吳兆猛　趙瓊　吳玲玲　王祖華　余春芳　金志雄

摘要：目的 探討亞胺培南（IPM）對blaNDM-1陽性Escherichia coli耐藥性及其內膜secY、secE和secG轉錄水平的影響。方法 以重組質粒pET28a（+）-blaNDM-1轉化菌株E. coli DH5α-blaNDM-1和E. coli BL21（DE3）-blaNDM-1為研究對象，在梯度濃度增加或撤消IPM暴露下傳代培養(yǎng)菌株，檢測17種抗生素對IPM暴露菌株的MIC值；SDS-PAGE凝膠電泳檢測NDM-1表達；蛋白活性實驗檢測NDM-1活性；qRT-PCR檢測blaNDM-1及內膜secY、secE和secG轉錄水平。結果 12 μg/mL和020 μg/mL IPM暴露的E. coli DH5α-blaNDM-1菌株CFZ、CXM、FOX、CRO、CAZ、FEP等頭孢類藥物的MIC值（≥8 μg/mL/≥8 μg/mL、≥32 μg/mL/≥32 μg/mL、≥32 μg/mL/≥32 μg/mL、≥64 μg/mL/= 32 μg/mL、≥32 μg/mL/≥32 μg/mL、≥32 μg/mL/= 8 μg/mL）與0 μg/mL IPM暴露MIC值（≤2 μg/mL、= 16 μg/mL、≤8 μg/mL、≤1 μg/mL、≤4 μg/mL、≤2 μg/mL）相比均顯著增高，而IPM和MEM的MIC值與0 μg/mL IPM暴露（≤1 μg/mL和≤1 μg/mL）相比也顯著增高（=8 μg/mL/=8 μg/mL和=4 μg/mL/=4 μg/mL）。12 μg/mL和020 μg/mL IPM暴露的E. coli BL21（DE3）-blaNDM-1菌株FOX、CRO、FEP等頭孢類藥物的MIC值（≥32 μg/mL/≥32 μg/mL、≥64 μg/mL/≥64 μg/mL、= 16 μg/mL/= 16 μg/mL） 與0 μg/mL IPM暴露（≤8 μg/mL、≤1 μg/mL、≤2 μg/mL）相比也均顯著增高，而IPM和MEM的MIC值與0 μg/mL IPM暴露（≤1 μg/mL和≤1 μg/mL）相比也均顯著增高（≥16 μg/mL/≥16 μg/mL和≥16 μg/mL/≥16 μg/mL）。SDS-PAGE顯示，隨12 μg/mL IPM暴露時間的延長，菌株NDM-1水解IPM活性增加。qRT-PCR顯示，12 μg/mL IPM暴露的E. coli DH5α-blaNDM-1和E. coli BL21（DE3）- blaNDM-1的blaNDM-1、secY、secE和secG轉錄水平分別上調2.31/2.5、3.05/1.96、2.83/1.24和2.71/1.45倍。結論 IPM可使blaNDM-1陽性E. coli由碳青霉烯類敏感變?yōu)槟退幥冶３址€(wěn)定，細菌內膜SecYEG跨膜通道蛋白參與菌株耐藥性調控，這為認識抗生素壓力下腸桿菌科細菌耐藥性變化及指導臨床合理用藥提供理論支撐。

關鍵詞：亞胺培南；暴露；Escherichia coli；NDM-1；SecYEG

中圖分類號： R378.2+1文獻標志碼：A

The effects of imipenem on resistance to blaNDM-1 positive Escherichia coli and transcription levels of secY， secE and secG in intima

Wu Zhaomeng1， Zhao Qiong1， Wu Lingling2， Wang Zuhua3， Yu Chunfang1， and Jin Zhixiong1，2

（1 Department of Basic Medical Science， Hubei University of Medicine， Shiyan 442000;

2 Department of Clinical Laboratory， Dongfeng Hospital， Hubei University of Medicine， Shiyan， 442008;

3 Department of Blood Transfusion， Taihe Hospital， Hubei University of Medicine Shiyan， 442000）

Abstract Objective To investigate the effects of imipenem （IPM） on the resistance of blaNDM-1 positive Escherichia coli and the transcription levels of secY， secE and secG in intima. Method E. coli DH5α-blaNDM-1 and E. coli BL21（DE3）-blaNDM-1 transformed by recombinant plasmid pET28a（+）-blaNDM-1 were used as the research objects， and subcultured under the condition that the gradient concentration was increased or IPM exposure was canceled. The MIC values of 17 kinds of antibiotics against the IPM exposed strains were detected. The expression of NDM-1 was detected by SDS-PAGE gel electrophoresis. NDM-1 activity was detected by the protein activity test.? The transcription levels of blaNDM-1， secY， secE and secG in intima were detected by qRT-PCR. Result The MIC values of CFZ， CXM， FOX， CRO， CAZ， FEP， and other cephalosporins on E. coli DH5α-blaNDM-1 strain exposed by 12 μg/mL

and 020 μg/mL IPM（ ≥8 μg/mL/≥8 μg/mL， ≥32 μg/mL/≥32 μg/mL， ≥32 μg/mL/≥32 μg/mL， ≥64 μg/mL/= 32 μg/mL， ≥32 μg/mL/≥32 μg/mL， ≥32 μg/mL/= 8 μg/mL） were significantly increased， compared with 0 μg/mL IPM-exposed strain（≤2 μg/mL， = 16 μg/mL， ≤8 μg/mL， ≤1 μg/mL， ≤4 μg/mL， and ≤2 μg/mL） ，and the MIC values of IPM and MEM were also significantly increased （=8 μg/mL/=8 μg/mL and =4 μg/mL/=4 μg/mL）， compared with 0 μg/mL IPM-exposed strain （≤1 μg/mL and ≤1 μg/mL）. The E. coli BL21（DE3）-blaNDM-1 strain induced by 12 μg/mL and 020 μg/mL IPM （ ≥32 μg/mL/≥32 μg/mL， ≥64 μg/mL/≥64 μg/mL， =16 μg/mL/=16 μg/mL） were also significantly increased， compared with 0 μg/mL IPM-exposed strain （≤8 μg/mL， ≤1 μg/mL， ≤2μg/mL）. The MIC values of IPM and MEM were also significantly increased （≥16 μg/mL/≥16 μg/mL and ≥16 μg/mL/≥16 μg/mL）， compared with 0 μg/mL IPM-exposed strain （≤1 μg/mL and ≤1 μg/mL）. Compared with 0 μg/mL IPM-exposed strain， qRT-PCR showed the expression of blaNDM-1， secY， secE， and secG in E. coli DH5α-blaNDM-1 and E. coli BL21（DE3）-blaNDM-1 induced by 12 μg/mL IPM were increased by 2.31/2.5， 3.05/1.96， 2.83/1.24 and 2.71/1.45 times respectively. Conclusion IPM can make blaNDM-1 positive E. coli changed from carbapenem sensitive to drug resistant and remained stable， and SecYEG transmembrane channel protein in bacterial intima participated in the regulation of bacterial resistance， which provided theoretical support for understanding the change of Enterobacteriaceae bacterial resistance under antibiotic pressure and guiding clinical rational drug use.

Key words Imipenem; Expose; Escherichia coli; NDM-1; SecYEG

碳青霉烯類（carbapenems）是一類不被細菌β-內酰胺酶水解的主要用于對抗耐藥性細菌感染的非典型β-內酰胺類抗生素，如亞胺培南（imipenem，IPM）和美羅培南（meropenem，MEM）等。然而，自20世紀80年代英國和美國發(fā)現(xiàn)耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌以來，耐藥菌株遍布美洲、歐洲、亞洲和非洲等地區(qū)，碳青霉烯類的治療效果受到耐藥株攜帶的編碼碳青霉烯酶基因的挑戰(zhàn)[1-3]。根據(jù)Ambler分類法[4]（β-內酰胺酶末端的氨基端序列特征），β-內酰胺酶分為：A（TEM、SHV、CTX-M和KPC）、B（IMP、VIM、SPM、GIM、SIM和NDM）、C（CMY、DHA和ADC）和D（OXA）4種類型[5-11]。A、C和D類β-內酰胺酶的活性位點含有絲氨酸殘基。B類酶又稱金屬β-內酰胺酶（metallo-β-lactamases， MBLs），由染色體和質粒編碼，包括IMP、VIM、SPM、GIM、SIM、NDM、Bc11、Cpha、FEZ等[12]，酶分子的一級結構具有高變異性，氨基酸序列的同源性低于23%[13-14]。依據(jù)氨基酸序列的同源性，MBLs分3個亞群B1、B2和B3。其中，B1亞群是最大的MBLs，酶分子氨基酸同源性大于23%。MBLs的活性依賴于二價金屬離子（多為Zn2+），其活性中心的二價金屬離子結合組氨酸和半胱氨酸并與β-內酰胺環(huán)的羰基碳的酰胺鍵相互作用，水解青霉素類、頭孢菌素、頭霉素類和碳青霉烯類等抗生素。

2009年，Timothy等[15]發(fā)現(xiàn)了一種新型MBLs即新德里金屬-β-內酰胺酶（new delhi metallo-β-lactamase-1， NDM-1），NDM-1屬B1亞類酶，可水解除氨曲南以外的全部β-內酰胺類藥物，包括碳青霉烯類。編碼NDM-1的β-內酰胺酶基因（blaNDM-1）含有一個813 bp的開放閱讀框，GC含量為57%，有7個亞型，各亞型僅有1～2個氨基酸的差異，其水解酶活性差異不明顯。攜帶blaNDM-1質粒類型眾多（包括IncA/C、ColE、IncF、 IncFIA、IncFIB、 IncFII、IncHI1、IncHI3、IncL/M、IncN、IncN2、IncP、IncR、IncT、IncX1、IncX3、IncY等）（https：//cge.cbs.dtu.dk/services/PlasmidFinder/），blaNDM-1定位在轉座子、整合子或插入序列等移動元件中心區(qū)，伴隨有遺傳元件ISEc33、ISSen4、IS26、IS930或ISCR1及其它耐藥酶如OXA-48、VIM、AMP、ESBL、16S rRNA甲基酶、大環(huán)內脂酯酶和利福平修飾酶等基因，隨質粒在不同腸桿菌的種屬細菌間傳播[16-17]。

blaNDM-1翻譯后的未折疊狀NDM-1前蛋白，依靠動力蛋白SecA水解ATP提供的能量，穿過SecY、SecE和SecG蛋白構成的跨膜蛋白通道（SecYEG）輸出到周質[18] ，折疊并結合2個Zn2+成具有活性的NDM-1[19]，通過外膜囊泡運至膜外[20]（圖1）。

目前，攜帶blaNDM-1的質粒已經(jīng)在腸桿菌目細菌中廣泛傳播，包括肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumonia）、大腸埃希菌（Escherichia coli）、陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）和解鳥氨酸烏拉爾菌（Raoultella ornithinolytica）等[21-23]。研究表明，抗生素壓力是細菌染色體基因發(fā)生突變或潛伏基因（存在于染色體或質粒的低或無表達的基因）擴散從而增強細菌的抗藥性和毒力的動因[15， 24-26]。IPM暴露可促使blaNDM-1陽性耐碳青霉烯類菌株的耐藥性增強，且blaNDM-1的表達水平與IPM暴露濃度成正相關[27]。然而，IPM暴露菌株的耐藥穩(wěn)定性及其對細菌SecYEG跨膜通道蛋白的影響未見報道。為此，開展了IPM對blaNDM-1陽性E. coli耐藥性及其內膜secY、secE和secG轉錄水平影響的研究。結果顯示，經(jīng)IPM暴露的blaNDM-1轉化菌E. coli DH5α-blaNDM-1和E. coli BL21（DE3）-blaNDM-1均表現(xiàn)出可穩(wěn)定傳遞的耐IPM表型和基因型特性，而且IPM與blaNDM-1、secY、secE和secG的表達存在一定的關聯(lián)性，這為認識抗生素壓力下的腸桿菌科細菌耐藥性變化及指導臨床合理用藥提供一定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

K. pneumoniae TH-P12158（分離自湖北醫(yī)藥學院附屬太和醫(yī)院臨床患者痰液標本，IPM的MIC? 1 μg/mL，碳青霉烯類敏感）；E. coli DH5α、E. coli BL21（DE3）（購自南京諾唯贊生物科技有限公司）；E. coli DH5α-blaNDM-1、E. coli BL21（DE3）-blaNDM-1（攜帶blaNDM-1-pET28a（+）質粒的菌株，由本課題組構建并保存于湖北醫(yī)藥學院基礎醫(yī)學研究所）。

IPM（購買自Merck Sharp&Dohme Corp.U.S.A）溶液配制：溶解于PBS中至需要濃度，0.22 ?m濾器除菌，分裝放于-20℃冰箱?？敲顾豙購買自生工生物工程（上海）有限公司]溶液（100 mg/mL）配制：稱取1 g卡那霉素，加入10 mL ddH2O中完全溶解，0.22 ?m濾器除菌，分裝放于-20℃冰箱。異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG）溶液（1 mol/L）配制：稱取2.38 g IPTG，加入7 mL ddH2O中，溶解后加ddH2O至10 mL，0.22 ?m濾器除菌，放于-20℃冰箱。

1.2 菌株復活

分別取出-80℃冰箱保存的E. coli DH5α、E. coli BL21（DE3）、E. coli DH5α-blaNDM-1和E. coli BL21（DE3）-blaNDM-1菌株，室溫靜置2 h。取菌液劃線接種至LB固體培養(yǎng)基上，37℃，過夜培養(yǎng)細菌。

1.3 菌株傳代

挑選E. coli DH5α-blaNDM-1的單菌落于MH液體培養(yǎng)基中，37℃，200 r/min，培養(yǎng)12 h，然后將E. coli DH5α-blaNDM-1菌液按照1：100的比例加入到含有0 （不含IPM的對照）、0.25、0.5、1、2、4、8和12 μg/mL IPM的5 mL MH液體培養(yǎng)基中，37℃，200 r/min，按照增加的IPM濃度依次進行菌株的傳代培養(yǎng)（8～12 h內A600=1.5～2.0進行下一濃度傳代）。取12 μg/mL的IPM暴露的最后一代菌株，在無IPM液體培養(yǎng)基中連續(xù)傳代培養(yǎng)20代，本文中用020 μg/mL表示， A600=1.5～2.0。

E. coli BL21（DE3）-blaNDM-1菌株傳代方法同上。

2 藥物敏感性

2.1 抗菌活性

分別取E. coli DH5α-blaNDM-1和E. coli BL21（DE3）-blaNDM-1經(jīng)0和12 μg/mL的IPM暴露的最后一代細菌及020 μg/mL條件下的第20代細菌菌液的離心沉淀物（4℃， 3000 r/min）適量，1.5×108 CFU/mL。依據(jù)VITEK-2 compact微生物自動分析系統(tǒng)操作規(guī)程，檢測17種抗生素（包括IPM和MEM）的最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentation， MIC）。依據(jù)CLSI M100抗微生物藥物敏感性的標準（2022年第32版），抗菌活性結果判斷為敏感（susceptible， S）、中介（intermediate， I）和耐藥（resistant， R）。其中，亞胺培南的MIC≤1 μg/mL為敏感，1＜MIC＜4 μg/mL為中介，MIC≥4 μg/mL為耐藥。

同上述方法檢測17種抗生素抑制E. coli DH5α和E. coli BL21（DE3）生長的MIC值。

2.2 NDM-1的表達、分離和純化

取0和12 μg/mL IPM暴露的E. coli DH5α-blaNDM-1、E. coli BL21（DE3）-blaNDM-1菌株進行NDM-1的表達、分離和純化。所有培養(yǎng)基中都加入終濃度為100 ?g/mL的卡那霉素（保證無雜菌生長）。

取12 ?g/mL IPM暴露的E. coli BL21（DE3）-blaNDM-1菌液1 mL接種至100 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200 r/min，培養(yǎng)12 h。取菌液10 mL接種至1000 mL LB培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min，培養(yǎng)細菌至A600=0.4～0.6（約2 h），加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，16℃，200 r/min，培養(yǎng)20 h。4℃，12000 r/min離心10 min，保留菌體，加入15 mL PBS清洗2次，加入25 mL裂解緩沖液重懸菌體。冰浴。超聲30 min（200 W， 超聲3 s停5 s）。4℃，12000 r/min離心30 min，將上清轉移到離心管中，0.22 ?m濾器過濾，得細菌總蛋白。依據(jù)Ni NTA Beads 6FF說明書進行鎳柱親和層析純化NDM-1，用BCA測定試劑盒檢測純化后NDM-1濃度。取總蛋白和純化后的NDM-1進行SDS-PAGE凝膠電泳。

其他濃度IPM暴露的E. coli DH5α-blaNDM-1、E. coli BL21（DE3）-blaNDM-1菌株NDM-1的表達、分離和純化方法同上。

2.3 NDM-1的活性

以K. pneumoniae TH-P12158為受試菌株，檢測12 μg/mL IPM下E. coli DH5α-blaNDM-1、E. coli BL21（DE3）-blaNDM-1產(chǎn)生的NDM-1水解IPM的能力。依據(jù)BCA測定試劑盒操作說明，檢測菌液NDM-1濃度并制作標準曲線，如圖2所示。

False K. pneumoniae TH-P12158菌液：1.5×108 CFU/mL。NDM-1溶液：E. coli DH5α-blaNDM-1為5.31 mg/mL，E. coli BL21（DE3）-blaNDM-1為2.87 mg/mL。IPM溶液：以無菌生理鹽水為溶劑、IPM干粉為溶質配制640、320、160、80、40、20、10、5、2.5和1.25 μg/mL系列濃度的IPM溶液。

NDM-1活性實驗，NDM-1為30 μg，總體系為200 μL。實驗組：分別在10個孔中加入上述配制的不同濃度的IPM 20 μL，每孔加入E. coli DH5α-blaNDM-1的NDM-1溶液約5.65 μL（E. coli BL21（DE3）-blaNDM-1的NDM-1溶液約10.45 μL），最終加入K. pneumoniae TH-P12158菌液100 μL，加入MH液體培養(yǎng)基補足體積。對照組：每孔分別加入10個濃度的IPM 20 μL和K. pneumoniae TH-P12158菌液100 μL，加入MH液體培養(yǎng)基補足體積。每個對照組和實驗組設置3個復孔。37℃條件下進行孵育，用酶標儀檢測A600的變化，每隔4 h檢測一次，間隔4 h連續(xù)檢測6次（即4、8、12、16、20和24 h），計算IPM對K. pneumoniae TH-P12158的MIC值變化。

3 qRT-PCR

NCBI數(shù)據(jù)庫查詢blaNDM-1、secY、secE和secG的CDS序列并用Oligo 7.0設計其熒光定量引物（表1），采用TIANGEN RNA prep pure培養(yǎng)細菌/細胞總RNA提取試劑盒，分別提取0和12 μg/mL IPM暴露的E. coli DH5α-blaNDM-1和E. coli BL21（DE3）-blaNDM-1的總RNA。使用Toyobo反轉錄試劑盒進行反轉錄獲得cDNA，并將其作為模板進行實時熒光定量PCR （quantitative real-time PCR，qRT-PCR），檢測blaNDM-1、secY、secE和secG的mRNA轉錄水平。

4 統(tǒng)計學分析

采用GraphPad 7.0和SPSS 23.0進行數(shù)據(jù)分析，實驗重復次數(shù)均不少于3次，結果用x±s表示。組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

5 結果

5.1 抗菌活性

抗菌活性結果如表2所示，E. coli DH5α和E. coli BL21（DE3）對臨床常用17種抗生素均敏感，而接受了重組質粒blaNDM-1-pET28a（+）的E. coli DH5α-blaNDM-1和E. coli BL21（DE3）-blaNDM-1菌株顯示出頭孢類藥物MIC值增加，如前者的CXM （MIC=16 μg/mL， I）和后者的CFZ（MIC≥8μg/mL， R）、CXM（MIC≥32 μg/mL，R）、CAZ（MIC≥32 μg/mL， R）等。

表2顯示，與0 IPM暴露的菌株相比，12 μg/mL和020 μg/mL的IPM暴露的E. coli DH5α-blaNDM-1菌株頭孢類藥CFZ、CXM、FOX、CRO、CAZ、FEP（第一代到第四代）的MIC值均分別增高為≥8 μg/mL/≥8 μg/mL、≥32 μg/mL/≥32 μg/mL、≥32 μg/mL/≥

32 μg/mL、≥64 μg/mL/=32 μg/mL、≥32 μg/mL/≥

32 μg/mL、≥32 μg/mL/ = 8 μg/mL。同時，IPM和MEM的MIC值均分別增高為8 μg/mL/4 μg/mL和

8 μg/mL/4 μg/mL。E.coli BL21（DE3）-blaNDM-1菌株MIC值（≥8 μg/mL/≥8 μg/mL、≥32 μg/mL/≥32 μg/mL、≥32 μg/mL/≥32 μg/mL、≥64 μg/mL/≥64 μg/mL、≥32 μg/mL/≥32 μg/mL、=16 μg/mL/= 16μg/mL）也均顯著增高，而IPM和MEM的MIC值也均顯著增高

（≥16 μg/mL/≥16 μg/mL和≥16 μg/mL/≥16 μg/mL）。

5.2 NDM-1的表達、分離與純化

圖3顯示，在25～48 kDa之間，E. coli DH5α-blaNDM-1或E. coli BL21（DE3）-blaNDM-1蛋白圖譜的豐富度和含量均較E. coli DH5α或E. coli BL21（DE3）明顯增強，12 μg/mL IPM暴露菌株相比較0 IPM暴露菌株又有顯著增強。同時，12 μg/mL IPM暴露的E.coli DH5α-blaNDM-1或E.coli BL21（DE3）-blaNDM-1菌株均顯示32 kD蛋白條帶，而0 IPM暴露菌株均未表達出NDM-1條帶。

5.3 NDM-1的活性

NDM-1存在下，IPM對K. pneumoniae TH-P12158的MIC值變化如表3所示，12 ?g/mL的IPM暴露E. coli DH5α-blaNDM-1和E. coli BL21（DE3）-blaNDM-1分泌 NDM-1水解IPM，使后者的MIC值均由反應4 h時的4 ?g/mL增加至24 h時的16 ?g/mL，這說明純化得到的NDM-1的活性較好。

5.4 qRT-PCR

菌株blaNDM-1 mRNA轉錄水平如圖4所示，12 μg/mL IPM暴露E. coli DH5α-blaNDM-1和E. coli BL21（DE3）-blaNDM-1菌株的blaNDM-1轉錄水平分別是0 IPM的2.3倍（P<0.001）和2.5倍（P<0.01）。2株E. coli在12 μg/mL IPM的暴露下，blaNDM-1mRNA轉錄水平都有顯著上調，這預示NDM-1表達量有明顯增加。

隨著IPM濃度由0增加到12 μg/mL，E. coli DH5α-blaNDM-1的secY增加了3.05倍（P<0.05）（圖5A）、secE增加了2.83倍（P<0.05）（圖5B）和secG增加了2.71倍（P<0.05）（圖5C）；E. coli BL21（DE3）-blaNDM-1的secY增加了1.96倍（P<0.05）（圖5D）、secE增加了1.24倍（P< 0.05）（圖5E）和secG增加了1.45倍（P< 0.05） （圖5F）。

6 討論

K. pneumoniae和E. coli是社區(qū)和醫(yī)院獲得性感染的重要病原菌，也是常見的多重耐藥性細菌。K. pneumoniae和E. coli普遍攜帶多種類型的β-內酰胺酶基因如blaTEM、blaSHV、blaCTX-M、blaKPC和blaNDM-1等，這些基因存在于染色體或質粒上，賦予細菌耐藥特性[21，29-32]。攜帶blaNDM-1基因的質粒通常大于100 kb，質粒類型包括IncA/C、IncX3或IncF等[33]。有研究認為，宿主兼容性使blaNDM-1質粒多見于K. pneumoniae，很少存在E. coli中[29]。E. coli DH5α-blaNDM-1和E. coli BL21（DE3）-blaNDM-1是2株自然轉接blaNDM-1-pET28a （+）質粒的菌株，在無IPM壓力下（IPM，0），2株菌顯示出部分頭孢類藥物MIC值增高（如CXM、CFZ和CAZ等）（表2），這提示blaNDM-1在E. coli中進行了低水平不足于引起臨床耐藥的NDM-1表達。同時，blaNDM-1-pET28a （+）質粒構建菌株在普通培養(yǎng)基中顯示出快速的生長狀態(tài)，這體現(xiàn)了blaNDM-1質粒在E. coli中較強的宿主兼容性和水平傳播的能力。

抗生素被認為是加速耐藥基因轉移的最重要推動力，它們對細菌施加的選擇性壓力促使染色體基因發(fā)生突變或潛伏基因擴散，從而增強細菌的抵抗力和毒力[24，26，30，34]。研究表明[27，31，35]，低于MIC值的IPM可使blaNDM-1陽性菌的耐藥表型（MIC）和基因型（blaNDM-1）增加。本研究發(fā)現(xiàn)，低濃度IPM（0.25、0.5、1和2 μg/mL）暴露的菌株初始生長緩慢（12～24 h），3～4次傳代后生長迅速（8～12 h）；高濃度IPM（4、8和12 μg/mL）暴露的菌株初次生長極為緩慢（＞48 h），需要傳代10～12次才能正常生長（10～12 h）（數(shù)據(jù)未顯示）。MIC值、NDM-1和blaNDM-1轉錄水平等數(shù)據(jù)顯示（表2、圖3～4），12 μg/mL的IPM顯著提高blaNDM-1表達及NDM-1水解IPM能力。表2也顯示，撤消IPM并不影響12 μg/mL IPM暴露菌株的耐藥性。無論是12或020 μg/mL，IPM暴露菌株均產(chǎn)生了交叉耐藥性，而且這種耐藥性存在可遺傳特性。交叉耐藥性是一種對特定藥物產(chǎn)生耐藥性同時導致對另一種藥物產(chǎn)生耐藥性的現(xiàn)象[32]。E. coli DH5α-blaNDM-1和E. coli BL21（DE3）-blaNDM-1對IPM和其它未暴露抗生素表現(xiàn)出強的耐藥性（表2），如12 μg/mL IPM暴露的E. coli DH5α-blaNDM-1和E. coli BL21（DE3）-blaNDM-1菌株對MEM（碳青霉烯類）、CFZ、CXM、FOX、CRO、CAZ、FEP（第一、第二、第三、第四代）的MIC值均顯著增高。此外，撤消IPM后菌株保持二十代耐藥譜不變。綜合分析IPM暴露細菌的生長、耐藥表型和基因型數(shù)據(jù)，認為IPM暴露促使菌株適應壓力環(huán)境、增強耐藥酶活性，而撤消IPM并不影響菌株持久的、不可逆的耐藥性，其可能原因是產(chǎn)生染色體基因突變和blaNDM-1高表達菌株。有研究者認為[36]，存在于E. coli內的NDM-1前蛋白可以通過SecYEG跨膜通道轉運，其blaNDM-1也可以通過此方式進行運輸，blaNDM-1和NDM-1都被外膜囊泡包裹后轉運細菌外膜上，這不能排除囊泡內的blaNDM-1促使基因水平傳播的可能。

無論blaNDM-1協(xié)同其它耐藥基因或blaNDM-1單一基因，細菌內膜SecYEG跨膜通道是NDM-1前蛋白易位至周質的關鍵孔道?，F(xiàn)有研究無法確定IPM是否特異性促使blaNDM-1表達或者只是一種抗生素壓力因子，但IPM對SecYEG跨膜通道產(chǎn)生了一定的影響。本研究顯示，相比較0、12 μg/mL IPM暴露E. coli DH5α-blaNDM-1和E. coli BL21（DE3）- blaNDM-1的secY、secE和secG轉錄水平分別增加了3.05/1.96、2.83 /1.24和2.71/1.45倍（P<0.05）（圖5）。推測IPM可能促使菌株mRNA轉錄改變提高SecY、SecE和SecG蛋白量或功能促使更多的NDM-1前蛋白快速到達周質結合Zn2+，增強NDM-1酶的水解能力，但是，這需要進一步深入探究。

面對blaNDM-1在全世界的廣泛傳播性及其對抗生素的多重耐藥性的現(xiàn)狀，控制blaNDM-1的傳遞、NDM-1表達及其活性將十分關鍵。我們的研究顯示IPM暴露下的blaNDM-1、NDM-1和SecYEG跨膜通道等三者之間存在一定的關聯(lián)性，這為選擇抗菌藥物靶點提供了新思路。

參 考 文 獻

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收稿日期：2022-11-14

基金項目：湖北省衛(wèi)生健康委項目（No. WJ2021F049）；“十四五”湖北省高等學校優(yōu)勢特色學科群（生物與醫(yī)藥）項目資助

（No. 2022BMXKQY1）

作者簡介：吳兆猛，男，生于1998年，在讀碩士研究生，主要研究方向為細菌耐藥機制與院內感染控制，E-mail： wuzhaomeng2833@163.com

*通信作者，E-mail： Jzx8801150@126.com