于 淼,耿英芝,張銘琰,張眉眉

沙門菌是自然界中最常見的人獸共患病原菌,是導致食源性疾病暴發(fā)的主要因素之一[1]。沙門菌易通過污染的蛋類、奶類和肉類等食物進入身體引發(fā)疾病。據(jù)報道,國內(nèi)多地多次暴發(fā)沙門菌引起的食物中毒事件[2-4]。沙門菌的流行具有地域性,不同地區(qū)流行的沙門菌分子特征和耐藥性也明顯不同。因此沙門菌之間的同源性鑒定對疾病的溯源有重要意義,可以借助脈沖場凝膠電泳(PFGE)技術(shù)來分析該地區(qū)沙門菌的流行病學特征。

由于養(yǎng)殖業(yè)的不合理使用抗菌藥物,加上耐藥株的廣泛傳播,導致沙門菌的耐藥現(xiàn)象日趨嚴重,并出現(xiàn)了多重耐藥的情況。其耐藥基因通過水平轉(zhuǎn)移的方式,最終進入對人致病或機會致病的病原體中[5],導致人類對沙門菌的耐藥譜不斷拓寬。本研究收集了2017-2021年遼寧省食品中分離出的沙門菌菌株,了解血清型分布、分子分型和耐藥性情況,為控制和治療食源性沙門菌引起的傳播和疾病提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 本研究的89株沙門菌來自2017-2021年遼寧省各市采集的市售食品,包括水產(chǎn)品、肉與肉制品、食用菌及其制品、蔬菜及其制品等6 069份樣品,按照GB4789.4-2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗沙門菌檢驗》檢驗方法[6]分離獲得,其中2017年7株、2018年9株、2019年8株、2020年55株和2021年10株。PFGE分子分型方法選用沙門菌H9812作為Marker菌株,藥敏試驗質(zhì)控菌株選用大腸埃希菌ATCC25922,所有菌株均保藏于遼寧省疾病預防控制中心微生物實驗室。

1.1.2 主要試劑與儀器 沙門菌科瑪嘉顯色培養(yǎng)基(CHROMAgar);GN生化鑒定卡(梅里埃);沙門菌診斷血清(日本生研);革蘭陰性需氧菌藥敏測試板(星佰);蛋白酶K(Sigma);Seakem Gold瓊脂糖(LONZA);10×TBE、EDTA、Tris-HCl等緩沖液(Promega公司);XbaⅠ限制性內(nèi)切酶(美國Promega公司);Gelred染液(美國BIOTIUM 公司),以上試劑均在有效期內(nèi)。比濁計(法國bioMrieux公司);CHEF-Mapper脈沖場電泳儀凝膠成像分析儀(美國Bio-Rad );GELDOC凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 分離培養(yǎng)及血清學鑒定 將各市上送的沙門菌株進行復核檢驗,所有菌株經(jīng)VITEK 2 Compact全自動細菌鑒定儀鑒定為沙門菌。采用玻片凝集法,根據(jù)國家標準GB4789.4-2016和沙門菌診斷血清說明書,對沙門菌株進行O相凝集反應和H相血清誘導分型,參照Kauffman-White沙門抗原表鑒定沙門菌血清型,沙門菌抗血清選用日本生研。

1.2.2 PFGE分子分型 參照國家食源性疾病監(jiān)測工作手冊中沙門菌PFGE分子分型標準方法。先將菌懸液調(diào)至4.0～4.5麥氏濁度,制備膠塊,后經(jīng)XbaI限制性內(nèi)切酶37 ℃ 酶切2 h;初始時間為2.16 s;終末時間為63.80 s,電泳時間19 h。取出膠塊后馬上放入Gelred染色液中震蕩染色25 min,用凝膠成像儀讀取圖譜。經(jīng)BioNumerics 7.6軟件對PFGE成像電泳圖譜結(jié)果進行聚類分析。聚類分析算法采用非加權(quán)算術(shù)平均組對方法(UPGMA),每條帶型間的相似度用Dice系數(shù)衡量,條帶位置差異容許度為1.5%,優(yōu)化值為1.5%,相似度100%認定為同一PFGE帶型。

1.2.3 藥物敏感性試驗 采用微量肉湯稀釋法測定最小抑菌濃度(MIC),實驗用10類15種抗微生物藥物包括氨芐西林(AMP)、氨芐西林/舒巴坦(AMS)、頭孢西丁(CFX)、頭孢唑啉(CFZ)、頭孢他啶(CAZ)、頭孢噻肟(CTX)、慶大霉素(GEN)、氯霉素(CHL)、亞胺培南(IMI)、四環(huán)素(TET)、阿奇霉素(AZI)、環(huán)丙沙星(CIP)、萘啶酸(NAL)、甲氧芐啶/磺胺甲惡唑(SXT)、多粘菌素E(CT)。將備檢菌株經(jīng)2次傳代培養(yǎng)后,制作0.5麥氏濁度菌懸液,取60 μL加入含有12 mL無菌營養(yǎng)肉湯的加樣槽中,充分混勻,然后用8通道微量移液器依次取100 μL稀釋菌液加入到除陰性對照孔外的95孔藥敏板中,陰性對照孔加無菌肉湯培養(yǎng)液100 μL,將接種后的藥敏板放置36 ℃溫箱16～18 h培養(yǎng),實驗結(jié)果參照2022版美國臨床和實驗室標準化委員會(CLSI)[7]制定的藥敏試驗執(zhí)行標準進行判定。

2 結(jié) 果

2.1 血清型分布 2017-2021年從遼寧省食品樣本中檢出的89株沙門菌分離自肉與肉制品、水產(chǎn)品、食用菌及其制品、蔬菜及其制品、蛋與蛋制品、水果及其制品6大類食品,其中肉與肉制品檢出率最高(7.9%),水產(chǎn)品檢出率次之(1.9%),血清型也主要分布在肉與肉制品中,見表1。

表1 食品中沙門菌檢出率及血清型分布Tab.1 Detection rate and serotype distribution of Salmonella in food

本研究中89株沙門菌共檢測到8個血清群、包含32種血清型。其中D群腸炎沙門菌檢出率略高為23.6%(21/89),其次為肯塔基沙門菌為16.8%(15/89),其它血清型菌株均低于10%。見表2。

表2 89株沙門菌的血清型分布特征Tab.2 Serotype distribution of 89 Salmonella isolates

2.2 PFGE分子分型 89株沙門菌經(jīng)XbaⅠ酶切后,得到帶型不一的PFGE圖譜,見圖1。根據(jù)電泳產(chǎn)生條帶的數(shù)量和位置的不同進行聚類分析,共發(fā)現(xiàn)81種帶型(把菌株間100%相似度判定為同一PFGE帶型),各帶型包含菌株數(shù)1～4株,相似度為47.4%～100%。同一血清型出現(xiàn)相差較遠的PFGE帶型,如鼠傷寒沙門菌、斯坦利沙門菌。部分里森沙門菌、肯塔基沙門菌、腸炎沙門菌均出現(xiàn)成簇現(xiàn)象。

圖1 89株沙門菌的脈沖場凝膠電泳分型聚類分析結(jié)果Fig.1 PFGE patterns of 89 Salmonella isolates

2.3 抗生素敏感性實驗結(jié)果 對89株沙門菌進行15種抗微生物藥物耐藥實驗,結(jié)果顯示,沙門菌對萘啶酸(NAL)的耐藥率最高,為52.8%(47/89),其主要來自于雞肉產(chǎn)品90.9%(30/33)。對四環(huán)素(TET)的耐藥率次之為37.1%(33/89),對氨芐西林(AMP)和頭孢唑林(CFZ)耐藥率均為24.7%(22/89)。有28株沙門菌對所有測試藥物均敏感(見表3)。有39株沙門菌分離株耐3類及3類以上藥物,共產(chǎn)生35種耐藥譜,多重耐藥率為43.8%(39/89),其中12株沙門菌分離株具4種藥物抗性,占比13.5%(12/89);4株沙門菌分離株具12種藥物抗性占4.5%(4/89),見表4。

表3 89株沙門菌對不同藥物的敏感性Tab.3 Antibiotic susceptibility of 89 Salmonella isolates

表4 沙門菌耐藥譜分布菌株數(shù)Tab.4 Distribution of drug-resistant Salmonella strains

本研究89株沙門菌耐藥結(jié)果顯示,血清型與耐藥性存在一定關(guān)聯(lián)。姆班達卡沙門菌、阿貢納沙門菌對抗生素均敏感;里森沙門菌對四環(huán)素100%(6/6)耐藥,腸炎沙門菌對萘啶酸95%(19/20)耐藥。檢出的15株肯塔基沙門菌多重耐藥譜4重到12重,其中對7種及7種以上抗生素耐藥占86.7%(13/15),耐藥狀況最為嚴重。

不同食品來源菌株的耐藥情況有所不同,肉及肉制品耐一種以上藥物為70%(49/70),水產(chǎn)品耐一種以上藥物為42.8%(6/15),蔬菜及其制品耐一種以上藥物為25%(1/4), 耐藥結(jié)果顯示, 肉及肉制品耐藥率較高、水產(chǎn)品次之。

3 討 論

本研究中經(jīng)血清鑒定分析,89株沙門菌共分8個血清群、總計32個血清型,結(jié)果顯示,食品中沙門菌血清型呈現(xiàn)多態(tài)性分布。其中以D群腸炎沙門菌為優(yōu)勢血清型,占比23.6%(21/89),且大部分于2020年分離得到。據(jù)報道,李欣等[8],吳春敏等[9]研究的食品和患者中的沙門菌血清型分布特征基本一致,均以腸炎沙門菌為主,本研究與耿英芝等[10]報道的2016-2020年遼寧省食源性疾病監(jiān)測結(jié)果相比較,沙門菌食品分離株與患者分離株血清型流行特征也一致,均以腸炎沙門菌為主。但是,相較于病源性分離株檢出的13種血清型,本次食品分離株檢出32種血清型,可見食品中血清型更為多樣化,了解遼寧省食品中沙門菌血清分布特征,有助于食源性疾病的防控工作。

沙門菌血清型的鑒定工作繁瑣,具有局限性,需要借助PFGE分子分型方法進一步研究沙門菌相同血清型間的基因同源性。PFGE一直被廣泛用于食源性疾病暴發(fā)溯源工作中,是當前分子流行病學應用的“金標準”[11],本研究顯示,與腸炎沙門菌較一致,部分血清型的沙門菌存在成簇現(xiàn)象,如肯塔基沙門菌、里森沙門菌,可見相同血清型的沙門菌之間PFGE帶型相似度較高,這與婁靜等[12]、姚素霞等[13]研究結(jié)果較一致。通過使用分子生物學技術(shù)和血清型鑒定分析,可較好用于疾病暴發(fā)溯源工作,為疾病防控提供科學依據(jù)。

本研究選取10類15種抗生素進行耐藥試驗,結(jié)果顯示,整體耐藥率為68.5%,菌株均有不同程度耐藥,某些菌株還存在多重耐藥問題,說明遼寧省地區(qū)食品中沙門菌耐藥情況不容樂觀。其中萘啶酸耐藥率最高為52.8%(47/89)、四環(huán)素耐藥次之為37.1%(33/89),這與廣州市2016-2018食品中的沙門菌對氨芐西林耐藥率為56.3%耐藥結(jié)果有所不同[14],但與胡豫杰等研究的2016年我國26個省沙門菌耐藥情況結(jié)果相吻合[15]。沙門菌感染臨床推薦用藥為喹諾酮類和三代頭孢類,但本研究中對一代喹諾酮類耐藥為52.8%(47/89),三代喹諾酮類耐藥率為21.3%(19/89),中介率也達34.8%(31/89),對三代頭孢類耐藥率為11.2%(10/89)和16.8%(15/89),提示本地區(qū)臨床用藥慎重選用喹諾酮類藥物。最敏感藥物為亞胺培南,耐藥率為0,這與多地區(qū)研究結(jié)果相似[15-16],分析原因可能與其在體內(nèi)穩(wěn)定性差,很少用于養(yǎng)殖業(yè)有關(guān)。本研究所采雞肉食品中萘啶酸耐藥率高達90.9%(30/33),多重耐藥情況十分嚴重,其中檢出的4株12種抗生素耐藥也均來自雞肉分割品,多重耐藥率為66.7%(22/33),可見本省禽類飼養(yǎng)行業(yè)存在不合理使用抗生素情況;多粘菌素已在2018年被禁止用于動物飼料添加劑,但本次研究中多粘菌素耐藥率為20.2%(18/89),提示我省還要加強對飼料添加劑的監(jiān)管。

沙門菌有2 500多種血清型,不同血清型的沙門菌對抗生素的耐藥譜不同,本研究89株沙門菌中檢出的15株肯塔基沙門菌對抗生素多重耐藥最為嚴重,經(jīng)綜合抗生素耐藥情況,如本地區(qū)發(fā)生肯塔基沙門菌引起的食源性疾病臨床可應用頭孢西丁及亞胺培南抗生素進行治療。本文中20株腸炎沙門菌19株對萘啶酸耐藥,耐藥率90.5%(19/21),對氨芐西林耐藥率也高達61.9%(13/21),同廣州市報道相符[17],推測為一代喹諾酮類和青霉素類的廣泛使用對細菌產(chǎn)生選擇壓力的結(jié)果。提示本地區(qū)應合理、規(guī)范使用抗生素,避免細菌耐藥的產(chǎn)生。

綜上所述,2017-2021年遼寧省檢出食品中沙門菌呈現(xiàn)出多種血清型,多種PFGE型及多種耐藥譜,高度散發(fā)狀態(tài)。尤其耐藥問題不容樂觀應引起各部門高度重視,需從生禽牲畜飼料添加的源頭抓起,守護好人民食品健康。同時進一步充實PFGE生物庫數(shù)據(jù),為因沙門菌引起的疾病暴發(fā)流行提供科學依據(jù)。

利益沖突：無