馬小燕,張 旭,馬沁梅,宮照乾,于嘉霖,吳曉玲,鄧光存

結(jié)核病(Tuberculosis,TB)是嚴(yán)重威脅全球公共衛(wèi)生的流行病之一,它是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis, Mtb)引起的慢性傳染病[1]。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)報告,2022年有近160萬人死于結(jié)核病分枝桿菌感染,結(jié)核病的死亡率一直居高不下[2],研究表明,結(jié)核分枝桿菌感染宿主后,機(jī)體免疫機(jī)能良好時,其感染通常不會出現(xiàn)明顯的臨床特征,直到宿主免疫穩(wěn)態(tài)被破壞,Mtb進(jìn)入增殖期而誘發(fā)結(jié)核病[3]。由于結(jié)核病的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,早期癥狀不明顯,發(fā)病進(jìn)程受多種因素調(diào)節(jié),導(dǎo)致感染初期的診斷和治療面臨挑戰(zhàn)。因此,篩選早期診斷標(biāo)志物和潛在的治療靶點對結(jié)核病的防治具有重要的臨床意義。

環(huán)狀 RNA(Circular RNA,Circ-RNA)是一種不具有5′末端帽子結(jié)構(gòu)和3′末端尾巴,呈閉環(huán)結(jié)構(gòu)的非編碼 RNA,能夠穩(wěn)定存在于生物體內(nèi)[4]。近年來,隨著高通量測序等技術(shù)的廣泛運用[5-6],在多種人類疾病中都能夠檢測到Circ-RNA異常表達(dá),其潛在功能受到廣泛關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn),相較于健康人群,結(jié)核病患者外周血存在大量差異表達(dá)的Circ-RNA[7]。Circ-RNA可能通過細(xì)胞程序性死亡、炎性因子釋放等生物學(xué)過程,參與結(jié)核病的發(fā)生發(fā)展[8]。但是,與結(jié)核病相關(guān)的大量Circ-RNA作為分子標(biāo)志物的潛力和功能仍不清楚。

因此,研究擬基于數(shù)據(jù)庫中結(jié)核病患者外周血差異環(huán)狀RNA數(shù)據(jù)篩選獲得Circ-RNA候選靶點,經(jīng)GO/KEGG數(shù)據(jù)庫預(yù)測候選靶點的生物學(xué)功能,通過qRT-PCR和瓊脂糖凝膠電泳等方法進(jìn)行驗證,通過統(tǒng)計學(xué)進(jìn)行臨床相關(guān)性分析最終評價Circ-IRAKM作為活動性肺結(jié)核病患者外周血診斷分子標(biāo)志物的潛力,為結(jié)核病患者早期診斷提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本 分別收集寧夏回族自治區(qū)第四人民醫(yī)院呼吸科診斷為活動性肺結(jié)核病患者的外周血,以及寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院門診健康人群外周血。所收集外周血的患者性別不限、年齡大于14歲、均簽署知情同意書。研究均獲寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院醫(yī)學(xué)科研倫理審查委員會批準(zhǔn)(KYLL-2021-97)。共收集結(jié)核病患者標(biāo)本105例,健康對照標(biāo)本107例,通過篩選和排除標(biāo)準(zhǔn),最終納入結(jié)核病患者和健康對照各85例。

納入標(biāo)準(zhǔn):活動性結(jié)核病診斷參照中華醫(yī)學(xué)會肺結(jié)核基層診療指南(2018)、肺結(jié)核診斷和治療指南(2001)。納入研究的患者符合以下條件:1)患者痰液中檢出結(jié)核分枝桿菌或結(jié)核分枝桿菌體外培養(yǎng)為陽性;2)患者痰涂片為陰性,但影像學(xué)、臨床癥狀及相關(guān)檢查確診該患者為肺結(jié)核患者;納入研究的健康人群符合以下條件:經(jīng)檢查確認(rèn)無結(jié)核相關(guān)臨床癥狀,無結(jié)核病史的健康人,調(diào)查對象體檢無異常表現(xiàn),血液常規(guī)檢測顯示巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞等指標(biāo)在正常范圍內(nèi)。

排除標(biāo)準(zhǔn):1)患者患有免疫缺陷類疾病或者其它免疫系統(tǒng)疾病; 2)患者合并有肺癌慢性阻塞性肺病或其它肺部疾病; 3)受到乙型肝炎病毒或其它細(xì)菌、病毒感染的患者; 4)患者合并有其它部位的結(jié)核、合并心臟疾病或組織器官衰竭。5)調(diào)查對象為孕婦或者哺乳期婦女; 6)調(diào)查對象近期有手術(shù)史; 7)調(diào)查對象近期有服用免疫類藥物、激素類藥物的經(jīng)歷; 8)調(diào)查對象資料不全或拒絕參與調(diào)查研究。

1.2 結(jié)核病患者與健康對照間差異表達(dá)Circ-RNA篩選 通過NCBI-GEO(Gene Ession Omnibus)數(shù)據(jù)庫檢索獲得結(jié)核分枝桿菌感染與健康對照之間差異表達(dá)Circ-RNA本底數(shù)據(jù),重新進(jìn)行分析。檢索關(guān)鍵詞為Circ-RNA,數(shù)據(jù)篩選方法為測序,所檢測樣品為2例結(jié)核病患者外周血及2例健康人外周血。本檢索針對具有數(shù)據(jù)庫公開的表達(dá)譜的原始數(shù)據(jù)或差異Circ-RNA篩選數(shù)據(jù),采用的數(shù)據(jù)來源見表1。GSE103188為環(huán)狀RNA芯片檢測數(shù)據(jù)結(jié)果,樣品為TB1,TB2,CON1,CON2,以TB vs CON差異Circ-RNAs的差異倍數(shù)(Fold change, FC)和顯著性(P-value)為數(shù)據(jù)輸入,設(shè)定篩選條件為: FC>4,P-value<0.01;400 bp

表1 篩選原始數(shù)據(jù)來源Tab.1 Source of Co-screened original Data

1.3 候選差異表達(dá)Circ-RNA的親本基因預(yù)測及功能預(yù)測 通過CircRNADb和Circular RNA interactome數(shù)據(jù)庫[10]檢索候選Circ-RNA的開放閱讀框(ORF)及RNA結(jié)合蛋白(RBP)種類和數(shù)量,通過MiRanda v3.3a預(yù)測候選Circ-RNA的miRNA靶點,通過StarBase預(yù)測miRNA的mRNA靶點。將與候選Circ-RNA相關(guān)的全部預(yù)測獲得的mRNA為輸入,通過DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行生物學(xué)功能預(yù)測,通過KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行相關(guān)信號通路聚類分析(GO/KEGG-信號通路聚類分析由北京博奧公司完成)。

1.4 qRT-PCR驗證Circ-RNA在結(jié)核病患者外周血中的相對表達(dá) 納入的85份結(jié)核病患者外周血樣本均分為2管,一份通過反轉(zhuǎn)錄試劑盒(賽默飛,美國),進(jìn)行總RNA提取并反轉(zhuǎn)錄成cDNA儲存于-80 ℃?zhèn)溆?。隨后,另一份中隨機(jī)選取5份結(jié)核病患者外周血樣本,使用離心柱型全血基因組DNA提取試劑盒(百泰克,中國),提取全血基因組gDNA。分別以總RNA、cDNA、gDNA為模板,使用熒光定量PCR試劑盒(TAKARA,日本),以β-actin為內(nèi)參進(jìn)行驗證。所需相關(guān)引物見表2。取qRT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定,收集qRT-PCR實驗后的CT值,使用2-△△Ct方法分析qRT-PCR結(jié)果,計算相對表達(dá)量[11]。明確Circ-IRAKM環(huán)狀序列引物擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性和保守性。

表2 實時熒光定量PCR所需引物Tab.2 Primer Required for qRT-PCR

1.5 統(tǒng)計分析 使用SPSS 23.0軟件(IBM,美國)和GraphPad Prism version 8.0軟件(Graphpad,美國)對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。采用曲線回歸分析及斯皮爾曼檢驗分析相關(guān)性,采用ROC曲線評價診斷價值,以曲線下面積(AUC)≥0.6表示具有診斷價值。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 活動性結(jié)核病患者外周血差異表達(dá)Circ-RNAs的篩選 通過對GSE103188數(shù)據(jù)的重新分析,結(jié)果共發(fā)現(xiàn)147個差異顯著的Circ-RNA(FC>4,P<0.05)(圖1A),進(jìn)一步嚴(yán)格篩選條件后,共發(fā)現(xiàn)32個差異顯著的Circ-RNA(FC>4,P<0.01,400 bp

注:A為2例結(jié)核患者和2例健康對照外周血中差異表達(dá)Circ-RNA熱圖分析,篩選條件為FC≥4, P<0.05;B為提高篩選條件后差異表達(dá)Circ-RNA篩選結(jié)果熱圖分析,篩選條件為FC≥4, P<0.01, 400 bp

2.2 候選靶點Circ-RNAs的基因功能預(yù)測分析 候選Circ-RNA在結(jié)核病患者外周血中相對表達(dá)顯著上調(diào),其親本基因功能相關(guān)性見表3。對Circ-RNA的親本基因和RBP的功能預(yù)測,結(jié)果顯示候選Circ-RNA的功能與先天免疫、細(xì)菌感染、炎性反應(yīng)等相關(guān)(圖2A,2B),提示其在先天免疫信號通路發(fā)揮重要調(diào)控作用。

注:A為GO分析預(yù)測5個候選Circ-RNAs的生物學(xué)功能;B為KEGG分析預(yù)測5個候選Circ-RNAs的功能相關(guān)的信號通路。圖2 候選Circ-RNA信號通路預(yù)測分析Fig.2 Predictive analysis of candidate Circ-RNAs signaling pathways

注:A為5個候選Circ-RNA在健康人群外周血(1)、活動性結(jié)核患者(2)中相對表達(dá)(n=25);B為5個候選Circ-RNA在活動性結(jié)核患者外周血、健康人群PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分析?！皀s”為P>0.05, “①”為P<0.05,“②”為P<0.01,“③”為P<0.001。M為標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量。圖3 候選Circ-RNA的qRT-PCR驗證Fig.3 qRT-PCR verification of candidate Circ-RNA

注:A為Circ-IRAKM 環(huán)狀及線性引物設(shè)計位點;B為環(huán)狀及線性引物分別在RNA、cDNA、gDNA中驗證Circ-IRAKM;C為Circ-IRAKM 在60例活動性結(jié)核患者與健康人群外周血中的相對表達(dá);D為外周血中Circ-IRAKM的診斷活動性結(jié)核的ROC曲線分析;“①”為P<0.05,“②”為P<0.01,“③”為P<0.001。M為標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量。圖4 Circ-IRAKM在活動性結(jié)核患者外周血中的表達(dá)驗證Fig.4 Validation of Circ-IRAKM in peripheral blood of active TB patients

表3 候選Circ-RNA 的基本信息Tab.3 Basic Information of Candidate Circ-RNA

隨機(jī)選取經(jīng)排除標(biāo)準(zhǔn)后納入的85份活動性結(jié)核病患者外周血樣本中的25例提取RNA,通過qRT-PCR與瓊脂糖電泳實驗驗證備選Circ-RNA的表達(dá)情況,結(jié)果顯示Circ-IRAKM在結(jié)核病患者外周血中表達(dá)顯著上調(diào)且條帶清晰均一(圖3A、3B),提示Circ-IRAKM可作為分子標(biāo)志物檢測靶點。

2.3 Circ-IRAKM在活動性結(jié)核病患者外周血中的表達(dá) Circ-IRAKM序列與親本基因幾乎一致,僅有反向剪切位點是保守的。因此,評價其診斷價值前,需要對其引物進(jìn)行驗證。特異性驗證結(jié)果顯示,僅有反向剪切位點的引物在轉(zhuǎn)錄水平能夠擴(kuò)增出環(huán)狀序列產(chǎn)物(圖4A、4B)。提示設(shè)計的特異性引物能夠在外周血核酸中擴(kuò)增出Circ-IRAKM。

qRT-PCR驗證60例活動性結(jié)核病患者與60例健康人群外周血中Circ-IRAKM的相對表達(dá),結(jié)果顯示Circ-IRAKM在活動性結(jié)核病患者外周血中表達(dá)極顯著上調(diào)(圖4C)。ROC曲線分析結(jié)果顯示Circ-IRAKM用于鑒別健康人群和肺結(jié)核病患者的特異性為0.995,靈敏度為0.937(圖4D)。結(jié)果提示Circ-IRAKM能夠區(qū)分出結(jié)核病患者。

2.4 Circ-IRAKM的功能預(yù)測及與活動性結(jié)核病的相關(guān)性分析 通過CircRNADb數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)Circ-IRAKM源自親本基因IRAK3第2-5號外顯子的反向剪切,其結(jié)構(gòu)上具有miRNA結(jié)合位點(圖5A),提示其可能通過miRNA吸附作用發(fā)揮調(diào)控作用。以Circ-IRAKM親本基因、miRNA靶點為關(guān)鍵詞輸入,經(jīng)GO/KEGG分析表明其可能通過NF-κB信號通路、炎性反應(yīng)、釋放細(xì)胞因子參與病原-宿主博弈過程(圖5B,5C)。由此提示,Circ-IRAKM不僅可作為活動性結(jié)核病患者診斷的潛在靶點,而且可能在結(jié)核病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

注:A為Circ-IRAKM靶基因miRNA的預(yù)測(僅顯示已報到與結(jié)核病相關(guān)的miRNA);B為Circ-IRAKM 靶基因miRNA的生物學(xué)功能預(yù)測;C為Circ-IRAKM 靶基因miRNA的信號通路預(yù)測。圖5 Circ-IRAKM的功能預(yù)測及與活動性結(jié)核的相關(guān)性分析Fig.5 Functional prediction of Circ-IRAKM and correlation analysis between Circ-IRAKM and active TB patients

注:A為曲線回歸分析活動性結(jié)核患者外周血中Circ-IRAKM的相對表達(dá)與單核細(xì)胞相關(guān)性;B為曲線回歸分析活動性結(jié)核患者外周血中Circ-IRAKM的相對表達(dá)與巨噬細(xì)胞相關(guān)性;“①”為P<0.05,“②”為P<0.01,“③”為P<0.001。圖6 Circ-IRAKM與活動性結(jié)核患者免疫細(xì)胞募集相關(guān)性分析Fig.6 Correlation analysis between Circ-IRAKM and recruitment of immune cells in active TB patients

2.5 Circ-IRAKM表達(dá)與活動性結(jié)核病患者免疫細(xì)胞募集相關(guān)性分析 收集60例活動性結(jié)核病患者的血常規(guī)檢查結(jié)果,通過斯皮爾曼雙變量相關(guān)性分析及曲線估算分析Circ-IRAKM的臨床相關(guān)性見表4。結(jié)果顯示,Circ-IRAKM相對表達(dá)與單核細(xì)胞相對值(單核細(xì)胞相對值40%～75%)、絕對值(單核細(xì)胞絕對值1.80～6.30,109/L)相關(guān)性無統(tǒng)計學(xué)意義,與巨噬細(xì)胞相對值(巨噬細(xì)胞相對值3.0%～10.0%)、絕對值(巨噬細(xì)胞絕對值0.1%～0.6%)呈顯著正相關(guān)(△CT值與表達(dá)水平相反)(圖6A、6B)。結(jié)果進(jìn)一步提示Circ-IRAKM能夠在結(jié)核病早期診斷中發(fā)揮重要作用,其可能參與結(jié)核病分枝桿菌與宿主巨噬細(xì)胞的相互作用和免疫反應(yīng)。

表4 斯皮爾曼雙變量分析外周血中Circ-IRAKM的相對表達(dá)與患者血常規(guī)指標(biāo)的相關(guān)性Tab.4 Spearman bivariate analysis of the relative expression of Circ-IRAKM in peripheral blood and the correlation between patients’ blood routine indexes

3 討 論

結(jié)核分枝桿菌可通過呼吸道進(jìn)行人與人之間傳播,如果感染了結(jié)核分枝桿菌,不到10%的感染者會出現(xiàn)結(jié)核病的臨床癥狀,而大多數(shù)人會發(fā)展為潛伏性結(jié)核病感染。因此,早期診斷對結(jié)核病的及時防治至關(guān)重要[12]。傳統(tǒng)的結(jié)核病診斷標(biāo)志物及方法在診斷過程中具有耗時長,儀器昂貴,檢測流程復(fù)雜等缺陷[13-14]。因此從宿主本身尋求特異性診斷標(biāo)志物具有重要意義。Circ-RNA是一種有別于傳統(tǒng)線性RNA的非編碼RNA,其特殊的共價閉環(huán)結(jié)構(gòu)決定其能夠通過多種機(jī)制發(fā)揮功能[15],作為臨床檢測診斷與預(yù)后的標(biāo)志物更具前景。然而能作為結(jié)核病診斷標(biāo)志物的Circ-RNA與篩選到差異表達(dá)的Circ-RNA相比寥寥可數(shù)[16-18]。因此,探究Circ-RNA在結(jié)核病發(fā)病機(jī)制中的潛在作用,可為結(jié)核病的臨床治療提供更多可能性。

本研究發(fā)現(xiàn)Circ-IRAKM在活動性結(jié)核病患者外周血中顯著上調(diào),ROC曲線分析結(jié)果證明其足以區(qū)分健康人群與結(jié)核病患者。Circ-IRAKM的結(jié)構(gòu)與其親本基因的相關(guān)性較強(qiáng)[19]。其親本基因白細(xì)胞介素-1受體相關(guān)激酶(IRAK)家族有4個成員組成分別為IRAK1、IRAK2、IRAKM、IRAK4,能夠介導(dǎo)來自TLR和白細(xì)胞介素-1受體的激活信號[20]。IRAKM是一種具有596個氨基酸,分子量為68 kDa的蛋白質(zhì)分子。IRAKM能夠通過阻止IRAK1,IRAK4與MyD88的解離以及IRAK1-TRAF6復(fù)合物的形成來進(jìn)行負(fù)調(diào)控作用,IRAKM的C端結(jié)構(gòu)域與TRAF6的相互作用至關(guān)重要,其具有1個TRAF6相互作用基序[21]。因此推測,Circ-IRAKM可能通過炎性反應(yīng)在結(jié)核病發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮調(diào)控作用。

環(huán)狀RNA上富含miRNA分子結(jié)合位點[22]。在Circ-IRAKM的靶基因miRNA預(yù)測中我們發(fā)現(xiàn)Hsa-miR-488、Hsa-miR-7、Hsa-miR-16-3p、Hsa-miR-146a-3p、Hsa-miR-146b-3p、Hsa-miR-27-5p都與結(jié)核病發(fā)病相關(guān),其很有可能通過親本基因進(jìn)行miRNA吸附作用發(fā)揮調(diào)控功能。對以上靶點基因進(jìn)行GO/KEGG分析,發(fā)現(xiàn)其通過NF-κB等炎癥反應(yīng)參與病原與宿主相互作用的關(guān)聯(lián)性較強(qiáng)[23],其中Hsa-miR-7被發(fā)現(xiàn)與TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-8和IL-10的細(xì)胞因子水平之間存在顯著相關(guān)性。但其具體調(diào)控機(jī)制尚不清楚[24]。這為Circ-IRAKM可能通過這些miRNA靶點參與結(jié)核病分枝桿菌感染后機(jī)體免疫應(yīng)答過程提供了依據(jù)。

與普遍表達(dá)的IRAK1、IRAK2、IRAK4相比,IRAKM的表達(dá)僅存在于單核細(xì)胞與巨噬細(xì)胞[25],我們的研究進(jìn)一步表明結(jié)核病患者外周血中Circ-IRAKM的表達(dá)水平與巨噬細(xì)胞的數(shù)量呈顯著正相關(guān),推測Circ-IRAKM會促進(jìn)感染部位巨噬細(xì)胞的大量募集。巨噬細(xì)胞作為抵御早期感染關(guān)鍵的免疫應(yīng)答的細(xì)胞,能夠根據(jù)感染微環(huán)境的變化做出相應(yīng)的免疫反應(yīng)。也就是說,結(jié)核分枝桿菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活決定了感染的結(jié)果和結(jié)核病的進(jìn)展[26]。據(jù)文獻(xiàn)報道,干擾IRAKM會導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌感染巨噬細(xì)胞中的細(xì)菌載量降低,同時可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M1型極化,抑制M2型極化[27]。因此,Circ-IRAKM不僅能夠為結(jié)核病早期診斷提供更多線索而且其在結(jié)核病發(fā)病機(jī)制中的作用也值得進(jìn)一步研究。

然而,目前我們的研究僅在結(jié)核病患者的外周血中驗證了Circ-IRAKM,而在其他疾病樣本中未進(jìn)行檢測,還不能說明其可獨立用于檢測結(jié)核病患者。因此,后續(xù)我們會收集其他疾病樣本進(jìn)行檢測比對,進(jìn)一步驗證Circ-IRAKM作為結(jié)核病早期診斷標(biāo)志物的特異性。

利益沖突：無