鞠牧潔,劉金環(huán),蔣永濤,冷楠楠,羅萬和

(1.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆 阿拉爾 843300 ; 2.塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,新疆 阿拉爾 843300)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,S.aureus)嚴(yán)重危害奶牛健康養(yǎng)殖[1]。金黃色葡萄球菌作為一種常見的兼性胞內(nèi)菌,具有多種免疫逃避機(jī)制,可在宿主細(xì)胞內(nèi)持續(xù)存活,使得宿主免疫系統(tǒng)和抗生素難以將其完全清除,進(jìn)而引起胞內(nèi)細(xì)菌感染[2,3]。Siwczak等[4]研究發(fā)現(xiàn),金黃色葡萄球菌能以小菌落變異體(Small colony variant,SCV)形式靶向感染M2型巨噬細(xì)胞,并在胞內(nèi)持續(xù)增殖,這與慢性和隱性奶牛乳腺炎的反復(fù)感染密切相關(guān)。

由于宿主細(xì)胞對(duì)胞內(nèi)金黃色葡萄球菌具有一定的保護(hù)作用,導(dǎo)致常規(guī)藥物難以滲透到胞內(nèi)金黃色葡萄球菌的感染部位,難以達(dá)到有效的治療濃度和時(shí)間[5,6]。例如,氨基糖苷類藥物有較強(qiáng)的極性,被攝入細(xì)胞內(nèi)的藥物達(dá)不到有效殺菌濃度,最終導(dǎo)致金黃色葡萄球菌產(chǎn)生耐藥性[7,8];四環(huán)素類藥物膜滲透率較低,且金黃色葡萄球菌的細(xì)胞膜對(duì)四環(huán)素類藥物有主動(dòng)外排作用,難以殺滅細(xì)菌[9];β-內(nèi)酰胺類藥物一直是治療革蘭陽性菌的首選抗生素,但由于其不合理使用導(dǎo)致越來越多的細(xì)菌對(duì)其產(chǎn)生嚴(yán)重的耐藥性[10]。大環(huán)內(nèi)酯類藥物具有較強(qiáng)的膜滲透性,其中替米考星是一種半合成的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素,對(duì)多種革蘭陽性菌和部分革蘭陰性菌、支原體和螺旋體等均具有良好的抗菌活性[11,12]。由胞內(nèi)金黃色葡萄球菌引起的奶牛乳腺炎的典型特征是持續(xù)性和反復(fù)性感染,因此對(duì)于奶牛乳腺炎的治療應(yīng)首選長(zhǎng)效制劑。而替米考星具有良好的抗生素后效應(yīng),其半衰期長(zhǎng),生物利用度高,且口服給藥后靶部位藥物濃度高于血漿藥物濃度[13,14]。研究發(fā)現(xiàn),替米考星對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度(Minimum inhibitory concentration,MIC)為 2 μg/mL,推測(cè)替米考星對(duì)胞內(nèi)金黃色葡萄球菌同樣具有較強(qiáng)的抗菌活性[15]。

本試驗(yàn)以金黃色葡萄球菌ATCC 29213為靶細(xì)菌,以小鼠單核巨噬細(xì)胞(RAW264.7)為載體細(xì)胞,在構(gòu)建金黃色葡萄球菌感染細(xì)胞體系的基礎(chǔ)上,測(cè)定胞內(nèi)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)曲線、MIC、最低殺菌濃度(Minimum bactericidal concentration,MBC)、防突變濃度(Mutant prevention concentration,MPC)、耐藥突變選擇窗(Mutant selection window,MSW)、抗菌后效應(yīng)(Post-antibiotic effect,PAE)和殺菌曲線,旨在探究替米考星對(duì)胞內(nèi)金黃色葡萄球菌的抗菌活性,為防治胞內(nèi)金黃色葡萄球菌感染提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 藥品和試劑 替米考星溶液,購(gòu)自山東雨澤銀豐動(dòng)物藥業(yè)有限公司,批號(hào):20201101;Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)培養(yǎng)基、四甲基偶氮唑藍(lán)(Methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)、二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)和磷酸鹽緩沖液,均購(gòu)自武漢默瑞斯生物科技有限公司;胰蛋白酶大豆肉湯(Tryptic soytone broth,TSB)培養(yǎng)基和甘露醇鹽瓊脂(Mannitol salt aga,MSA)培養(yǎng)基,均購(gòu)自鼎源生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 主要儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱,長(zhǎng)沙長(zhǎng)錦科技有限公司產(chǎn)品;PCR儀,山東恒美電子科技有限公司產(chǎn)品;Micro Screen高通量實(shí)時(shí)微生物生長(zhǎng)儀,廣州湘喜生物科技有限公司產(chǎn)品;酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀,北京凱奧科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 試驗(yàn)菌株 金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC 29213),由塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院提供。

1.2 金黃色葡萄球菌的培養(yǎng) 將復(fù)蘇的金黃色葡萄球菌加入TSB培養(yǎng)基中,培養(yǎng)18～24 h。復(fù)蘇后的金黃色葡萄球菌傳代培養(yǎng)3次以上。

1.3 RAW264.7細(xì)胞的培養(yǎng) 將RAW264.7細(xì)胞復(fù)蘇后,加入DMEM培養(yǎng)基,培養(yǎng)24 h后傳代。

1.4 金黃色葡萄球菌感染細(xì)胞體系的構(gòu)建 向鋪有RAW264.7細(xì)胞的24孔板中加入金黃色葡萄球菌(1×107CFU/mL)(模型組)或者DMEM培養(yǎng)基(對(duì)照組),培養(yǎng)1 h后加入0.5 mL慶大霉素(100 μg/mL),共同孵育30 min以殺滅細(xì)胞外的金黃色葡萄球菌,因慶大霉素?zé)o法透過生物膜屏障,所以對(duì)胞內(nèi)菌株無殺滅作用 [慶大霉素對(duì)金黃色葡萄球菌的90%最低抑菌濃度(90% minimum inhibitory concentration,MIC90)為1 μg/mL][16,17]。使用PBS沖洗殘留的慶大霉素后,用細(xì)胞裂解液裂解被感染的細(xì)胞,并涂布于MSA平板。若金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)良好,則可初步判斷金黃色葡萄球菌感染細(xì)胞體系構(gòu)建成功。通過PCR方法進(jìn)一步驗(yàn)證金黃色葡萄球菌感染細(xì)胞體系是否構(gòu)建成功。PCR引物序列(nuc基因)見表1,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系(50 μL)和程序參照參考文獻(xiàn)[18],分別以滅菌去離子水和金黃色葡萄球菌ATCC 29213為陰性和陽性對(duì)照。

表1 PCR引物信息Table 1 PCR primer information

1.5 胞內(nèi)金黃色葡萄球菌在RAW264.7細(xì)胞中生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 將構(gòu)建好的感染細(xì)胞體系置于培養(yǎng)箱中,分別在培養(yǎng)0、0.5、1、2、3、4、6、8、12、18、24和48 h時(shí),吸棄細(xì)胞培養(yǎng)液,用PBS清洗3次。加入細(xì)胞裂解液,以釋放出胞內(nèi)細(xì)菌。使用Micro Screen高通量實(shí)時(shí)微生物生長(zhǎng)儀測(cè)定金黃色葡萄球菌的濃度,以菌液濃度與培養(yǎng)時(shí)間的關(guān)系繪制金黃色葡萄球菌在RAW264.7細(xì)胞中的生長(zhǎng)曲線。

1.6 替米考星對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響 將200 μL RAW264.7細(xì)胞懸液(細(xì)胞濃度為1×104個(gè)/mL)接種于96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h,每孔加入含有128、64、32和16 μg/mL替米考星的DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液,同時(shí)設(shè)置空白組(僅有DMEM培養(yǎng)基)和對(duì)照組(僅有細(xì)胞和DMEM培養(yǎng)基)。培養(yǎng)6、12和24 h后,使用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于490 nm處測(cè)定吸光度(Optical density,OD)值,進(jìn)而計(jì)算細(xì)胞存活率[16]。

1.7 替米考星對(duì)胞內(nèi)金黃色葡萄球菌MIC和MBC的測(cè)定 在感染細(xì)胞體系中分別加入倍比稀釋的替米考星溶液(濃度為128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125和0.062 5 μg/mL),并設(shè)陰性對(duì)照(只有細(xì)胞)和陽性對(duì)照(只有細(xì)菌和細(xì)胞)。培養(yǎng)18～24 h后,經(jīng)細(xì)胞裂解液釋放出胞內(nèi)細(xì)菌,并使用Micro Screen高通量實(shí)時(shí)微生物生長(zhǎng)儀測(cè)定細(xì)菌濃度。

1.8 替米考星對(duì)胞內(nèi)金黃色葡萄球菌MPC的測(cè)定 將感染細(xì)胞體系置于培養(yǎng)箱培養(yǎng),待細(xì)菌濃度達(dá)1×107CFU/mL后,離心,重懸,調(diào)節(jié)細(xì)菌濃度約為1×109CFU/mL。加入含有不同濃度替米考星(4、2、1、1/2和0×MIC)的細(xì)胞培養(yǎng)基,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h后,初始防突變濃度(Initial mutation prevention concentration,MPCpr)為無菌落生長(zhǎng)的最低藥物濃度。以MPCpr為基礎(chǔ),按20% MPCpr重復(fù)以上步驟,得到最終MPC和MSW(MSW=MIC-MPC)。

1.9 替米考星對(duì)胞內(nèi)金黃色葡萄球菌PAE的測(cè)定 在感染細(xì)胞體系中分別加入不同濃度替米考星(4、2和1×MIC),使用Micro Screen高通量實(shí)時(shí)微生物生長(zhǎng)儀測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)(0、1和2 h)的細(xì)菌濃度,計(jì)算PAE[14]。

1.10 殺菌曲線的繪制 在感染細(xì)胞體系中分別加入不同濃度替米考星(4、2、1、1/2和0×MIC),并設(shè)空白對(duì)照(同體積的DMEM培養(yǎng)基)。在共同孵育0、1、2、4、8、12、18、24和48 h后,經(jīng)裂解液釋放出胞內(nèi)細(xì)菌,使用Micro Screen高通量實(shí)時(shí)微生物生長(zhǎng)儀測(cè)定細(xì)菌濃度,以孵育時(shí)間為橫坐標(biāo),細(xì)菌濃度為縱坐標(biāo)繪制殺菌曲線。

2 結(jié)果

2.1 金黃色葡萄球菌感染細(xì)胞體系的構(gòu)建 MSA平板觀察結(jié)果如圖1A所示,對(duì)照組MSA平板無金黃色葡萄球菌生長(zhǎng),而模型組中被感染的細(xì)胞釋放出金黃色葡萄球菌后,在MSA平板上生長(zhǎng)良好。PCR結(jié)果如圖1B所示,金黃色葡萄球菌擴(kuò)增產(chǎn)物為279 bp。綜合以上結(jié)果表明,已成功構(gòu)建金黃色葡萄球菌感染細(xì)胞體系,可用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 金黃色葡萄球菌感染RAW264.7細(xì)胞體系的構(gòu)建Fig.1 Construction of RAW264.7 cells system infected by Staphylococcus aureusA:MSA平板觀察(1:對(duì)照組; 2:模型組); B:胞內(nèi)金黃色葡萄球菌的PCR檢測(cè)(M:DL2 000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1:空白孔; 2:待測(cè)孔; P:陽性對(duì)照; N:陰性對(duì)照)A:MSA plate observation (1:Control group; 2:Model group); B:PCR detection of intracellular Staphylococcus aureus (M:DL2 000 DNA relative molecular weight standard; 1:Blank hole; 2:Test hole; P:Positive control; N:Negative control)

2.2 胞內(nèi)金黃色葡萄球菌在RAW264.7細(xì)胞中生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 如圖2所示,在0.5、1、2、3和4 h時(shí),胞內(nèi)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)緩慢,故0～4 h為遲緩期;在6、8、12和18 h時(shí),胞內(nèi)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)迅速,細(xì)菌濃度快速增加,故4～18 h為對(duì)數(shù)期,且此時(shí)細(xì)菌致病力最強(qiáng);在24 h時(shí),胞內(nèi)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)數(shù)與死亡數(shù)相似,故18～24 h為穩(wěn)定期;在48 h時(shí),死亡細(xì)菌濃度逐漸上升,活菌濃度逐漸減少,故24～48 h為衰亡期。

圖2 金黃色葡萄球菌在RAW264.7細(xì)胞中的生長(zhǎng)曲線(Mean±SD,n=3)Fig.2 Growth curve of Staphylococcus aureus in RAW264.7 cells (Mean±SD,n=3)

2.3 替米考星對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響 如圖3所示,細(xì)胞存活率會(huì)隨著替米考星濃度和孵育時(shí)間的增加而降低,但濃度為128 μg/mL替米考星與RAW264.7細(xì)胞共同孵育24 h時(shí),細(xì)胞存活率仍然高于80%。結(jié)果表明,替米考星對(duì)RAW264.7細(xì)胞無毒性作用。

圖3 替米考星對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響(Mean±SD,n=3)Fig.3 Effects of tilmicosin on cell viability of RAW264.7 cells (Mean±SD,n=3)

2.4 替米考星對(duì)胞內(nèi)金黃色葡萄球菌MIC、MBC、MPCpr、MPC和MSW的測(cè)定 經(jīng)測(cè)定,替米考星對(duì)胞內(nèi)金黃色葡萄球菌的MIC和MBC分別為4和8 μg/mL;MPCpr為16 μg/mL,最終MPC為12.8 μg/mL,故MSW范圍為4～12.8 μg/mL。

2.5 替米考星對(duì)胞內(nèi)金黃色葡萄球菌PAE的測(cè)定 結(jié)果如表2所示,當(dāng)替米考星與胞內(nèi)金黃色葡萄球菌共同孵育1 h時(shí),隨著替米考星濃度的增大,產(chǎn)生PAE的時(shí)間略微延長(zhǎng);當(dāng)替米考星與胞內(nèi)金黃色葡萄球菌的共同孵育2 h時(shí),產(chǎn)生PAE的時(shí)間明顯延長(zhǎng)。結(jié)果表明,隨著時(shí)間的增加,產(chǎn)生PAE的時(shí)間明顯延長(zhǎng),表現(xiàn)出明顯的時(shí)間依賴性的殺菌特點(diǎn)。另外,隨著藥物濃度的增大,產(chǎn)生PAE的時(shí)間也隨之延長(zhǎng)。

表2 替米考星對(duì)胞內(nèi)金黃色葡萄球菌的抗菌后效應(yīng)Table 2 PAE of tilmicosin against intracellular Staphylococcus aureus

2.6 殺菌曲線的繪制 如圖4所示,替米考星對(duì)胞內(nèi)金黃色葡萄球菌具有明顯的抗菌活性,隨著替米考星濃度的增大,殺菌效果隨之增強(qiáng)。

圖4 替米考星對(duì)胞內(nèi)金黃色葡萄球菌的殺菌曲線(n=3)Fig.4 Bactericidal curve of tilmicosin against intracellular Staphylococcus aureus(n=3)

3 討論

由金黃色葡萄球菌引起的奶牛乳腺炎會(huì)引起牛奶產(chǎn)量和質(zhì)量下降,給奶牛養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大損失。金黃色葡萄球菌作為一種常見的兼性胞內(nèi)菌,可在宿主細(xì)胞內(nèi)持續(xù)存活,從而巧妙地抵御抗生素殺傷作用和宿主免疫系統(tǒng)殺菌作用[19]。M2型巨噬細(xì)胞主要負(fù)責(zé)在感染后期的組織修復(fù),隨著胞內(nèi)金黃色葡萄球菌的不斷增殖,使巨噬細(xì)胞死亡裂解釋放金黃色葡萄球菌,從而感染周圍健康組織形成膿腫,這與奶牛長(zhǎng)期、反復(fù)感染金黃色葡萄球菌性乳腺炎密切相關(guān)[20]。替米考星對(duì)金黃色葡萄球菌的抗菌活性較強(qiáng),且具有良好的組織穿透性,可作為治療胞內(nèi)金黃色葡萄球菌感染的優(yōu)選藥物[21]。Martínez-Cortés 等[22]研究證明,替米考星是一種有效的乳腺炎癥調(diào)節(jié)劑,可通過調(diào)節(jié)絲裂原活化蛋白激酶磷酸化、活性氧自由基產(chǎn)生和促炎細(xì)胞因子分泌等,來修復(fù)由金黃色葡萄球菌感染引起的細(xì)胞損傷,有助于維持牛乳腺上皮細(xì)胞的正常生理功能。

本試驗(yàn)通過測(cè)定替米考星對(duì)胞內(nèi)金黃色葡萄球菌的MIC、MBC、MPC、MSW和PAE,發(fā)現(xiàn)替米考星對(duì)胞內(nèi)金黃色葡萄球菌有較強(qiáng)抗菌活性,明確了替米考星對(duì)胞內(nèi)金黃色葡萄球菌的殺菌特點(diǎn)具有明顯的時(shí)間依賴性,對(duì)于制定替米考星治療奶牛乳腺炎的合理給藥方案具有重要意義,并且可避免耐藥性的產(chǎn)生。MSW對(duì)探究替米考星對(duì)胞內(nèi)菌的耐藥性有很好的參考價(jià)值,當(dāng)藥物濃度在4～12.8 μg/mL時(shí),替米考星對(duì)胞內(nèi)金黃色葡萄球菌有較好的臨床治愈率,但也容易出現(xiàn)耐藥突變體的選擇性富集[15]。所以選擇替米考星治療胞內(nèi)金黃色葡萄球菌感染時(shí),藥物濃度至少≥12.8 μg/mL,即在殺滅敏感株和耐藥菌株的同時(shí),又可避免胞內(nèi)金黃色葡萄球菌耐藥性的產(chǎn)生[23]。PAE可延長(zhǎng)抗菌藥物和細(xì)菌之間的作用時(shí)間,在一定范圍內(nèi),產(chǎn)生PAE的時(shí)間長(zhǎng)短與藥物濃度和作用時(shí)間成正比[24]。本試驗(yàn)中替米考星對(duì)胞內(nèi)金黃色葡萄球菌的PAE結(jié)果顯示,隨著作用時(shí)間的增加,產(chǎn)生PAE的時(shí)間明顯延長(zhǎng),即替米考星對(duì)胞內(nèi)金黃色葡萄球菌的殺菌特點(diǎn)具有明顯的時(shí)間依賴性(時(shí)-效關(guān)系)。根據(jù)這一特點(diǎn)可以適當(dāng)增加替米考星的給藥濃度和延長(zhǎng)作用時(shí)間,提高藥物在胞內(nèi)的停留時(shí)間,以獲得更好的殺菌效果。藥效學(xué)作為藥動(dòng)學(xué)-藥效學(xué)模型(Pharmacokinetic-pharmacodynamic modeling,PK-PD modeling)的重要組成部分,對(duì)于研究藥物在體外的抗菌活性有參考價(jià)值[25-27]。本試驗(yàn)替米考星對(duì)胞內(nèi)金黃色葡萄球菌的殺菌特點(diǎn)具有明顯的時(shí)間依賴性,可判斷其PK-PD擬合參數(shù)為T>MIC。因此,本試驗(yàn)有望增強(qiáng)替米考星對(duì)胞內(nèi)金黃色葡萄球菌的抗菌活性,對(duì)于替米考星的合理使用具有一定的參考價(jià)值。本試驗(yàn)中替米考星對(duì)胞內(nèi)金黃色葡萄球菌的MIC和MBC值為分別為4和8 μg/mL,而替米考星對(duì)金黃色葡萄球菌ATCC 29213體外抑菌的MIC為2 μg/mL[15]。這可能是由于宿主細(xì)胞對(duì)金黃色葡萄球菌具有一定的保護(hù)作用,使?jié)B透進(jìn)入胞內(nèi)的藥物濃度偏低,所以導(dǎo)致替米考星對(duì)胞內(nèi)金黃色葡萄球菌的MIC偏大[5,6,7,28]。其次由于體外培養(yǎng)和細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的差異,也可能會(huì)對(duì)胞內(nèi)金黃色葡萄球菌產(chǎn)生一定的影響[29]。

本試驗(yàn)雖證明了替米考星在治療胞內(nèi)金黃色葡萄球菌感染中具有較好的抗菌活性,但也存在一定的局限性,在體外構(gòu)建的胞內(nèi)金黃色葡萄球菌感染模型較為簡(jiǎn)單,無法反映由胞內(nèi)金黃色葡萄球菌感染所引起奶牛乳腺炎的復(fù)雜程度。故在本試驗(yàn)基礎(chǔ)上,后續(xù)將開展替米考星對(duì)由胞內(nèi)金黃色葡萄球菌引發(fā)奶牛乳腺炎的臨床療效評(píng)價(jià),以此驗(yàn)證在本試驗(yàn)中的關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)。