摘 要： 為了解黃精根狀莖轉(zhuǎn)錄組中簡單重復(fù)序列SSR的分布特點(diǎn)，充分開發(fā)SSR分子標(biāo)記，本研究對黃精根狀莖進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，SSR位點(diǎn)分析與引物設(shè)計。以獲得的61 116 條Unigene 為試材，采用MISA軟件檢索出黃精的SSR位點(diǎn)，利用Primer 3 軟件對檢索到的SSR基序進(jìn)行引物設(shè)計。結(jié)果表明：黃精轉(zhuǎn)錄組中檢索出30 541 個SSR位點(diǎn)，其發(fā)生頻率分別為49.97%。單核苷酸和二核苷酸重復(fù)是黃精SSR 的主要基序類型，以A/T 和AG/CT基序的出現(xiàn)頻率最高，占SSR總數(shù)的68.84%。通過引物設(shè)計，最終在黃精轉(zhuǎn)錄組中獲得15 842 對引物。因此，我們認(rèn)為黃精根狀莖轉(zhuǎn)錄組SSR位點(diǎn)的出現(xiàn)頻率較高，為黃精的遺傳多樣性分析、分子育種等研究提供參考。

關(guān)鍵詞： 黃精；轉(zhuǎn)錄組；SSR；序列特征；引物開發(fā)

中圖法分類號： S688.9 文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A 文章編號： 1000-2324（2024）06-0908-06

黃精（Polygonatum sibiritum Red）是百合科（Liliaceae）多年生草本植物，具有豐富的藥用價值，其干燥根莖可做為中藥材使用［1］，以野生型居多，主要分布于湖南、山西、河南等地［2］?！睹t(yī)別錄》記載：黃精味甘，平，無毒。主補(bǔ)中益氣，除風(fēng)濕，安五臟。久服輕身、延年、不饑［3］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，黃精具有健脾、補(bǔ)氣養(yǎng)陰、益腎、潤肺等功效［4］。近年來，黃精藥材的使用主要靠野生植株，這導(dǎo)致黃精野生資源匱乏，目前黃精在湖北、貴州等地有一定規(guī)模的種植，但其種植規(guī)模還不能滿足市場需求。因此研究黃精分子標(biāo)記輔助育種非常有必要。

分子標(biāo)記目前已廣泛應(yīng)用于植物分子標(biāo)記輔助育種、種質(zhì)評價、基因定位以及遺傳多樣性等不同的領(lǐng)域［5］。目前，利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)來開發(fā)SSR 引物的研究已應(yīng)用于多種藥用植物，例如，利用SSR標(biāo)記從華細(xì)辛（Asarum sieboldii）轉(zhuǎn)錄組中篩選得到的16 個多態(tài)性豐富且重復(fù)性好的SSR 標(biāo)記，分析發(fā)現(xiàn)華細(xì)辛遺傳多樣性較為貧乏，遺傳分化主要發(fā)生在種群間［6］；通過對掌葉覆盆子（Rubus chingii Hu）的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，豐富了掌葉覆盆子及至整個懸鉤子屬的分子標(biāo)記庫、為后續(xù)的遺傳多樣性研究、基因定位以及分子育種提供有效工具［7］；在板栗（Castanea sativa Mill）的種質(zhì)資源的多樣性水平和適應(yīng)性研究中，SSR分子標(biāo)記是非常重要的手段之一［8］。以上研究表明了SSR 分子標(biāo)記在藥用植物遺傳多樣性及分子育種等方面具有重要意義。

截至目前，不同產(chǎn)地黃精屬植物利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行SSR 位點(diǎn)的檢測分析的研究已經(jīng)出現(xiàn)較多，但對于湖北省恩施州栽培的黃精的SSR位點(diǎn)檢查分析還鮮有報道。而黃精SSR 位點(diǎn)的再次開發(fā)不僅可以提高引物質(zhì)量和效率，還能發(fā)掘新的SSR位點(diǎn)以改進(jìn)引物設(shè)計的方法。因此，本研究以栽培于湖北省恩施州的黃精根狀莖為研究材料，通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)獲得轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)信息，從中進(jìn)行SSR 位點(diǎn)信息分析，以期為黃精分子標(biāo)記輔助育種、遺傳多樣性分析等探索提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究所用黃精栽培于湖北民族大學(xué)林學(xué)園藝學(xué)院試驗基地。研究材料為同園栽培2 年以上的黃精新鮮根狀莖，采挖后將樣品清洗干凈用液氮速凍，保存于?80 ℃冰箱，后置于干冰內(nèi)保溫送樣，實(shí)驗設(shè)置3 個生物學(xué)重復(fù)，測序工作由武漢邁特維爾生物科技有限公司完成。

1.2 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來源

取黃精根狀莖，在液氮中研磨成粉末，進(jìn)行RNA提取、RNA質(zhì)量檢查、RNA文庫構(gòu)建、RNA文庫質(zhì)檢，文庫質(zhì)檢合格后在Illumina 平臺進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。我們將測得的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾篩選得到高質(zhì)量的reads，再經(jīng)過Trinity 拼接得到該物種的轉(zhuǎn)錄本序列。

1.3 黃精根狀莖SSR特點(diǎn)分析

利用MISA （MIcro SAtellite Identificationtool）在線軟件搜尋黃精Unigene 的SSR 位點(diǎn)。篩選時單核苷酸重復(fù)不少于10，二核苷酸重復(fù)次數(shù)不少于6，三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸以及六核苷酸重復(fù)次數(shù)均不少于5［9］。

1.4 SSR引物設(shè)計與PCR擴(kuò)增

使用Primer 3 軟件對序列進(jìn)行引物設(shè)計，引物的設(shè)計標(biāo)準(zhǔn)為：退火溫度（Tm）為57～62 ℃，上游引物和下游引物的退火溫度相差小于5 ℃，引物序列長度為100～300 bp， GC 含量為36%～73%，設(shè)計過程盡量避免出現(xiàn)錯配、發(fā)卡結(jié)構(gòu)、引物二聚體等引物二級結(jié)構(gòu)。在設(shè)計出的引物中隨機(jī)篩選12 對引物進(jìn)行PCR 驗證（PCR 擴(kuò)增程序：預(yù)變性時間2 min，94 ℃ ；變性時間30 s，94 ℃；退火時間30 s，58 ℃；延伸時間45 s，72 ℃（30 個循環(huán)）；終延伸時間5 min，72 ℃）。擴(kuò)增結(jié)束后，取樣進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR的可用性評價

轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果顯示，本研究共獲得61 116 個Unigenes 和19 794 個SSR 位點(diǎn)。在以往的研究中，當(dāng)SSR長度低于12 bp 時，通常認(rèn)為其多態(tài)性非常低；長度介于12～20 bp 之間時，通常認(rèn)為其多態(tài)性處于中等狀態(tài)；而長度大于等于20 bp 時，則認(rèn)為其多態(tài)性處于最佳［10］。對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選（表1），發(fā)現(xiàn)黃精中有19.44%的SSR 其長度大于20 bp，此類SSR 位點(diǎn)的多態(tài)性處于最佳。

2.2 SSR位點(diǎn)的數(shù)量與分布

對黃精轉(zhuǎn)錄組中的SSR序列進(jìn)行檢索分析。發(fā)現(xiàn)黃精轉(zhuǎn)錄組共獲得總長度為76 994 025 bp的61 116 條Unigenes，其中，30 541 個SSR 位點(diǎn)被找到（表2）。在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中，單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸SSR 位點(diǎn)重復(fù)次數(shù)分別為10 879、10 127、6 268、2 427、81 和759，百分比分別為35.62%、33.16%、20.52%、7.95%、0.27%和2.49%。其中，單核苷酸和二核苷酸占總SSR 的68.78%。重復(fù)出現(xiàn)次數(shù)，主要為重復(fù)6 次（5 821 個，19.06%），其次為重復(fù)10 次（5 181 個，16.96%）、重復(fù)5 次（5 180 個，16.96%），重復(fù)次數(shù)相對較少的SSR位點(diǎn)為重復(fù)7、11、≥15、8、12，依次為10.40%、8.61%、7.59%、6.44%和5.43%。重復(fù)次數(shù)極少的SSR 位點(diǎn)為重復(fù)9、13 和14 次，依次為3.21%、2.96%和2.38%（表3）。

2.3 SSR位點(diǎn)的分布

黃精轉(zhuǎn)錄組SSR 中檢索到117 種不同的重復(fù)基序序列，其中，單核苷酸重復(fù)序列以A/T 為主（10 828 個，35.45%）；二核苷酸重復(fù)序列以AG/CT（4 490 個，14.70%）和AA/TT（4 260 個，13.95%）為主；三核苷酸重復(fù)序列以AAA/TTT為主（1 670 個，5.47%）；四核苷酸重復(fù)序列以AGAG/CTCT 為主（1 530 個，5.01%）；五核苷酸重復(fù)序列以AAAAA/TTTTT 為主（26 個，0.09%）；六核苷酸重復(fù)序列以AGAGAG/CTCTCT 為主（580 個，1.09%）。數(shù)量分別為2種、6種、12種、25種、20種和52種。

2.4 黃精SSR引物設(shè)計

利用Primer 3 軟件對黃精組裝與去冗余后得到的61 116 個Unigene 的30 541 個SSR 位點(diǎn)進(jìn)行引物設(shè)計，最終設(shè)計出了15 842 對引物，成功率為51.92%。隨機(jī)從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選出12 對不同重復(fù)類型的引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增（表4，圖2）。發(fā)現(xiàn)有7 對引物擴(kuò)增成功，擴(kuò)增成功率為58%，初步表明轉(zhuǎn)錄組SSR引物可靠性較好。

3 討論與結(jié)論

在對黃精屬植物研究越來越深入的今天，基于轉(zhuǎn)錄組開發(fā)的SSR分子標(biāo)記越來越多，與其他分子標(biāo)記相比，SSR 分子標(biāo)記具有信息量大、多態(tài)性高、重復(fù)性好等優(yōu)勢［10］。據(jù)現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，目前人們已利用SSR 分子標(biāo)記已對不同地區(qū)的黃精、多花黃精、湖北黃精、滇黃精、卷葉黃精和玉竹等多個品種進(jìn)行了SSR 遺傳差異分析［11］。但對栽培于湖北省恩施州的黃精植物SSR 特點(diǎn)的分析還鮮有報道，因此建立栽培于湖北省恩施州的黃精SSR分子標(biāo)記體系非常必要。

本研究檢索出的30 541個SSR位點(diǎn)源于黃精根狀莖轉(zhuǎn)錄組的61 116條Unigenes中，出現(xiàn)頻率為49.97%。這遠(yuǎn)高于同屬植物滇黃精（Polygonatumkingianum coll. et Hemsl）（13.11%）［12］和多花黃精（Polygonatum cyrtonema Hua）（9.73%）［13］SSR 位點(diǎn)的出現(xiàn)頻率。說明黃精可能較同屬植物而言具有更高的遺傳多樣性。此外，與其他種類植物相比，黃精轉(zhuǎn)錄組SSR位點(diǎn)出現(xiàn)頻率高于多頭菊花（Chrysanthemum multiflorum）（19.77%）［14］、海南粗榧（ Cephalotaxus hainanensis）（17.69%）［15］、君遷子（Diospyros lotus Linn）（10.71%）［16］、刺槐（Robiniapseudoacacia）（13.88%）［17］ 和野三七（Panaxvietnamensis var.fuscidiscus）（16.82 %）［18］等。但低于沙鞭（Psammochloa villosa）（50.83%）［19］的SSR位點(diǎn)出現(xiàn)頻率。這表明同屬植物和非同屬植物間的轉(zhuǎn)錄組SSR 豐富度均不同。而SSR 含量存在物種之間的差異性，可能與分析方法和SSR搜索條件的不同等有關(guān)［20］。

黃精轉(zhuǎn)錄組的SSR頻率類型豐富，以單核苷酸和二核苷酸重復(fù)為主，這與Yang 等人的研究結(jié)論相同［21］，因此推測黃精屬植物的SSR位點(diǎn)重復(fù)規(guī)律以及個數(shù)存在相似的情況。本研究中的單核苷酸重復(fù)占SSR 總數(shù)的35.62%，二核苷酸重復(fù)占SSR 總數(shù)的33.16%，后依次是三核苷酸（20.52%）、四核苷酸（7.95%）、六核苷酸（2.49%）和五核苷酸（0.27%）。此外，我們發(fā)現(xiàn)單核苷酸重復(fù)序列以A/T 為主（35.45%）；二核苷酸重復(fù)序列以AG/CT（14.70%）和AA/TT（13.95%）為主；三核苷酸重復(fù)序列以AAA/TTT 為主（5.47%）；四核苷酸重復(fù)序列以AGAG/CTCT 為主（5.01%）；五核苷酸重復(fù)序列以AAAAA/TTTTT為主（0.09%）；六核苷酸重復(fù)序列以AGAGAG/CTCTCT 為主（1.09%）。本研究隨機(jī)挑選12 對引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增成功率高達(dá)58%，且擴(kuò)增產(chǎn)物長度與預(yù)期相符，說明開發(fā)黃精的SSR引物具有較強(qiáng)的可用性。

綜上所述，研究證明了黃精根狀莖轉(zhuǎn)錄組中的SSR 位點(diǎn)出現(xiàn)頻率較高，且類型豐富，具有一定的研究開發(fā)價值，這將為黃精的種間分子鑒別、分子標(biāo)記輔助育種以及遺傳多樣性分析等提供科學(xué)的依據(jù)。

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