摘 要：為了優(yōu)選玉參花飲料（Yushenhua beverage，YSH）的最佳提取工藝，以總多糖、黨參炔苷和綠原酸含量的多指標(biāo)加權(quán)綜合評分為評價指標(biāo)，用苯酚硫酸法測定其多糖含量，采用高效液相色譜法測定其黨參炔苷和綠原酸含量。在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken效應(yīng)面法，對YSH原料的浸泡時間、料液比和提取時間等工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，得到Y(jié)SH的最佳提取工藝為：浸泡時間15 min、料液比1∶14 g/mL、1∶12 g/mL，提取時間60 min、40 min，此條件下優(yōu)選的玉參花飲料提取工藝合理可行。

關(guān)鍵詞：玉參花飲料；提取工藝；總多糖；黨參炔苷；綠原酸

中圖分類號：TS275

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

收稿日期：2023-12-22

基金項目：邵陽市科技創(chuàng)新計劃指導(dǎo)性項目（2023ZD0072）；湖南省自然科學(xué)基金項目（2022JJ50026）；湖南省普通高等學(xué)?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊支持項目資助（湘教通〔2023〕233號）；邵陽學(xué)院研究生科研創(chuàng)新項目（CX2022SY076）

作者簡介：歐陽香，女，碩士研究生，從事生物與醫(yī)藥研究；E-mail：1761668664@qq.com

通信作者：李成艦，男，博士，教授，從事藥用植物功能成分開發(fā)利用研究；E-mail：413874272@qq.com

Study on the extraction process of Yushenhua beverage

OUYANG Xiang1，2， ZHONG Liming2，WANG Jiahui2， YANG Peiqin2， LU Yangjie2， CHEN Zhou2， LI Chengjian2

（1. School of Food and Chemical Engineering， Shaoyang University， Shaoyang 422000， China;

2. Hunan Engineering Research Center of Development and Utilization of Traditional Chinese Medicine in Southwest Hunan， Shaoyang 422000， China）

Abstract： To optimize the extraction process of Yushenhua beverage （YSH）， the multi-indicator weighted scores of total polysaccharides， lobetyolin and chlorogenic acid content were used as the evaluation index. The polysaccharides content was determined by the phenol-sulfuric acid method. The content of lobetyolin and chlorogenic acid was determined by high-performance liquid chromatography method. Based on the one-factor test， the soaking time， material-to-liquid ratio， and extraction time of YSH raw materials were optimized by Box-Behnken response surface methodology. The optimal extraction process of YSH was determined as follows： soaking time of 15 minutes， material-to-liquid ratio of 1∶14 g/mL and 1∶12 g/mL， and extraction time of 60 minutes and 40 minutes. The preferred extraction process of YSH beverage was found to be reasonable and feasible under these conditions.

Key words： Yushenhua beverage （YSH）; extraction process; total polysaccharides; lobetyolin; chlorogenic acid

玉參花飲料（Yushenhua beverage，YSH）由藥食同源中藥玉竹、黨參和山銀花通過提取主要成分而成，具有益氣健脾、滋陰潤肺、養(yǎng)血生津的功效，可用于氣陰兩虛之證。據(jù)報道，玉竹含有多糖、皂苷和黃酮類物質(zhì)等，具有免疫調(diào)節(jié)和抗炎等多種藥理作用［1］；黨參含有多糖類、苷類等活性成分，具有調(diào)節(jié)血糖、抗疲勞、降壓和增強(qiáng)免疫力等療效［2］；山銀花含有機(jī)酸類、黃酮類、三萜皂苷類等化合物，具有抗菌、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)等作用［3］。為了增加玉竹、黨參和山銀花在食品領(lǐng)域的應(yīng)用途徑，提高中藥材附加值，本文研究玉參花飲料的提取工藝，優(yōu)化其提取工藝條件，為玉參花飲料的研制和推廣應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 儀器與設(shè)備

EasySep-1020液相色譜儀，色譜柱為GS-120-5-C18-AP （4.6 mm×250 mm，5 μm）（上海通微分析技術(shù)有限公司）；UV-1800PC紫外-可見分光光度計（上海美析儀器有限公司）；AL204分析天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 材料與試劑

玉竹、黨參和山銀花飲片（購于湖南省松齡堂中藥飲片有限公司）；乙腈（色譜純，Honeywell Burdick amp; Jackson公司）；D-無水葡萄糖（分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠）；黨參炔苷對照品［純度≥98%，百盈利創(chuàng)生物科技（北京）有限公司］；綠原酸對照品（純度≥98%，湖南璟程生物科技有限公司）；大孔吸附樹脂D101（上海伊卡生物技術(shù)有限公司）；濃硫酸、甲醇、正丁醇和石油醚等試劑均為分析純。

2 試驗方法

2.1 供試品溶液的制備

根據(jù)前期研究的玉參花飲料配方，稱取玉竹9 g、黨參10 g、山銀花10 g，浸泡時間、料液比和提取時間按照2.6節(jié)方法進(jìn)行操作，四層紗布濾過，合并濾液濃縮至50～60 mL，離心15 min（轉(zhuǎn)速為4 500 r/min），定容至100 mL，即供試品溶液。

2.2 總多糖含量的測定［4］

2.2.1 溶液制備

對照品溶液D1：精密稱取 D -無水葡萄糖對照品20 mg，定容至100 mL量瓶中，搖勻，即得質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的葡萄糖對照品溶液。

供試品溶液G1：精密量取YSH 1.0 mL，定容至10 mL的容量瓶中，搖勻；精密量取1.0 mL，加水定容至10 mL容量瓶中，再用移液槍精密量取1.0 mL水加入10 mL容量瓶中，即共11 mL，搖勻；再精密量取1.0 mL，定容至5 mL容量瓶中，即得供試品溶液。

5%苯酚溶液的配制：精密量取苯酚液體4.7 mL，加60 ℃水溶解定容至100 mL棕色容量瓶中，搖勻。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密量取D1溶液0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mL，置于具塞試管中，每管加純化水補至2.0 mL，精密加入5%苯酚溶液1.0 mL，搖勻，迅速精密加入濃硫酸5.0 mL，搖勻，放置10 min后，置40 ℃水浴鍋中保溫15 min，取出，置冷水浴中冷卻至室溫，以相應(yīng)的試劑為空白，照紫外-可見分光光度計，在490 nm處測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，建立回歸方程。

2.2.3 供試品測定

精密量取G1溶液1.0 mL，置于具塞試管中，按2.2.2節(jié)方法測定供試品溶液的吸光度。根據(jù)表2中對應(yīng)的回歸方程計算YSH中的C1，再代入式（1）中計算出YSH的多糖含量C01。

C01= C1×V1×V2×A×10-3/M1（1）

式中：C1為供試品測出吸光度在回歸方程中對應(yīng)的質(zhì)量濃度，μg/mL；V1為含量測定時YSH的體積，mL；V2為供試品G1溶液的體積，mL;A為總多糖稀釋倍數(shù)；M1為供試品原料總質(zhì)量，mg。

2.3 黨參炔苷含量的測定［5］

2.3.1 色譜條件

色譜柱：GS-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈∶0.2%乙酸（體積比為22∶78）；柱溫：30 ℃;檢測波長：267 nm；進(jìn)樣量：10 μL；流速：1.0 mL/min。

2.3.2 溶液制備

對照品溶液D2：精密稱定黨參炔苷對照品3.12 mg，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，即得312 μg/mL對照品溶液。

供試品溶液G2：精密量取供試品25 mL，置于分液漏斗中，用石油醚萃取2次，第一次40 mL，第二次30 mL，棄去石油醚層；再用水飽和的正丁醇萃取3次，每次30 mL，合并正丁醇液；再用1% NaOH萃取2次，第一次40 mL，第二次30 mL，棄去1% NaOH層；將正丁醇層蒸干，殘渣加5 mL甲醇使溶解；過大孔樹脂柱（高12 cm，內(nèi)徑1.5 cm），用50 mL水洗脫，棄去水液；用50 mL 30%乙醇洗脫，棄去30%乙醇洗脫液，再用100 mL 50%乙醇洗脫，收集洗脫液，蒸干；用甲醇溶解殘渣并定容至10 mL，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即可。

2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

分別精密吸取D2溶液1、5、10、15和20 μL，按2.3.1節(jié)色譜條件測定，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，建立回歸方程。

2.3.4 供試品測定

精密吸取G2溶液10 μL注入液相色譜儀，按照2.3.1節(jié)色譜條件測定。根據(jù)表2中的回歸方程計算YSH中的C2，再代入式（2）中計算黨參炔苷含量C02。

C02=C2×V3/V4（2）

式中：C2為供試品測出峰面積積分值在回歸方程中對應(yīng)的質(zhì)量濃度，μg/mL；V3為含量測定時供試品G2的體積，mL；V4為含量測定時YSH供試品溶液的取樣量，mL。

2.4 綠原酸含量的測定［6］

2.4.1 色譜條件

色譜柱：GS-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈：0.4 %磷酸（體積比為13∶78）；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL/min；檢測波長：327 nm。

2.4.2 溶液制備

對照品溶液D3：精密稱取綠原酸對照品8.0 mg，用50%甲醇定容至10 mL，得濃度為800 μg/mL的綠原酸對照品溶液，備用。

供試品溶液G3：精密移取供試品溶液1.0 mL，用甲醇定容至10 mL，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密量取對照品溶液D3，稀釋后質(zhì)量濃度為40、80、160、320和640 μg/mL，在2.4.1節(jié)色譜條件下測定，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，建立回歸方程。

2.4.4 供試品測定

精密吸取G3溶液各10 μL注入液相色譜儀，按照2.4.1節(jié)色譜條件測定。根據(jù)表2中的回歸方程計算YSH中C3，再代入式（3）中計算綠原酸含量C03。

C03=C3×V5×B/M2（3）

式中：C3為供試品測出峰面積積分值在回歸方程中對應(yīng)的質(zhì)量濃度，μg/mL；V5為含量測定時YSH的體積，mL；B為綠原酸稀釋倍數(shù)；M2為供試品原料總質(zhì)量，mg。

2.5 多指標(biāo)加權(quán)綜合評分法

以總多糖、黨參炔苷和綠原酸含量作為試驗優(yōu)化指標(biāo)，采用多指標(biāo)加權(quán)綜合評分法對YSH的提取工藝進(jìn)行綜合評價［7］。為了讓指標(biāo)有相同的貢獻(xiàn)，將總多糖含量（z）、黨參炔苷含量（d）和綠原酸含量（l）的權(quán)重系數(shù)設(shè)計分別為0.4、0.4和0.2，綜合評分（Q）=總多糖含量×0.4＋黨參炔苷含量×0.4＋綠原酸含量×0.2。

2.6 提取工藝

2.6.1 單因素試驗

預(yù)實驗確定YSH的提取次數(shù)為2次，固定浸泡時間都為15 min，料液比分別為1∶12 g/mL和1∶10 g/mL，提取時間為60 min和40 min，改變其中一個條件，其他條件不變來分析浸泡時間、料液比和提取時間對YSH中總多糖、黨參炔苷和綠原酸含量的影響，并以其綜合評分作為評價指標(biāo)，從而確定其響應(yīng)面設(shè)計的工藝參數(shù)范圍，共制100 mL。

各因素設(shè)置5個水平：浸泡時間0、15、30、45和60 min，料液比（1∶8、1∶6）、（1∶10、1∶8）、（1∶12、1∶10）、（1∶14、1∶12）和（1∶16、1∶14） g/mL、提取時間（40、30）、（60、40）、（80、60）、（100、80）和（120、100） min。

2.6.2 響應(yīng)面設(shè)計方案

在單因素基礎(chǔ)上，固定提取次數(shù)為2次，以浸泡時間（Ａ）、料液比（B）、提取時間（C）3個因素作為自變量，以YSH中的總多糖、黨參炔苷和綠原酸含量的綜合評分作為響應(yīng)值，對YSH的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。響應(yīng)面試驗因素與水平設(shè)計見表1。

2.7 統(tǒng)計分析

每個指標(biāo)均做3次重復(fù)試驗，取平均值；采用多指標(biāo)加權(quán)綜合評分法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理［7］，對3個試驗評價指標(biāo)進(jìn)行加權(quán)綜合評分，得到綜合評分值；利用Excel 2019和Origin 2021 軟件處理試驗數(shù)據(jù)。采用SPSS 26軟件分析單因素試驗結(jié)果方差和顯著性；應(yīng)用Design-Expert 8統(tǒng)計軟件和Box-Benhnken法進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化處理。

3 結(jié)果與討論

3.1 線性關(guān)系

由表2知，多糖、黨參炔苷和綠原酸的線性范圍分別為5.0～25.0 μg/mL （R2=0.999 8）、31.2～624.0 μg/mL （R2=0.999 7）和40.0～640.0 μg/mL （R2=0.999 7）。

3.2 提取工藝試驗結(jié)果

3.2.1 單因素試驗結(jié)果

由圖1（a）可知，隨著浸泡時間延長，總多糖、黨參炔苷和綠原酸含量的綜合評分均呈先上升后下降趨勢，浸泡時間在15 min時，綜合分?jǐn)?shù)最高。由圖1（b）可知，隨著料液比增加，綜合得分呈先上升后下降趨勢，料液比為1∶12 g/mL、1∶10 g/mL時分?jǐn)?shù)最高。由圖1（c）可知，隨著提取時間增加，綜合得分呈先上升后下降趨勢，提取時間為60 min、40 min時分?jǐn)?shù)最高?？赡苁且驗榛亓魈崛⊥ǔＰ枰邷睾烷L時間的處理，這可能會導(dǎo)致多糖的降解［8］；黨參炔苷不穩(wěn)定，在高溫高熱條件下易分解為其他物質(zhì)［9］；綠原酸受熱不穩(wěn)定，因此，提取時間不宜過長［5］。

3.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以綜合評分為響應(yīng)值，采用Design-Expert 8軟件和Box-Benhnken法進(jìn)行試驗設(shè)計，確定YSH飲料的最佳提取工藝，試驗設(shè)計及結(jié)果見表3。

對表3試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項回歸擬合，獲得感官評分對浸泡時間（A）、料液比（B）和提取時間（C）的多元回歸方程為：

Y=-0.186 9+0.000 677A+0.303 88B+0.010 91C-0.000 075AB+0.000 011AC-1.260 03×10-19BC- 0.000 018A2-0.001 050B2- 9.25 ×10-6C2。該模型的方差分析結(jié)果見表4。

以綜合評分為評價指標(biāo)，對模型進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)檢驗并分析。由表4可知，該回歸模型Plt;0.01，極顯著，失擬項 P=0.839 5 gt; 0.05，不顯著，說明方程能準(zhǔn)確反映綜合評分與各因素之間的關(guān)系?；貧w模型相關(guān)系數(shù)R2=0.996 9，RAdj2=0.992 9，擬合程度良好。單因素A、C極顯著（Plt;0.01），三因素的F值分別為543.10、5.43、319.22，因此，對YSH綜合評分影響由大到小的因素依次為浸泡時間（A）、提取時間（C）、料液比（B）。二次項A2、B2、C2對飲料的綜合評分影響極顯著（Plt;0.01）。利用Design-Expert 8軟件對表4的數(shù)據(jù)進(jìn)行二元多次回歸擬合，A、B、C三個因素對綜合評分（Y）的影響交互作用關(guān)系見圖2。

由圖2可知，浸泡時間和提取時間對YSH的綜合評分影響顯著，料液比對綜合評分影響不顯著。根據(jù)結(jié)果預(yù)測YSH的最佳提取工藝條件為浸泡時間15 min，料液比1∶14 g/mL、1∶12 g/mL，提取時間60 min、40 min。

4 結(jié)論

1）通過單因素試驗和響應(yīng)面設(shè)計對YSH提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，確定了YSH提取工藝的最優(yōu)條件為：浸泡時間15 min，料液比1∶14 g/mL、1∶12 g/mL，提取時間60 min、40 min。該方法簡單可行，穩(wěn)定可控。

2）YSH配方源于前期的研究基礎(chǔ)，后續(xù)將進(jìn)一步開展對YSH進(jìn)行感官評價和產(chǎn)品質(zhì)量評價的研究。

參考文獻(xiàn)：

［1］賴雋暉， 李秀霞. 藥用植物玉竹藥理作用研究進(jìn)展［J］. 黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2021（2）： 132-135.

［2］祁金麗， 梁潔， 胡玨， 等. 黨參的質(zhì)量控制狀況及質(zhì)量標(biāo)志物預(yù)測分析［J］. 中華中醫(yī)藥學(xué)刊， 2022， 40（5）： 255-258.

［3］朱香梅， 李晴， 石雨荷， 等. 山銀花的研究進(jìn)展及其質(zhì)量標(biāo)志物預(yù)測分析［J］. 世界中醫(yī)藥， 2022， 17（13）： 1860-1868.

［4］古孜麗阿依·庫爾班， 武嘉林. 阿膠強(qiáng)骨口服液中總多糖含量測定［J］. 新疆中醫(yī)藥， 2019， 37（6）： 55-57.

［5］張憲， 李岳. 高效液相色譜法測定肝精補血素口服液中黨參炔苷含量［J］. 中國藥業(yè)， 2019， 28（12）： 32-34.

［6］周游宇. 山銀花配方顆粒制備工藝與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究［D］. 長沙： 湖南中醫(yī)藥大學(xué)， 2019.

［7］牛曉靜， 張文鑫， 段曉穎， 等. 多指標(biāo)全概率評分法優(yōu)選參芪益氣膠囊醇提工藝［J］. 中國實驗方劑學(xué)雜志， 2014， 20（18）： 26-29.

［8］鄭爽. 玉竹多糖的提取、純化及理化性質(zhì)與結(jié)構(gòu)分析［D］. 沈陽： 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2017.

［9］楊鮮. 黨參復(fù)合保健飲料的研制［D］. 重慶： 西南大學(xué)， 2015.