【摘 要】目的：探討顆粒蛋白前體（progranulin，PGRN）對膿毒癥急性肺損傷（acute lung injury，ALI）的影響及可能機制。方法：將C57BL/6小鼠隨機分為對照組（Control組）、急性肺損傷組（CLP組）、顆粒蛋白前體治療組（CLP+PGRN組）。采用盲腸結扎穿刺術（cecal ligation and puncture，CLP）構建小鼠膿毒癥ALI模型，CLP+PGRN組在CLP處理半小時后使用PGRN腹腔注射。24 h后麻醉并處死小鼠，取小鼠肺HE染色觀察肺組織病理損傷；TUNEL法檢測肺部細胞凋亡情況；免疫熒光染色檢測肺組織中核轉錄因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）水平；Western blot法檢測NF-κB、總p65和磷酸化p65表達水平；RT-qPCR檢測NF-κB和炎癥細胞因子水平。結果：和Control組相比，CLP組和CLP+PGRN組肺損傷加重，促炎細胞因子升高，肺組織中細胞凋亡增加，NF-κB、p65和p-p65的表達水平明顯增加；與CLP組相比，CLP+PGRN組肺組織損傷和凋亡減輕，促炎細胞因子降低，抑炎細胞因子升高，NF-κB、p65和p-p65的表達明顯減少。結論：PGRN可以減輕膿毒癥小鼠急性肺損傷，其機制可能與抑制NF-κB、p65表達和p65磷酸化有關。

【關鍵詞】急性肺損傷；顆粒蛋白前體；組織核轉錄因子-κB；p65

【中圖分類號】R563.8 【文獻標志碼】A 【收稿日期】2024-03-03

急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distresssyndrome，ARDS）是1類以頑固性低氧血癥為明顯特征的臨床綜合征，多急性起病，且伴隨呼吸窘迫，用常規(guī)氧療難以糾正[1]。導致ARDS的原因較復雜，可以由肺內(nèi)、肺外等多種因素引起，在眾多致病因素中膿毒癥導致的ARDS 發(fā)病率高、死亡率高[2]。1 項全球50多個國家進行的多中心研究表明，重癥監(jiān)護病房中約10.4% 的患者患有ARDS，重癥監(jiān)護室和醫(yī)院ARDS 患者的死亡率分別為35.3% 和40.0%，有高占比、高死亡率的特點[2]。尤其是在新冠肺炎的初期階段，ARDS患者進入重癥監(jiān)護病房的死亡率從26%到61.5%不等[3]。盡管ARDS的臨床治療標準在不斷演變，例如臨床實體定義、分組和精確治療等，但ARDS是1種異質性綜合征，尋找針對ARDS早期ALI階段的個性化藥物是未來治療的發(fā)展方向[4]。顆粒蛋白前體（progranulin，PGRN）是1種富含半胱氨酸的蛋白，在包括癌癥、炎癥、代謝疾病中發(fā)揮重要作用[5]。有研究表明PGRN與腫瘤壞死因子受體-2（TNF receptor-2，TNFR2）的相互作用在PGRN對內(nèi)毒素誘導的ALI的保護作用中起關鍵作用[6]。NF-κB是1種蛋白質復合物，參與控制DNA 轉錄、細胞因子生產(chǎn)和控制細胞凋亡等活動，在免疫應答的調節(jié)中發(fā)揮關鍵作用[7]。多項研究表明，藥物可以通過降低NF-κB的表達來緩解炎癥狀態(tài)[8]。本文從動物實驗角度研究PGRN對NF-κB表達的影響，探討PGRN對膿毒癥致急性肺損傷的影響及可能的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗小鼠購自重慶醫(yī)科大學實驗動物中心，均為無特定病原體（specific pathogens free，SPF）級。隨機選擇年齡8～12周齡，體質量20～25 g健康的雄性C57BL/6小鼠。

1.2 主要試劑

PGRN（MCE，美國）；兔抗NF-κB抗體、兔抗p65抗體、兔抗p-p65抗體、小鼠抗GAPDH抗體購買于美國Abcam公司；TUNEL試劑盒（羅氏公司，瑞士）。

1.3 方法

1.3.1 動物分組及給藥

取正常健康雄性C57BL/6小鼠15只，隨機分為3組：對照組（Control組，n=5）、急性肺損傷組（CLP組，n=5）、PGRN治療組（CLP+PGRN組，n=5）。在實驗開始前，將小鼠置于穩(wěn)定的無特定病原體環(huán)境（室溫25～27 ℃）中1周后，采用CLP法構建膿毒癥ALI模型，PGRN治療組（CLP+PGRN組）在建立CLP模型PGRN半小時后給予PGRN（2 μg/只，腹腔注射）。在給藥后24 h 用吸入異氟烷（RWD，美國）麻醉小鼠，取小鼠肺臟。

1.3.2 小鼠肺組織學染色

取小鼠左肺新鮮組織，在4%多聚甲醛中完全、充分浸泡24 h。對組織進行酒精梯度脫蠟、復水，并制備厚度為4 μm 的石蠟包埋切片。蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin staining，HE）染色后光鏡下觀察肺組織病理改變情況。每組選擇5個不同視野，通過盲法進行獨立打分，最后匯總統(tǒng)計結果。根據(jù)肺泡充血、出血、中性粒細胞浸潤和透明膜形成情況，以MIKAWA[9]評分標準評價病理損傷，打分標準為：無或極輕，0分；輕，1分；中，2分；重，3分；極重，4分。肺損傷評分結果以盲法獲得，總分越高，損傷越嚴重。

1.3.3 肺組織TUNEL檢測

肺組織切片中的細胞凋亡率通過TUNEL檢測試劑盒，遵循制造商提供的方案，在400倍放大倍數(shù)下測定顯示TUNEL陽性的細胞數(shù)。每組選擇5個不同視野，通過盲法獨立計數(shù)，最后匯總結果進行統(tǒng)計。

1.3.4 小鼠肺組織炎癥細胞因子、NF-κB mRNA 檢測

用RNAiso Plus（Takara，日本）從細胞和器官中提取細胞總RNA。用SYBR 聚合酶鏈式反應試劑盒（Takara，日本）和ABI PRISM 7 000聚合酶鏈式反應系統(tǒng)（Bio-Rad，美國）合成cDNA。用特異性定量引物分析NF-κB、炎癥細胞因子與GAPDH 的相對量。NF-κB、TNF-α和IL-10引物由上海生工公司設計并合成，NF-κB序列為F：5’-ATGGCAGACGATGATCCCTAC-3’，R；5’-CGGAATCGAAATCCCCTCTGTT-3’；TNF-α序列為F：5’-CCAGGAGAGGCATTATGAGCA-3’，R：5’-ACTGTCGGAGGTAGGAGTGC-3’；IL-10序列為F：5’-CTTACTGACTGGCATGAGGATCA-3’，R：5’-GCAGCTCTAGGAGCATGTGG-3’；GAPDH序列為F：5’-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3’，R；5’-GGGGTCGTTGATGGCAACA-3’。

1.3.5 小鼠肺組織NF-κB、p65和p-p65蛋白檢測

肺組織和細胞在RIPA緩沖液（碧云天，中國）中裂解并添加蛋白酶和磷酸酶抑制劑，最后進行勻漿。使用BCA分析試劑盒（碧云天，中國）定量蛋白質濃度。通過PAGE膠分離蛋白質并轉移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，在NF-κB、p65、p-p65 和GAPDH抗體溶液中4 ℃孵育過夜。洗膜后與抗兔抗體常溫孵育1 h，使用Bio-Rad系統(tǒng)進行條帶成像和密度分析。以上涉及實驗均重復3次或以上。

1.3.6 小鼠肺組織免疫熒光檢測

取小鼠右肺上葉使用二甲苯進行脫蠟，然后用梯度酒精進行再水化。隨后，將切片在正常山羊血清中浸泡30 min，將切片浸于NF-κB多克隆抗體溶液，并4 ℃孵育過夜。用二氨基聯(lián)胺顯影，蘇木素核染色，中性膠封口。使用VS200掃描儀（奧林巴斯，日本）獲取實驗圖像，通過盲法進行計數(shù)并分析。

1.4 統(tǒng)計學方法

用GraphPad Prism 8.0和SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）呈現(xiàn)。多組間計量資料比較采用單因素方差分析，其組間兩兩比較采用SNK-q 法，檢驗水準α=0.05。

2 結 果

2.1 PGRN緩解小鼠膿毒癥ALI模型肺組織損傷

Control組、CLP組和CLP+PGRN組的肺部HE染色盲評損傷評分分別為4.670±0.471、15.670±0.471和9.33±1.24；兩兩相比，相對于Control組，CLP組肺部損傷程度明顯升高（P=0.000），CLP組可見血管周圍和間質充血水腫，肺泡間隙明顯破壞，大量炎癥細胞浸潤（如黃色箭頭所示）；相對于CLP組，CLP+PGRN組治療組肺部損傷程度得到緩解，肺泡間隙破壞程度減輕，充血水腫得到改善，炎癥細胞浸潤同樣減少（如黃色箭頭所示），差異有統(tǒng)計學意義（P=0.002）（圖1）。

2.2 PGRN降低肺部促炎因子表達，升高抑炎因子表達

造模、治療后取小鼠肺組織提取RNA，檢測炎癥因子在mRNA水平的表達情況，從而評估PGRN對損傷肺組織的炎癥因子表達影響。其中，對于促炎細胞因子TNF-α，各組表達水平分別為Control 組1.000±0.237、CLP 組3.09±1.07、CLP+PGRN組1.330±0.148，CLP組相較于Control組表達水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.007），經(jīng)過治療后CLP+PGRN 組TNF-α 表達水平相比CLP 組降低明顯（P=0.030）。而對于抑炎細胞因子IL-10，各組表達水平分別為Control 組1.000±0.121、CLP 組0.949±0.176、CLP+PGRN 組1.430±0.237，經(jīng)過PGRN 治療后CLP+PGRN 組IL-10 表達水平升高，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.011）（圖2）。

2.3 PGRN抑制肺部凋亡

Control 組、CLP 組和CLP+PGRN 組的肺部TUNEL 染色結果顯示凋亡細胞所占比例分別為（15.700±0.172）%、（43.000±0.300）%、（33.300±0.133）%。其中，CLP 組凋亡細胞占比相較于Control 組明顯升高（P=0.000），而CLP+PGRN組則比CLP組明顯降低（P=0.005）（圖3）。

2.4 PGRN抑制NF-κB表達

通過WB檢測小鼠肺組織NF-κB蛋白水平，Control組、CLP組和CLP+PGRN組的結果分別為0.891±0.011、1.990±0.207、0.862±0.122，CLP+PGRN組相比CLP組明顯降低（P=0.000）（圖4A）。通過qRT-PCR 檢測各組NF-κB 在mRNA層面的表達水平，Control組、CLP組和CLP+PGRN組的表達水平分別為1.000±0.031、4.220±0.188、2.970±0.103。CLP組相比Control組，NF-κB的表達水平明顯升高（P=0.000），而CLP+PGRN組相較于CLP組明顯降低（P=0.030）（圖4B）。根據(jù)免疫熒光染色的Merge結果統(tǒng)計，Control組、CLP組和CLP+PGRN 組的NF- κB 陽性細胞占比分別為（13.40±3.17）%、（32.600±0.573）%、（16.20±3.37）%，NF-κB陽性細胞占比在CLP+PGRN治療組中相比CLP組明顯降低，2組差異有統(tǒng)計學意義（P=0.002）（圖4C）。

2.5 PGRN抑制p65和p-p65表達

通過檢測小鼠肺部p65和p-p65的蛋白水平來探究p65和p-p65的變化情況。在WB結果中可見，CLP組（1.830±0.049）使p65 水平相較于對照組（1.100±0.110）明顯升高，CLP+PGRN組治療（1.280±0.066）使p65水平相較于CLP組明顯降低，且差異有統(tǒng)計學意義（P=0.000）（圖5A）。小鼠肺組織檢測p65磷酸化蛋白水平，各組表達水平分別為Control組（1.000±0.122）、CLP 組（1.360±0.123）和CLP+PGRN 組（0.945±0.132）。相比于Control組，CLP組p65磷酸化水平升高明顯（P=0.030），PGRN 治療后CLP+PGRN 組相比CLP組明顯降低（P=0.032）（圖5B）。

3 討 論

急性呼吸窘迫綜合征是重癥醫(yī)學領域高風險、高死亡率臨床綜合征，隨著我國人口的老年化，ARDS的發(fā)病人數(shù)逐年提高。調查顯示現(xiàn)重癥監(jiān)護室內(nèi)ARDS發(fā)病率達到10%以上，死亡率達到40%以上[10]。近年新型冠狀病毒感染的全球大流行，更是增高ARDS在重癥監(jiān)護室中的占比和病死率，武漢初期救治的危重型COVID-19 患者中，ARDS 發(fā)病率高達67%，給社會和公共衛(wèi)生資源帶來沉重的負擔[11]。目前對ARDS的臨床治療手段較局限，主要分為機械通氣治療和非機械通氣治療2大類缺乏，特異性藥物治療手段的缺乏仍是ARDS所面臨的巨大挑戰(zhàn)[12]。在ARDS的發(fā)病機制中，錯綜復雜的細胞因子網(wǎng)絡由通路構成級聯(lián)反應，最終導致肺實質損傷、凋亡增加，早期階段的診療至關重要[13]。因此，尋找能有效控制細胞因子的ALI特異性治療藥物并研究其作用機制有十分重要的意義。

PGRN是一種多功能糖蛋白，在中樞和外周內(nèi)廣泛表達，在上皮細胞、神經(jīng)元和巨噬細胞中高度表達，在一些免疫細胞，如T細胞和樹突狀細胞中也同樣表達[14]。中樞也可參與神經(jīng)發(fā)育、神經(jīng)炎癥、自噬等生命活動，其功能障礙可能引起神經(jīng)退行性疾病，外周參與免疫細胞功能的調節(jié)，促進癌細胞的增殖和轉移[15-16]。PGRN可在炎癥疾病中發(fā)揮作用，有研究表明，PGRN可以通過調節(jié)免疫細胞的分化，參與免疫應答的過程，對免疫系統(tǒng)功能產(chǎn)生影響，如抑制巨噬細胞M1型極化，同時減低TNF-α等炎癥因子產(chǎn)生[17]。此外，PGRN在組織修復和再生過程中發(fā)揮作用，能誘導細胞遷移和增殖，并在適當條件下參與皮膚和脊髓損傷的修復[18]。該作用可能是通過促進細胞增殖、血管生成和膠原合成介導的[19]。在一些神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，如阿爾茨海默病和帕金森病，PGRN可通過將衰老和功能障礙的小膠質細胞轉化為抗病細胞，從而清除錯誤折疊的蛋白質和碎片[20]。PGRN 與神經(jīng)炎癥的發(fā)生和發(fā)展相關，可通過調控大腦免疫系統(tǒng)，將其從炎癥狀態(tài)轉變?yōu)樯砥胶鉅顟B(tài)，從而糾正神經(jīng)退行性疾病[21]。PGRN的水平或功能改變可能與炎癥疾病的嚴重程度和預后相關，PGRN水平的降低可能導致較差的疾病結局[22-23]。同時PGRN通過調控巨噬細胞功能和成纖維細胞外基質分泌對抗肺部炎癥疾病中常見的纖維化的發(fā)生和發(fā)展[24-25]。適當?shù)募毎蛲鰧τ谇宄軗p或異常的細胞是重要的，PGRN促進腫瘤壞死因子受體介導的內(nèi)質網(wǎng)應激誘導調節(jié)細胞凋亡過程，有助于維持肺部的正常結構和功能[26]。ARDS新生兒血清中PGRN高表達，miR-34b-5p可通過介導PGRN 和炎癥因子參與ARDS 的發(fā)展[6]。由此可見，PGRN可廣泛參與炎癥反應調節(jié)，調控巨噬細胞、中性粒細胞和淋巴細胞等免疫細胞的功能，在肺部炎癥疾病中發(fā)揮作用[17]。

為了探究PGRN在ALI中發(fā)揮的作用，本研究通過小鼠CLP造模誘導構建ALI模型，經(jīng)過腹腔注射PGRN溶液治療，觀察相關損傷恢復和細胞因子表達情況。肺部HE染色結果表明，PGRN能有效緩解肺部損傷狀態(tài)（圖1）；TUNEL染色檢測肺組織凋亡水平，結果說明PGRN能抑制肺組織凋亡（圖3）；RT-qPCR 檢測肺組織炎癥因子mRNA 水平，在PGRN處理后促炎因子TNF-α明顯降低，抑炎因子IL-10明顯升高（圖2）。以上結果提示PGRN作為新靶向治療藥物應用于ALI的潛力。

NF-κB是一種重要的轉錄因子，參與許多疾病的發(fā)生和發(fā)展。最新研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB在炎癥反應中發(fā)揮關鍵作用，可通過介導細胞因子和免疫細胞活化等方式參與類風濕關節(jié)炎、哮喘等炎癥性疾病[27]。NF-κB也可參與免疫應答調節(jié)，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化等，NF-κB的活化加重相關組織損傷[28]。NF-κB可以促進細胞增殖、抵抗凋亡，同時促進血管生成促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉移，與多種癌癥的形成和演進相關[29]。在ARDS中，NF-κB可通過促進多種細胞因子基因轉錄導致炎癥和組織損傷加重[30]。NF-κB由2類亞基形成二聚體，一類亞基包括p65（RelA）、RelB和C-Rel；另一類亞基包括p50和p52。p65是NF-κB最常見的亞基之一，它參與細胞增殖、炎癥以及免疫等多種病理生理性過程。當受到外界因素刺激時，p65活化后啟動多種炎癥基因的轉錄，誘導各種細胞因子表達[31]。在ARDS中，p65通過活化生成磷酸化p65（p-p65）促進炎癥細胞的活化和浸潤，影響肺泡上皮細胞和血管內(nèi)皮細胞的功能，加重肺泡上皮細胞的高凝和纖溶，進一步加重炎癥反應[32-33]。此外，p-p65還可能參與ARDS 中的氧化應激和細胞凋亡等過程[34-35]。因此，降低NF-κB、p65以及p-p65水平或可成為ARDS治療的關鍵。

為了進一步探究PGRN在ALI中發(fā)揮作用的可能機制，本研究在PGRN治療后通過免疫熒光、RTqPCR和WB對NF-κB途徑相關蛋白進行不同層次的檢測。小鼠肺部免疫熒光結果顯示NF-κB陽性細胞占比明顯降低（圖4C），且在WB（圖4A）和RTqPCR（圖4B）的重復實驗中出現(xiàn)相同結果；蛋白水平檢測p65在小鼠肺部含量，結果顯示PGRN治療后明顯降低p65含量（圖5A）；進一步驗證p65活化情況，通過WB檢測p-p65水平，結果顯示CLP組小鼠肺組織p65活化明顯升高，在PGRN治療后明顯降低（圖5B）。以上結果提示，PGRN可能通過NF-κB途徑，即抑制NF-κB及其亞基p65表達、抑制p65活化來發(fā)揮肺部損傷治療作用。綜上所述，外源性給予PGRN 可明顯降低ALI肺部損傷程度，能有效保護肺部，達到治療效果。同時，PGRN降低肺部NF-κB及其亞基p65水平，抑制了p65活化，這可能是PGRN治療作用的介導途徑。這些研究結果提示，PGRN可能通過抑制NF-κB 表達和活化，減輕膿毒癥急性肺損傷，這為ARDS的藥物治療提供了新的潛在靶點，為挽救ALI高死亡率提供新思路。

參 考 文 獻

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（責任編輯：周一青）

基金項目：國家自然科學基金資助項目（編號：81801894）。