(duì)咸陽(yáng)市2010—2019年12類(lèi)食品及芝麻醬加工環(huán)節(jié)中的單增李斯特菌進(jìn)行分離鑒定、血清學(xué)分型、脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)、全基因組測(cè)序(Whole Genome Sequencing,WGS),并進(jìn)行多位點(diǎn)序列分型(multilocus sequence typing,MLST),核心基因組多位點(diǎn)序列分型(core genomeMLST,cgMLST),以了解咸陽(yáng)市食品中單增李斯特菌的污染情況,初步建立咸陽(yáng)市單增李斯特菌PFGE指紋圖譜庫(kù),掌握單增李斯特菌的分子流行病學(xué)特征。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源 按照國(guó)家食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)工作手冊(cè)[7],于2010—2019年采集了咸陽(yáng)市區(qū)及其管轄縣(禮泉縣、長(zhǎng)武縣、彬縣、三原縣、涇陽(yáng)縣、淳化縣)的超市、農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)、街邊小攤和芝麻醬加工過(guò)程等樣本,10年共采集12類(lèi)1 699份樣本,主要包括生肉制品、熟肉制品、水產(chǎn)品、速凍米面制品、即食非發(fā)酵性豆制品、糕點(diǎn)及餅干、中式?jīng)霭璨恕⒗鋬鲲嬈?冰激凌)、陜西特色食品、外賣(mài)、水果/水果干、芝麻醬加工過(guò)程樣本,進(jìn)行單增李斯特菌檢測(cè)。

1.2 培養(yǎng)基、試劑及設(shè)備 木糖、鼠李糖和PALCAM瓊脂購(gòu)自北京路橋公司,LB增菌液購(gòu)自廣東環(huán)凱公司,血平板和單增李斯特菌顯色平板購(gòu)自青島海博公司,API20E生化鑒定條和革蘭陽(yáng)性菌鑒定卡購(gòu)自法國(guó)梅里埃公司,單增李斯特菌分型血清購(gòu)自日本生研株式會(huì)社,限制性?xún)?nèi)切酶XbaI和AscI購(gòu)自美國(guó)NEB公司,全基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司,微生物質(zhì)譜購(gòu)儀購(gòu)自青島融智生物公司,脈沖場(chǎng)電泳系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)伯樂(lè)公司。

1.3 菌株分離和培養(yǎng) 依據(jù)《國(guó)家食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)工作手冊(cè)》和GB4789.30-2010《單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)》,進(jìn)行預(yù)增菌、二次增菌、選擇性培養(yǎng),再通過(guò)生化反應(yīng)和微生物質(zhì)譜進(jìn)行鑒定。

1.4 血清學(xué)分型 單增李斯特菌血清凝集O抗原和H抗原實(shí)驗(yàn)參照日本生研血清試劑的使用說(shuō)明操作。

1.5 脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE) 參照中國(guó)CDCPulseNet標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程,進(jìn)行膠塊的制備、裂解、洗滌,用內(nèi)切酶AscI進(jìn)行酶切,電泳圖譜用BioNumerics7.6進(jìn)行標(biāo)記和分析,用UPGMA聚類(lèi)方法建立系統(tǒng)發(fā)生樹(shù),以相似系數(shù)100%確定為同一帶型,參照PulseNet的PFGE條帶命名原則對(duì)帶型進(jìn)行命名。

1.6 全基因組測(cè)序 分離鑒定得到單增李斯特菌,使用全基因組DNA提取試劑盒提取DNA,送至上海伯杰醫(yī)療科技股份有限公司進(jìn)行全基因組測(cè)序,測(cè)序策略為全基因組鳥(niǎo)槍法,將質(zhì)控檢測(cè)合格的DNA打斷,構(gòu)建不同插入片段的文庫(kù),用Illumina NovaSeq對(duì)文庫(kù)進(jìn)行雙末端測(cè)序,使用BioNumerics7.6軟件對(duì)測(cè)序原始序列進(jìn)行拼接和分析。

1.7 菌株譜系、血清型和MLST分析 利用法國(guó)巴斯德研究所的單增李斯特菌數(shù)據(jù)庫(kù)(https://bigsdb.pasteur.fr/listeria/listeria.html)分析72株菌全基因組序列,得到菌株譜系、序列型(ST)和克隆群(clonal complex,CC)信息?；诨蛐蛄蟹殖?個(gè)血清群(Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc、Ⅳa和Ⅳb)[8]。按照MLST的7個(gè)管家基因中只有1個(gè)位點(diǎn)不同定義為同一個(gè)CC型,使用BioNumerics7.6軟件構(gòu)建譜系和CC型生成樹(shù)。

1.8 核心基因組多位點(diǎn)序列分型(core geno-meMLST,cgMLST) cgMLST的進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建通過(guò)BioNumerics 7.6軟件完成。cgMLST分析框架采用法國(guó)巴斯德研究所報(bào)道的方法,包括單增李斯特菌EGD-e參考菌株上1 748個(gè)高度保守的核心基因[9],根據(jù)cgMLST中等位基因差異數(shù)≤150個(gè),定義為一個(gè)亞群(sublineage,SL),亞群中等位基因差異數(shù)≤10個(gè)視為同源,11～24個(gè)視為可能相關(guān),>25個(gè)視為非同源[9-10]。BioNumerics 7.6采用Complete linkage方法,比例因子Scaling factor設(shè)為1[9],等位基因差異數(shù)≤10個(gè)認(rèn)為是同源菌株。

1.9 抗性相關(guān)基因分析 使用本地BLASTN軟件,將李斯特菌基因組島LGI1(CP001602)、LGI2(NZ_CM001159)分別與72株菌基因組進(jìn)行比對(duì),參數(shù)設(shè)置中基因覆蓋度及一致性閾值均為大于85%。

1.10 質(zhì)量控制 使用中國(guó)CDC食品與營(yíng)養(yǎng)安全所下發(fā)的單增李斯特菌參考菌株(CMCC54004)做為質(zhì)控菌株。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 利用Excel完成數(shù)據(jù)整理,使用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。率的比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法,檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 單增李斯特菌檢出情況 2010—2019年共采集1 699份樣品,檢出單增李斯特菌72株,總檢出率4.24%。不同種類(lèi)食品中,有8類(lèi)食品檢出單增李斯特菌,生肉制品檢出率最高(18.49%),其次為水產(chǎn)品(8.75%)、熟肉制品(6.11%)、中式?jīng)霭璨?5.31%)、速凍米面制品(4.84%)、陜西特色食品(2.58%)、芝麻醬加工過(guò)程樣品(2.31%)、外賣(mài)(1.43%)。有4類(lèi)監(jiān)測(cè)食品中未檢出單增李斯特菌。不同種類(lèi)食品中單增李斯特菌檢出率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)(表1)。

表1 2010—2019年咸陽(yáng)市不同食物種類(lèi)中單增李斯特菌檢出情況Tab.1 Detection of L. monocytogenes in different foods in Xianyang from 2010 to 2019

2.2 血清型鑒定結(jié)果 72株分離株分為5種血清型:1/2a(31/72,43.06%)、1/2b(22/72,30.56%)、1/2c(10/72,13.89%)、4b(6/72,8.33%)、4a(3/72,4.17%)。1/2a、1/2b和1/2c為咸陽(yáng)市市售食品中單增李斯特菌的主要血清型(圖1)。

2.3 PFGE分型結(jié)果 72株單增李斯特菌基因組DNA采用AscI酶切后,產(chǎn)生8～12個(gè)條帶,分子量大小在20～1 000 kb。經(jīng)BioNumerics 7.6軟件分析,共獲得40種PFGE圖譜類(lèi)型(GX6A16.XY0001-GX6A16.XY0040,后文簡(jiǎn)寫(xiě)為XY0001-XY0040),相似度在25.5%～100%。XY0009型(16/72,22.22%)、XY0004型(8/72,11.11%)和XY0003型(5/72,6.94%)為主要的圖譜類(lèi)型。不同種類(lèi)的食品中可以檢出相同的帶型(表2)。本研究選取了一家具有代表意義的醬制品加工廠(chǎng),原料為芝麻,對(duì)企業(yè)從原料、加工中間產(chǎn)品、終產(chǎn)品、環(huán)境、儀器設(shè)備等全過(guò)程進(jìn)行采樣分離,XY0009型中有14株分離株來(lái)自該芝麻醬生產(chǎn)企業(yè),并且分離自多個(gè)生產(chǎn)環(huán)節(jié)(圖1,表3)。

表2 各類(lèi)食品中PFGE圖譜分布Tab.2 Distribution of PFGE types among various food types

表3 某企業(yè)生產(chǎn)環(huán)節(jié)單增李斯特菌檢出情況Tab.3 Detection of L. monocytogenes in the production process of an enterprise

2.5 譜系、血清型、序列型和CC型分型結(jié)果 72株單增李斯特菌菌株分為3個(gè)譜系,其中譜系Ⅱ?yàn)閮?yōu)勢(shì)譜系(56.94%,41/72),以Ⅱa為優(yōu)勢(shì)血清型(43.06%,31/72),分屬16種序列型和15種CC型(表4),優(yōu)勢(shì)序列型為ST224、ST8、ST9、ST87,其中ST224全部分離自某芝麻醬生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)過(guò)程,ST8、ST9、ST87主要分離自生肉制品、中式?jīng)霭璨撕退賰雒酌嬷破?且在不同年份均有檢出。抗性基因分析未發(fā)現(xiàn)株菌攜帶抗季胺鹽類(lèi)消毒劑基因組島LGI1,有6株來(lái)自水產(chǎn)品和生肉制品中的CC2型菌(8.33%,6/72)攜帶LGI2(抗鎘基因cadA和cadC以及抗砷基因arsD2、arsA1、arsR1、arsD2、arsR2、arsA2、arsB1、arsB2)。

表4 72株單增李斯特菌譜系、血清和CC型構(gòu)成情況Tab.4 Lineages, serotypes, and CC types of 72 L. monocytogenes strains

2.6 cgMLST分型結(jié)果 譜系Ⅰ菌中1 748個(gè)等位基因差異數(shù)最大為1 250,譜系Ⅱ型為1 410,譜系Ⅲ為1 600。通過(guò)cgMLST分析,共分為19個(gè)亞群(sublineage,SL),與CC型(15個(gè))基本一致(圖2)。按照cgMLST等位基因差異數(shù)≤10個(gè)認(rèn)定為同源性的標(biāo)準(zhǔn),27株SL004、SL006和SL007菌株共有6組同源菌株(圖3)。

注:分支上的數(shù)值為等位基因差異數(shù)。圖2 72株單增李斯特菌cgMLST聚類(lèi)圖Fig.2 cgMLST dendrogram of 72 L.monocygenes strains

注:SL004:11株CC8,SL006:9株CC9,SL007:7株CC87,分支上的數(shù)值為等位基因差異數(shù)。圖3 27株亞群SL004、SL006和SL007單增李斯特菌cgMLST聚類(lèi)圖Fig.3 cgMLST dendrogram of 27 L. monocytogenes strains belonging to sublineages 004, 006, and 007

3 討 論

近年來(lái),食源性致病菌污染所導(dǎo)致的食品衛(wèi)生安全事件受到社會(huì)各界的廣泛關(guān)注,由食源性致病菌引起的食源性疾病已經(jīng)成為一個(gè)世界性公共衛(wèi)生問(wèn)題。我國(guó)自2009年開(kāi)始建立全國(guó)食源性致病菌監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò),目前已經(jīng)建立起覆蓋各省、市、縣并逐步延伸到農(nóng)村地區(qū)的監(jiān)測(cè)體系,通過(guò)及時(shí)、準(zhǔn)確的檢測(cè)為食源性疾病的暴發(fā)提供預(yù)警,為制定有效的防控措施提供依據(jù)。咸陽(yáng)市于2010年加入全國(guó)監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò),2013年和2014年已有相關(guān)調(diào)查報(bào)道[11-12]。

本研究對(duì)2010—2019年咸陽(yáng)市12類(lèi)食品和芝麻醬加工過(guò)程中單增李斯特菌進(jìn)行了監(jiān)測(cè),在8類(lèi)食品中檢出單增李斯特菌,總檢出率4.24%,總檢出率低于綿陽(yáng)市(9.7%)[3],高于渭南市(2.98%)[13]和河北省(1.34%)[14],與北京市順義區(qū)(4.28%)[15]接近。不同食品種類(lèi)中單增李斯特菌檢出率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,生肉制品檢出率最高(18.49%),其次為水產(chǎn)品(8.75%)、熟肉制品(6.11%)和中式?jīng)霭璨?5.31%),與北京市[16]、吉林省[17]報(bào)道結(jié)果一致,符合Meta分析研究中我國(guó)東北和中部地區(qū)肉制品檢出率高的結(jié)論[18]。

在檢出率較高的這4類(lèi)食品中,生肉制品在復(fù)雜的屠宰、加工、流通、運(yùn)輸過(guò)程易受到單增李斯特菌的污染。水產(chǎn)品在加工過(guò)程反復(fù)與案板、刀具、容器接觸也易受污染。熟肉制品在加工過(guò)程中如果沒(méi)有充分燒熟煮透,就可能使存在于生肉中的單增李斯特菌存活繁殖,而且制作好的熟肉制品若未有效冷藏、與其他生肉共同存儲(chǔ)也會(huì)導(dǎo)致被單增李斯特菌污染;中式?jīng)霭璨硕嗖捎美浼庸し绞街谱?可能在加工過(guò)程中受到單增李斯特菌污染,且食用前不再加熱直接入口。應(yīng)加強(qiáng)宣傳教育,提高居民個(gè)人食品安全意識(shí),生熟案板分開(kāi),避免直接食用生肉制品及生食水產(chǎn)品。同時(shí)加強(qiáng)對(duì)這幾類(lèi)食品在加工、儲(chǔ)存、運(yùn)輸和銷(xiāo)售環(huán)節(jié)的衛(wèi)生監(jiān)督,防止由單增李斯特菌引起食源性疾病的發(fā)生。

根據(jù)菌體O抗原和鞭毛H抗原,可將單增李斯特菌分為13個(gè)血清型,對(duì)人致病的主要血清型為4b,其次是1/2a和1/2b,三者約占本病的90%[19]。本研究分離的72株單增李斯特菌有5種血清型,優(yōu)勢(shì)型為1/2a、1/2b和1/2c,與我國(guó)食品中單增李斯特菌最常見(jiàn)的血清型相一致[20]。72株分離株分為40種PFGE圖譜類(lèi)型,初步建立了咸陽(yáng)市單增李斯特菌PFGE指紋圖譜庫(kù),可為單增李斯特菌引起食品污染監(jiān)測(cè)提供預(yù)警及食源性疾病病原學(xué)分析和溯源提供參考數(shù)據(jù)。

單增李斯特菌主要分為4個(gè)譜系(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ),病人來(lái)源的分離株主要屬于譜系Ⅰ[8,21],ST87、ST3和ST7是其主要ST型;譜系Ⅱ菌株主要分離自食品,最常見(jiàn)的序列型為ST9、ST8、ST87[22]。本研究中72株單增李斯特菌分離株全部來(lái)自食品,譜系、血清群、ST型和CC型多樣化,以譜系Ⅱ和血清型Ⅱa為主,分屬15個(gè)CC型和16個(gè)序列型,其中優(yōu)勢(shì)序列型ST8、ST9、ST87在不同年份的生肉制品、中式?jīng)霭璨撕退賰雒酌嬷破分袡z出率較高,特別是ST87常在臨床中檢出,故對(duì)于檢出ST87的食品應(yīng)進(jìn)行重點(diǎn)監(jiān)測(cè)。

本研究分離到6株(8.33%)4b血清型單增李斯特菌,全部來(lái)自于水產(chǎn)品和生肉制品,均為CC2型,抗性基因分析均攜帶有LGI2,LGI2存在于CC2型菌株,特別是4b血清型菌株中,有助于提高菌株的毒力[23-24],故應(yīng)對(duì)此污染現(xiàn)象加以重視。另外結(jié)合PFGE分型結(jié)果可以看出,9型圖譜中15株1/2b血清型菌株的PFGE帶型聚類(lèi)效果好,相似度100%,而1/2a和1/2c血清型菌株的PFGE型別較分散,菌株同源性差,相比較血清分型,PFGE分型效果更好。另外分析本研究中菌株來(lái)源、分離時(shí)間與PFGE的關(guān)系發(fā)現(xiàn),XY0003、XY00034、XY00035型圖譜中,不同來(lái)源、不同年份分離到的菌株也出現(xiàn)相同的PFGE圖譜類(lèi)型,提示咸陽(yáng)市不同市售食品之間可能存在相同的污染來(lái)源,或者存在交叉污染的可能性,并且污染源持續(xù)存在。另一方面,不同時(shí)間采集的同一類(lèi)來(lái)源食品中可以分離到不同PFGE圖譜類(lèi)型的菌株,如生肉制品中22株菌,分屬15個(gè)PFGE圖譜類(lèi)型,表明這些來(lái)源的單增李斯特菌的持續(xù)污染來(lái)自于不同的克隆株,需要引起食品衛(wèi)生部門(mén)的重視。

2018-2019在某芝麻醬生產(chǎn)企業(yè)專(zhuān)項(xiàng)監(jiān)測(cè)中檢測(cè)到單增李斯特菌污染,首次檢測(cè),在前處理區(qū)、灌裝區(qū)和整箱包裝區(qū)的原料、環(huán)境、儀器設(shè)備、中間產(chǎn)品和終產(chǎn)品中檢出12株單增李斯特菌,灌裝區(qū)分離株占66.67%,PFGE分型圖譜類(lèi)型一致,提示該企業(yè)整個(gè)生產(chǎn)環(huán)節(jié)存在單增李斯特菌交叉污染,灌裝區(qū)受污染情況最為嚴(yán)重。首次檢測(cè)結(jié)果反饋后該企業(yè)實(shí)施了整改措施,啟動(dòng)清洗消毒程序,并對(duì)原料進(jìn)行了熟制處理。10個(gè)月后進(jìn)行第2次采樣,自原料中檢出2株單增李斯特菌,生產(chǎn)環(huán)節(jié)未檢出,企業(yè)采取的措施有效控制了污染,分析該企業(yè)的可疑污染源主要為原料與后續(xù)加工環(huán)節(jié)的交叉污染,也提示該企業(yè)要加強(qiáng)生產(chǎn)原料的質(zhì)量控制。第2次分離的2株菌與首次分離的12株菌PFGE分型為同一圖譜類(lèi)型,疑為同一個(gè)污染菌株的持續(xù)污染,經(jīng)cgMLST分型,14株菌均為ST224型,13株菌屬同一個(gè)亞群,首次分離的1株菌為另一亞群,等位基因差異數(shù)較大,推斷該企業(yè)首次采樣時(shí)生產(chǎn)環(huán)境中可能存在2個(gè)克隆株污染,同時(shí)顯示相對(duì)于PFGE方法,cgMLST方法的分辨率更高,分型效果更好。單增李斯特菌作為食品加工環(huán)境常駐菌,與其攜帶應(yīng)激生存島和其他環(huán)境抗性基因有關(guān)[25-27],結(jié)合水產(chǎn)品和生肉制品中單增李斯特菌攜帶LGI2的情況,下一步搜集臨床病例及分離菌株,從毒力基因和抗性基因水平研究其致病性。

本研究中ST224型為優(yōu)勢(shì)序列型,這與芝麻醬企業(yè)生產(chǎn)過(guò)程交叉污染導(dǎo)致該型單增李斯特菌高檢出率有關(guān),16株ST224型分離株中有2株分離自其他食品,而在本地還未有食品中ST224型菌株檢出的報(bào)道,推斷該企業(yè)的原料在市場(chǎng)流通環(huán)節(jié)與污染ST224型菌株的食品存在持續(xù)交叉污染。

全基因組測(cè)序技術(shù)分辨率力強(qiáng),已成為流行病學(xué)調(diào)查和分子溯源的重要工具。PFGE分型技術(shù)重復(fù)性好,并且已經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化,是近幾年國(guó)家食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)和食源性疾病監(jiān)測(cè)中要求的一項(xiàng)溯源技術(shù)。本研究中PFGE和cgMLST分型結(jié)果為72株分離株分屬40個(gè)帶型和19個(gè)亞群,PFGE有較高的分辨率,但按照菌株等位基因差異數(shù)≤10的同源性判定標(biāo)準(zhǔn),27株SL004、SL006和SL007優(yōu)勢(shì)菌株識(shí)別出6組同源菌株,這6組同源菌株的PFGE帶型均不相同,相對(duì)于PFGE方法,cgMLST技術(shù)分型能力更強(qiáng),可做為食源性疾病暴發(fā)調(diào)查的主要手段[28]。

通過(guò)本次研究,了解了咸陽(yáng)市食品污染單增李斯特菌的基本狀況、風(fēng)險(xiǎn)較高的食品種類(lèi)、優(yōu)勢(shì)菌型以及遺傳進(jìn)化特征,對(duì)于今后的監(jiān)測(cè)重點(diǎn)以及下一步的研究指明了方向。在同源性菌株識(shí)別方面,cgMLST分型優(yōu)勢(shì)明顯,尤其為某企業(yè)尋找單增李斯特菌的污染來(lái)源提供了準(zhǔn)確依據(jù)。今后的監(jiān)測(cè)工作以及食源性疾病事件調(diào)查中,將結(jié)合PFGE和全基因組測(cè)序分析,重點(diǎn)依靠cgMLST分型對(duì)可能出現(xiàn)的食源性疾病事件進(jìn)行預(yù)警,為食源性疾病暴發(fā)后的識(shí)別、溯源和調(diào)查提供技術(shù)支持。

利益沖突：無(wú)