關(guān)佳佳,劉萌萌,于志勇,于權(quán)麟,王思爽,李繼文,遲 良,劉煥奇

(1. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,山東 青島 266109 ; 2. 青島市智慧鄉(xiāng)村發(fā)展服務(wù)中心,山東 青島 266100)

異氟烷(Isoflurance,ISO)是常用的吸入型揮發(fā)麻醉劑,主要用于全身麻醉的誘導(dǎo)和維持,研究顯示,異氟烷作用于發(fā)育期的腦組織可導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損,加劇某些神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生和機(jī)體的認(rèn)知功能障礙[1]?；钚匝?Reactive oxygen species,ROS)主要在線粒體電子傳遞鏈由Ⅲ狀態(tài)向IV狀態(tài)轉(zhuǎn)換過程中產(chǎn)生。異氟烷可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生大量的ROS,引起氧化損傷,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和神經(jīng)功能退化[2]。從神經(jīng)干細(xì)胞的產(chǎn)生到神經(jīng)元的維持和最終的死亡,線粒體在調(diào)節(jié)神經(jīng)通路的穩(wěn)態(tài)中起著關(guān)鍵的作用,過量的ROS作用于線粒體,破壞線粒體結(jié)構(gòu),導(dǎo)致線粒體膜電位下降觸發(fā)線粒體凋亡信號通路,引起細(xì)胞凋亡[3,4]。因此,猜測異氟烷有可能通過產(chǎn)生過量的ROS誘導(dǎo)細(xì)胞氧化損傷來影響線粒體功能,從而引起細(xì)胞凋亡。

右美托咪啶(Dexmedetomidine,DEX)是一種α2-腎上腺素受體激動劑,可通過降低去甲腎上腺素的分泌,發(fā)揮鎮(zhèn)靜和鎮(zhèn)痛作用。研究發(fā)現(xiàn),右美托咪啶與麻醉藥聯(lián)合使用可改善神經(jīng)變性和長期認(rèn)知功能損傷[5]。右美托咪啶具有抗氧化和清除氧自由基的能力,Wang等研究證實,右美托咪啶對利多卡因誘導(dǎo)的大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞(Pheochromocytoma-12 cell,PC12細(xì)胞)氧化損傷具有保護(hù)作用[6]。雖然有研究證明,右美托咪啶與麻醉藥合用可以有效降低麻醉藥所產(chǎn)生的術(shù)后認(rèn)知功能障礙等相關(guān)并發(fā)癥[7]。然而,右美托咪啶在異氟烷誘發(fā)的細(xì)胞線粒體氧化損傷中的作用尚不清楚。因此,本試驗通過建立異氟烷誘導(dǎo)PC12細(xì)胞線粒體氧化損傷模型,探究右美托咪啶是否對異氟烷誘導(dǎo)的線粒體氧化損傷具有保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 DMEM高糖培養(yǎng)基,購自美國Cytiva公司;胎牛血清(Fetal bovin serum, FBS),購自賽默飛世爾科學(xué)(美國)科技有限公司;右美托咪啶(Dexmedetomid, DEX)、異氟烷(Isoflurane, ISO)、活性氧(Reactive oxygen species, ROS)、丙二醛(Malondialdehyde, MDA)、過氧化氫酶(Catalase, CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase, GPX)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)測定試劑盒和線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1),均購自索萊寶生物科技有限公司;細(xì)胞色素C(Cytochrome C, Cyt-C)檢測試劑盒、Fura-2 AM熒光探針和TUNEL檢測試劑盒,均購自Abcam 生物有限公司。

1.2 主要儀器 Matrx小動物專用吸入麻醉機(jī),購自美國MIDMARK公司;倒置顯微鏡,購自美國Scilogex公司;BILON-650Y型超聲波細(xì)胞破碎儀,購自韋克斯科技(北京)有限公司;超凈工作臺,購自賽默飛世爾科技有限公司;SPAVK型全波長酶標(biāo)儀,購自上海帝肯貿(mào)易有限公司。

1.3 細(xì)胞株和細(xì)胞培養(yǎng) PC12細(xì)胞,購自中國科學(xué)院細(xì)胞型培養(yǎng)庫(中國上海),使用含10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基,37 ℃恒溫培養(yǎng)。

1.4 線粒體氧化損傷模型的建立和細(xì)胞分組 對照組(Control組)、右美托咪啶處理組(DEX組,25 μg/mL DEX預(yù)處理30 min)、異氟烷處理組(ISO組,細(xì)胞培養(yǎng)板置于特定的密閉容器中連接麻醉機(jī),持續(xù)通入流量為2 L/min的氧氣,并通過吸入麻醉藥揮發(fā)罐給予2% ISO處理,持續(xù)作用4 h)以及右美托咪定和異氟烷共同處理組(DEX+ISO組,25 μg/mL DEX預(yù)處理30 min后通入2% ISO處理4 h)。本試驗所有試驗方法均設(shè)3組重復(fù),進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

1.5 試驗方法

1.5.1 細(xì)胞內(nèi)ROS檢測 PC12細(xì)胞于6孔板中培養(yǎng)24 h,加藥處理,吸出舊培養(yǎng)液,PBS清洗3次,原位裝載DCFH-DA熒光探針,細(xì)胞培養(yǎng)箱37 ℃孵育20 min,無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌3次,熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.5.2 細(xì)胞內(nèi)MDA、CAT、GPX和SOD檢測 PC12細(xì)胞于6孔板中培養(yǎng)24 h,加藥處理,1.5 mL離心管收集細(xì)胞,離心,棄上清,收集沉淀。向沉淀中加入1 mL PBS,清洗3次。加入1 mL PBS重懸細(xì)胞,使用超聲細(xì)胞破碎儀充分破碎細(xì)胞。根據(jù)MDA、CAT、GPX和SOD 測定試劑盒說明書中的反應(yīng)體系和步驟操作進(jìn)行檢測。

1.5.3 線粒體膜電位檢測 PC12細(xì)胞于6孔板中培養(yǎng)24 h,加藥處理,吸出舊培養(yǎng)液,PBS清洗3次,加入JC-1 染色工作液,充分混勻,細(xì)胞培養(yǎng)箱37 ℃孵育20 min,JC-1染色緩沖液洗滌2次,加入2 mL細(xì)胞培養(yǎng)液。通過熒光顯微鏡進(jìn)行觀察和采集圖像,通過熒光的轉(zhuǎn)變分析線粒體膜電位的變化。

1.5.4 Cyt-C檢測 PC12細(xì)胞于96孔板中培養(yǎng)24 h,加藥處理,吸出舊培養(yǎng)液,PBS清洗2次,胰蛋白酶消化收集細(xì)胞于1.5 mL離心管中,離心棄上清,使用超聲波破碎儀充分破碎細(xì)胞,2 500 r/min離心20 min,收集上清。按照Cyt-C檢測試劑盒說明書步驟進(jìn)行操作,以空白孔調(diào)零,于450 nm波長依序測量各孔的光密度(Optical density,OD)值。

1.5.5 細(xì)胞凋亡檢測 PC12細(xì)胞于96孔板中培養(yǎng)24 h,加藥處理,室溫下用含4%多聚甲醛的PBS溶液固定細(xì)胞30 min。除去固定液,添加通透劑(含0.2% Triton X-100的PBS溶液)室溫孵育30 min,BSA Working Solution洗滌細(xì)胞3次。參考TUNEL檢測試劑盒說明書配置TdT反應(yīng)體系,加入50 μL反應(yīng)混合物,37 ℃孵育60 min,PBS溶液洗滌3次,每次5 min。DAPI復(fù)染細(xì)胞核10 min,PBS洗滌3次,每次5 min,熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.5.6 細(xì)胞質(zhì)Ca2+濃度檢測 PC12細(xì)胞接種至6孔板中培養(yǎng)24 h,加藥處理,PBS清洗3次,然后裝載 Fura-2 AM熒光分子探針,37 ℃ 孵育30 min,HBSS緩沖液清洗3次,熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 使用GraphPad Prism 7.04軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析和作圖,使用Image J 軟件對細(xì)胞熒光圖片進(jìn)行定量分析,統(tǒng)計方法采用單因素方差分析,配合Tukey事后檢驗。試驗結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示,以P<0.01 表示有極顯著性差異,以P<0.05表示有顯著性差異,以P>0.05表示無顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 右美托咪啶對異氟烷誘導(dǎo)PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響 氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)檢測結(jié)果顯示,與Control組 (圖1A)相比,ISO組(圖1C)細(xì)胞綠色熒光明顯增多,而DEX組(圖1B)細(xì)胞綠色熒光基本一致,DEX+ISO組(圖1D)細(xì)胞綠色熒光較ISO組顯著減少。熒光定量分析結(jié)果顯示,與Control組相比,DEX組細(xì)胞ROS水平變化不顯著(P>0.05),而ISO組細(xì)胞ROS水平極顯著升高(P<0.01),右美托咪定能夠極顯著降低ISO引起的ROS水平上調(diào)(P<0.01)(圖2)。另外,與Control組相比,ISO組MDA(圖3A)含量極顯著升高(P<0.01),CAT(圖3B)、GPX(圖3C)和SOD(圖3D)酶活性極顯著降低(P<0.01),DEX對細(xì)胞MDA含量及CAT、GPX和SOD酶活性無顯著影響(P>0.05);而與ISO組相比,DEX+ISO組細(xì)胞內(nèi)MDA含量極顯著降低(P<0.01),CAT和SOD酶活性極顯著升高(P<0.01),GPX酶活性極顯著升高(P<0.01)。結(jié)果表明,異氟烷可誘發(fā)PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷,右美托咪啶對異氟烷誘導(dǎo)PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激具有保護(hù)作用。

圖1 右美托咪啶對異氟烷誘導(dǎo)PC12細(xì)胞ROS的影響Fig.1 Effect of dexmedetomidine on isoflurane induced ROS in PC12 cellsA:Control組; B:DEX組; C:ISO組; D:DEX+ ISO組A:Control group; B:DEX group; C:ISO group; D:DEX+ISO group

圖2 右美托咪啶對異氟烷誘導(dǎo)PC12細(xì)胞ROS影響的定量分析Fig.2 Quantitative analysis of the effect of dexmedetomidine on isoflurane induced ROS changes in PC12 cells與對照組比較,*:P<0.05,**:P<0.01; 與ISO組比較,#:P<0.05,##:P<0.01;下同Compared with the Control group,*:P<0.05,**:P<0.01; Compared with the ISO group,#:P<0.05,##:P<0.01.The same as blow

2.2 右美托咪啶對異氟烷誘導(dǎo)PC12細(xì)胞線粒體膜電位的影響 與Control組(圖4A)相比,DEX組(圖4B)細(xì)胞綠色熒光基本一致,ISO組(圖4C)細(xì)胞綠色熒光明顯增強(qiáng);與ISO組相比,DEX+ISO組(圖4D)細(xì)胞綠色熒光顯著減少,紅色熒光恢復(fù)。熒光定量分析結(jié)果顯示,與Control組相比,ISO組細(xì)胞的線粒體膜電位極顯著降低(P<0.01),DEX組無顯著變化(P>0.05);而與ISO組相比,DEX+ISO組細(xì)胞的線粒體膜電位顯著升高(P<0.05)(圖5)。結(jié)果表明,右美托咪啶可以減輕異氟烷誘導(dǎo)的線粒體膜電位降低。

圖4 右美托咪啶對異氟烷誘導(dǎo)PC12細(xì)胞線粒體膜電位的影響Fig.4 Effect of dexmedetomidine on isoflurane induced mitochondrial membrane potential in PC12 cellsA:Control組; B:DEX組; C:ISO組; D:DEX+ISO組(紅色熒光:高膜電位; 綠色熒光:低膜電位)A:Control group; B:DEX group; C:ISO group; D:DEX+ISO group (Red fluorescence:High membrane potential; Green fluorescence:Low membrane potential)

圖5 右美托咪啶對異氟烷誘導(dǎo)PC12細(xì)胞線粒體膜電位影響的定量分析Fig.5 Quantitative analysis of the effect of dexmedetomidine on isoflurane induced mitochondrial membrane potential in PC12 cells

2.3 右美托咪啶對異氟烷誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞Cyt-C濃度的影響 與Control組相比,ISO組細(xì)胞中Cyt-C濃度極顯著升高(P<0.01),DEX組細(xì)胞中Cyt-C濃度無顯著變化(P>0.05);而與ISO組相比,DEX+ISO組細(xì)胞中Cyt-C濃度顯著降低(P<0.05)(圖6)。結(jié)果表明,右美托咪啶可以降低異氟烷導(dǎo)致的Cyt-C濃度升高。

圖6 右美托咪啶對異氟烷誘導(dǎo)PC12細(xì)胞Cyt-C濃度的影響Fig.6 Effect of dexmedetomidine on isoflurane induced Cyt-C concentration in PC12 cells

2.4 右美托咪啶對異氟烷誘導(dǎo)PC12細(xì)胞細(xì)胞凋亡的影響 與Control組相比,ISO組細(xì)胞綠色熒光顯著增多,而DEX組細(xì)胞綠色熒光基本不變,提示異氟烷可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;而與ISO組相比,DEX+ISO組細(xì)胞綠色熒光顯著減少(圖7)。熒光定量分析結(jié)果顯示,與Control組相比,DEX組綠色/藍(lán)色熒光強(qiáng)度比差異不顯著(P>0.05),ISO組綠色/藍(lán)色熒光強(qiáng)度比極顯著升高(P<0.01);而與ISO組相比,DEX+ISO組綠色/藍(lán)色熒光強(qiáng)度比極顯著降低(P<0.01)(圖8)。結(jié)果表明,右美托咪啶可以抑制異氟烷誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞。

圖7 右美托咪啶對異氟烷誘導(dǎo)PC12細(xì)胞細(xì)胞凋亡的影響(100×)Fig.7 Effect of dexmedetomidine on isoflurane induced apoptosis in PC12 cells (100×)

圖8 右美托咪啶對異氟烷誘導(dǎo)PC12細(xì)胞細(xì)胞凋亡影響的定量分析Fig.8 Quantitative analysis of the effect of dexmedetomidine on isoflurane induced apoptosis in PC12 cells

2.5 右美托咪啶對異氟烷誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度的影響 與Control組(圖9A)相比,ISO組(圖9C)細(xì)胞綠色熒光顯著增強(qiáng),而DEX組(圖9B)細(xì)胞綠色熒光基本一致;DEX+ISO組(圖9D)熒光較ISO組綠色熒光顯著減少。熒光定量分析結(jié)果顯示,與Control組相比,ISO組細(xì)胞胞質(zhì)Ca2+濃度極顯著升高(P<0.01),DEX組無顯著變化;而與ISO組相比,DEX+ISO組細(xì)胞胞質(zhì)Ca2+濃度顯著降低(P<0.05)(圖10)。結(jié)果表明,右美托咪啶可以降低異氟烷誘導(dǎo)的細(xì)胞胞質(zhì)Ca2+濃度的增加。

圖9 右美托咪啶對異氟烷誘導(dǎo)PC12細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中Ca2+濃度的影響Fig.9 Effect of dexmedetomidine on isoflurane induced cytoplasmic Ca2+concentration in PC12 cellsA:Control組; B:DEX組; C:ISO組; D:DEX + ISO組A:Control group; B:DEX group; C:ISO group; D:DEX + ISO group

圖10 右美托咪啶對異氟烷誘導(dǎo)PC12細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中Ca2+濃度影響的定量分析Fig.10 Quantitative analysis of the effect of dexmedetomidine on isoflurane induced cytoplasmic Ca2+ concentration in PC12 cells

3 討論

研究表明,吸入麻醉劑異氟烷可誘導(dǎo)半胱天冬酶-3(Caspase-3)激活、β-淀粉樣肽(Amyloid peptide,Aβ)聚集增加、Tau蛋白磷酸化甚至引起認(rèn)知功能障礙[8,9]。右美托咪啶主要用于全身麻醉的手術(shù)患者氣管插管和機(jī)械通氣時的鎮(zhèn)靜。研究發(fā)現(xiàn),右美托咪啶與麻醉藥合用可以有效降低麻醉藥的使用劑量[10]。因此,本試驗選取右美托咪啶與異氟烷聯(lián)合用藥,通過建立PC12細(xì)胞氧化損傷模型,探究右美托咪啶對異氟烷誘導(dǎo)的線粒體氧化損傷的影響,為臨床安全使用異氟烷提供理論支持。

在離體研究中發(fā)現(xiàn),異氟烷可以增加ROS水平,誘導(dǎo)線粒體功能障礙,降低ATP水平,導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙[11-15]。謝玉珍等[16]在評估不同麻醉對顱腦損傷老年患者氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響時發(fā)現(xiàn),異氟烷能顯著降低SOD和GPX的酶活性。本試驗結(jié)果顯示,PC12細(xì)胞經(jīng)2%異氟烷刺激4 h后產(chǎn)生大量的ROS,說明異氟烷可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS大量聚集。同時本試驗也檢測了MDA、CAT、GPX和SOD等氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo),結(jié)果發(fā)現(xiàn),ISO可上調(diào)PC12細(xì)胞MDA含量,降低抗氧化物酶CAT、GPX和SOD的酶活性,說明異氟烷可導(dǎo)致PC12細(xì)胞氧化損傷。而添加右美托咪啶后可提高CAT、GPX和SOD的酶活性并減少MDA含量。推斷右美托咪啶可以抑制PC12細(xì)胞ROS產(chǎn)生或激活抗氧化物酶活化的相關(guān)通路,發(fā)揮減輕氧化應(yīng)激的作用,但仍需進(jìn)一步試驗驗證。

線粒體跨膜通透性和線粒體膜電位與線粒體膜電位超微結(jié)構(gòu)密切相關(guān)[17]。線粒體超微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變會導(dǎo)致ROS、凋亡相關(guān)蛋白Cyt-C、Apaf-1、Caspase-3和Caspase-9等的釋放,最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。本試驗結(jié)果顯示,異氟烷處理可降低PC12細(xì)胞線粒體膜電位,說明異氟烷能導(dǎo)致線粒體功能紊亂,而添加右美托咪啶能穩(wěn)定線粒體膜電位,減少異氟烷導(dǎo)致的線粒體功能紊亂。已有研究顯示,異氟烷可能通過提高胞質(zhì)鈣水平來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[18]。本試驗結(jié)果顯示,異氟烷處理上調(diào)了細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)的Ca2+、Cyt-C的表達(dá)并導(dǎo)致凋亡細(xì)胞數(shù)目的增加,說明異氟烷造成細(xì)胞線粒體功能障礙和細(xì)胞凋亡,而添加了右美托咪啶處理后可逆轉(zhuǎn)上述結(jié)果。

綜上所述,本試驗采用PC12細(xì)胞作為研究對象,通過檢測氧化應(yīng)激指標(biāo),ROS水平、線粒體膜電位、細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度、促凋亡因子Cyt-C和細(xì)胞凋亡,證實右美托咪啶可通過減少ROS釋放、穩(wěn)定線粒體膜電位、降低Ca2+濃度,減少Cyt-C釋放和抑制細(xì)胞凋亡來減輕異氟烷誘導(dǎo)的線粒體功能障礙。本試驗為進(jìn)一步闡述右美托咪啶對異氟烷誘導(dǎo)的線粒體功能障礙的保護(hù)作用機(jī)理的相關(guān)研究提供數(shù)據(jù)支持。