金鑫 秦娜 范思洋 楊玉雷 郭雅俊

摘要：目的 分離與鑒定多拉菌素中有機雜質(zhì)，對改進生產(chǎn)工藝，提高產(chǎn)品質(zhì)量具有重要意義。方法 采用制備液相色譜技術(shù)，對多拉菌素中有機雜質(zhì)進行分離制備，并通過質(zhì)譜和核磁共振技術(shù)鑒定雜質(zhì)結(jié)構(gòu)。結(jié)果 經(jīng)制備液相分離得到5個主要雜質(zhì)，經(jīng)核磁共振光譜和質(zhì)譜分析鑒別為12-乙基多拉菌素，14-去甲基多拉菌素，5-甲氧基多拉菌素，5-酮多拉菌素和25-環(huán)己基-阿維菌素B2。其中12-乙基多拉菌素未見文獻報道。結(jié)論 建立了多拉菌素有機雜質(zhì)的制備方法，并進行了結(jié)構(gòu)鑒定，為多拉菌素的質(zhì)量控制提供了參考。

關(guān)鍵詞：多拉菌素；分離制備；雜質(zhì)；結(jié)構(gòu)鑒定；高效液相色譜；質(zhì)譜；核磁共振

中圖分類號：R978.1 ?文獻標志碼：A

Isolation and identification of impurities in doramectin

Jin Xin1， Qin Na1， Fan Siyang2， Yang Yulei2， and Guo Yajun2

（1 Zhejiang Jinhua Conba Bio-pharm Co.， Ltd.， Jinhua 321016; 2 State Key Lab of New Drug & Pharmaceutical Process， Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry， China State Institute of Pharmaceutical Industry， Shanghai 201203）

Abstract ? ?Objective To separate and identify main organic impurities in doramectin and improve the production process and product quality. Methods The organic impurities of doramectin were enriched by the semi-preparative liquid chromatography. The nuclear magnetic resonance spectrum and mass spectrum analysis were used to identify the structures of the impurities. Results Five impurities were obtained by the preparative liquid chromatography. By MS and NMR analysis， the impurities were identified as 12-ethyldoramectin， 14-demethyldoramectin， 5-methoxydoramectin， 5-ketodoramectin， and 25-cyclohexy-avermectin B2. 12-ethyldoramectin was newly identified. Conclusion The method of preparing organic impurities was developed， and the structures were identified. This research provides a reference for the quality control of doramectin.

Key words Doramectin; Separation and preparation; Impurities; Structure identification; HPLC; MS; NMR

寄生蟲感染是畜牧業(yè)面臨的重要問題之一。阿維菌素（avermectin，圖1），發(fā)現(xiàn)于鏈霉菌的培養(yǎng)液中，對寄生蟲具有優(yōu)異的活性。經(jīng)研究，阿維菌素的基本結(jié)構(gòu)是一個十六元內(nèi)酯環(huán)，其上連接有3個主要基團：六氫化苯并呋喃（C-2到C-8），二糖基（C-13）和螺酮縮醇系統(tǒng)（C-17到C-28）。天然的阿維菌素有8種組分。根據(jù)C-5位上取代基的不同，C-22和C-23之間單雙鍵的差異及C-25位上取代基的不同，分別用A，B；1，2和a，b的組合來表示，分別命名為A1a、A1b、A2a、A2b、B1a、B1b、B2a和B2b。其中B1的活性最優(yōu)，尤其是B1a組分的殺蟲效果最佳[1]，其他異構(gòu)體抗寄生蟲活性低且毒性高[2]。商品化阿維菌素為B1a與B1b的混合物。

目前，相繼報道了通過突變生物合成生產(chǎn)新型阿維菌素衍生物。多拉菌素（25-環(huán)己基阿維菌素B1， doramectin， DOR）作為第三代阿維菌素衍生物，是高效廣譜的驅(qū)蟲藥，見圖2。與阿維菌素相比，在動物體內(nèi)吸收迅速、體內(nèi)分布容積大、消除緩慢，具有明顯的長效性，更高殺寄生蟲活性[3]。阿維菌素菌bkdFGH缺失突變株發(fā)酵過程中添加環(huán)己羧酸時，突變株將以加入的環(huán)己羧酸為起始物合成多拉菌素。

在光照條件下，多拉菌素穩(wěn)定性差，將轉(zhuǎn)化為 8，9-Z異構(gòu)體[4-5]或5-酮多拉菌素[6]。除此之外，多拉菌素相關(guān)雜質(zhì)報道較少。為保證產(chǎn)品質(zhì)量，本文以對多拉菌素主要雜質(zhì)1～5（圖3和表1）進行了分離收集，并采用質(zhì)譜與核磁共振技術(shù)進行了結(jié)構(gòu)確證（見圖4），可供該品種理化性質(zhì)研究和質(zhì)量標準制定參考。制備所用樣品為多拉菌素粗品結(jié)晶母液。

1 ?材料與儀器

多拉菌素粗品結(jié)晶母液（浙江金華康恩貝生物制藥有限公司，批號：LI20180703）；乙腈（色譜純，Admas公司）；甲醇（色譜純，Admas公司）；蒸餾水（自制）；CDCl3（Sigma-Aldrich公司）；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

Agilent 1260型高效液相色譜系統(tǒng)（紫外檢測器）；Thermo U3000型高效液相色譜系統(tǒng)（紫外檢測器）；Waters 6000型半制備色譜儀（2489紫外檢測器）；Waters XEVO G2-XS Qtof質(zhì)譜檢測器；Varian INOVA-500 MHz核磁共振儀。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Poroshell 120 EC-18色譜柱（50 mm × 4.6 mm， 2.7 μm）；流動相：甲醇-乙腈-水（15：70：15，V/V/V）；等度洗脫；流速：0.6 mL/min；檢測波長：245 nm；柱溫：30℃；進樣量：10 μL。

2.2 制備色譜條件

色譜柱：Sunfire Prep C18 OBD色譜柱

（150 mm×19 mm， 5 μm）；流動相：甲醇-乙腈-水（65：10：25，V/V/V）；等度洗脫；流速：2 mL/min；檢測波長：245 ?nm。在該制備條件下，雜質(zhì)1為8.5 min，雜質(zhì)2為6.3 min，雜質(zhì)3為11.7 min，雜質(zhì)4為9.8 min，雜質(zhì)5為3.3 min。

2.3 結(jié)構(gòu)確證

2.3.1 12-乙基多拉菌素（雜質(zhì)1）

雜質(zhì)1分子離子表現(xiàn)為m/z 913.5313 [M+H]+ （calcd. for C51H77O14： 913.5313），確定分子式為C51H76O14，提示其有14個不飽和度。質(zhì)譜圖見附圖1。

雜質(zhì)1經(jīng)核磁共振光譜分析，13C NMR和1H NMR數(shù)據(jù)見表2。

從13C NMR譜（表2）可以看出，低場有一羰基碳信號（δC =173.74）。10個sp2雜化碳信號，證明結(jié)構(gòu)中含有5個碳碳雙鍵。以及8個環(huán)狀結(jié)構(gòu)。通過對比雜質(zhì)1和doramectin 13C NMR譜[7]發(fā)現(xiàn)，雜質(zhì)1可能具有doramectin母核結(jié)構(gòu)。通過HMBC和1H-1H COSY譜，對化合物母核上的碳氫信號進行歸屬，發(fā)現(xiàn)H-12（δH=2.13），C-12（δC=47.34），12-CH2-CH3（δH=0.91， δC=12.22）與doramectin H-12（δH =2.53），C-12（δC=39.94），14-CH3（δH=1.17， δC=20.43）相比，化學(xué)位移差異較大。并且，1的分子量與doramectin相比，相差14，提示1結(jié)構(gòu)中可能多了一個亞甲基。12-CH2-CH3質(zhì)子信號裂分成三重峰，耦合常數(shù)J=6.9 Hz，提示甲基與亞甲基相連。通過1H?1H COSY譜δH=0.91與δH=1.46， 1.18相關(guān)，證明結(jié)構(gòu)中乙基的存在。根據(jù)HMBC譜，δH =0.91與δC=67.30（C-12）相關(guān)，δH =1.46，1.18與δC136.74（C-11），80.41（C-13）相關(guān)，表明乙基連接在C-12位上。1H-1H COSY譜δH=1.46，1.18與δH=2.13相關(guān)；δH=2.13與δH=4.04，5.67相關(guān)。證明了上述推測。將1H NMR，13C NMR化學(xué)位移進行歸屬，將氫譜裂分及HMBC相關(guān)情況進行總結(jié)見表2。最后，確定雜質(zhì)1平面結(jié)構(gòu)如圖4所示。

2.3.2 14-去甲基多拉菌素（雜質(zhì)2）

雜質(zhì)2分子離子表現(xiàn)為m/z 885.5004 [M+H]+ （calcd. for C49H73O14： 885.5000），確定分子式為C49H72O14，提示其有14個不飽和度。質(zhì)譜圖見附圖2。

雜質(zhì)2經(jīng)核磁共振光譜分析，13C NMR和1H NMR數(shù)據(jù)見表3。

通過對比雜質(zhì)2和doramectin 13C NMR譜[7]發(fā)現(xiàn)，雜質(zhì)2可能具有doramectin母核結(jié)構(gòu)。通過HMBC和1H?1H COSY譜，對化合物母核上的碳氫信號進行歸屬，發(fā)現(xiàn)C-13（δC=77.61）， C-14（δC =132.27）， C-15（δC =124.43）， C-16（δC =39.40），H-14（δH=5.25）， H-15（δH=5.21）， 與doramectin C-13（δC=81.92），C-14（δC =135.20， 季碳）， C-15（δC=118.38）， C-16（δC=34.56），H-15（δH =5.00）相比，化學(xué)位移差異較大。并且缺少C-14-CH3信號。雜質(zhì)2分子量與doramectin分子量相比，減少14。HSQC譜中，雜質(zhì)2 C-14顯示為叔碳信號。以上信息提示2結(jié)構(gòu)中，在14位可能少了1個甲基。HMBC譜顯示H-14與C-13，16相關(guān)；H-16與C-14相關(guān)。1H?1H COSY譜顯示H-13與H-12，14相關(guān)；H-14與H-13， 15相關(guān)；H-15與H-16相關(guān)。由此驗證，雜質(zhì)2結(jié)構(gòu)在doramectin基礎(chǔ)上，在14位缺少1個甲基。

H-14，15構(gòu)型確認：從HSQC譜可以看出，H-14與H-15信號有部分重疊（附圖3），為H-14和H-15的一級裂分情況分析造成一定困難。H-14較H-15稍微偏低場。如附圖4所示，H-14裂分為dd峰，耦合常數(shù)J=15.8， 9.6 Hz；H-15裂分為dt峰，耦合常數(shù)J=15.8， 10.7 Hz。由此推斷H-14與H-15之間耦合常數(shù)為15.8 Hz。因此，H-14和H-15為反式（trans）結(jié)構(gòu)。

最后，確定化合物平面結(jié)構(gòu)如圖4所示，為已知化合物[8]。

2.3.3 5-甲氧基多拉菌素（雜質(zhì)3）

雜質(zhì)3分子離子表現(xiàn)為m/z 913.5313 [M+H]+ （calcd. for C51H77O14： 913.5313），確定分子式為C51H76O14，提示其有14個不飽和度。質(zhì)譜圖見附圖5。

雜質(zhì)3經(jīng)核磁共振光譜分析，13C NMR和1H NMR數(shù)據(jù)見表4。

從13C NMR譜（表4）可以看出，低場有1個羰基碳信號（δC=173.91）。10個sp2雜化碳信號，證明結(jié)構(gòu)中含有5個碳碳雙鍵。以及8個環(huán)狀結(jié)構(gòu)。通過對比化合物和doramectin 13C NMR譜[1]發(fā)現(xiàn)，化合物可能具有doramectin母核結(jié)構(gòu)。通過HMBC和1H-1H COSY譜，對化合物母核上的碳氫信號進行歸屬，發(fā)現(xiàn)H-5（δH=3.97），C-5（δC=76.92）與doramectin H-5（δH=4.295），C-5（δC=67.91）相比，化學(xué)位移差異較大。并且，該化合物的分子量與doramectin相比，相差14。此外，該化合物13C NMR譜多了1個甲氧基信號（δC=57.81）。提示化合物結(jié)構(gòu)中可能多了一個甲氧基，且與C-5相連。根據(jù)HMBC譜，δH=3.51（5-OMe）與δc=76.92（C-5）相關(guān)，δH=3.97（H-5）與δc=57.81（5-OMe）相關(guān)，表明甲氧基連接在C-5位上。證明了上述推測。將1H，13C-NMR化學(xué)位移進行歸屬，將氫譜裂分及HMBC相關(guān)情況進行總結(jié)。最后，確定化合物平面結(jié)構(gòu)如圖4所示，為已知化合物[9]。

2.3.4 5-酮多拉菌素（雜質(zhì)4）

雜質(zhì)4分子離子表現(xiàn)為m/z 897.5004 [M+H]+ （calcd. for C50H73O14： 897.5000），提示該化合物有15個不飽和度。質(zhì)譜圖見附圖6。

雜質(zhì)4經(jīng)核磁共振光譜分析，13C NMR和1H NMR數(shù)據(jù)見表5。

從13C NMR譜可以看出，低場有2個羰基碳信號（δC=172.20， 192.11）。10個sp2雜化碳信號，證明結(jié)構(gòu)中含有5個碳碳雙鍵。以及8個環(huán)狀結(jié)構(gòu)。通過對比化合物和doramectin 13C NMR譜[1]發(fā)現(xiàn)，化合物可能具有doramectin母核結(jié)構(gòu)。通過HMBC和1H-1H COSY譜，對化合物母核上的碳氫信號進行歸屬，發(fā)現(xiàn)缺少C-5（δC=67.91）信號。多了羰基碳信號（δC=192.11）。并且，該化合物的分子量與doramectin相比，相差2。提示化合物結(jié)構(gòu)中原本doramectin 5位羥基可能被氧化成酮羰基。根據(jù)HMBC譜，δH=6.57（H-3）， δH=3.85（H-6）與δc=192.11相關(guān)，表明C-5為酮羰基碳。證明了上述推測。將1H， 13C NMR化學(xué)位移進行歸屬，將氫譜裂分及HMBC相關(guān)情況進行總結(jié)。最后，確定化合物平面結(jié)構(gòu)如圖4所示，為已知化合物[6]。

2.3.5 25-環(huán)己基-阿維菌素B2（雜質(zhì)5）

雜質(zhì)5分子離子表現(xiàn)為m/z 917.5262 [M+H]+（calcd. for C50H77O15： 917.5262），提示該化合物有13個不飽和度。質(zhì)譜圖見附圖7。

雜質(zhì)5經(jīng)核磁共振光譜分析，13C NMR和1H NMR數(shù)據(jù)見表6。

從13C-NMR譜可以看出，低場有1個羰基碳信號（δC=173.60）。8個sp2雜化碳信號，證明結(jié)構(gòu)中含有4個碳碳雙鍵。以及8個環(huán)狀結(jié)構(gòu)?；衔锱cdoramectin相比，分子量多18。通過對比化合物和doramectin 13C-NMR譜7發(fā)現(xiàn)，化合物可能具有doramectin母核結(jié)構(gòu)。與doramectin相比，化合物缺少22和23位碳碳雙鍵。通過HMBC和1H?1H COSY譜，對化合物母核上的碳氫信號進行歸屬，發(fā)現(xiàn)H-23（δH=3.75），C-23（δC=69.90），H-22（δH=1.61，1.96），C-22（δC=41.10）與doramectin H-23（δH=5.74），C-23（δC=136.40），H-22（δH=5.54），C-22（δC=127.93）相比，化學(xué)位移差異較大。提示，可能化合物為doramectin與一分子H2O發(fā)生加成后產(chǎn)物，且加成位于22位雙鍵。此外，根據(jù)HMBC譜，δH=0.90（24-CH3）與δC=69.90（C-23）， δC=35.08（C-24）， δC=72.52（C-25）相關(guān)，證明了上述推測。將1H，13C-NMR化學(xué)位移進行歸屬，其核磁數(shù)據(jù)與文獻報道的完全一致[7]，為已知化合物25-環(huán)己基-阿維菌素 B2。根據(jù)研究結(jié)果，將雜質(zhì)1～5定入質(zhì)量標準，單獨控制，提高了多拉菌素的安全性和質(zhì)量可控性。

參 考 文 獻

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