張華，范松，劉冀琴，張學(xué)軍

（1.天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系，天津 300070；2.武警特色醫(yī)學(xué)中心檢驗(yàn)科，天津 300162；3.武警河北省總隊(duì)醫(yī)院檢驗(yàn)科，石家莊 050000）

肝細(xì)胞癌（HCC）是最常見(jiàn)的原發(fā)性肝癌類(lèi)型，也是全球癌癥相關(guān)死亡的第四大原因[1]。在大多數(shù)情況下，HCC 是由肝硬化肝臟的慢性炎癥發(fā)展而來(lái)，并與乙型和丙型病毒性肝炎感染、長(zhǎng)期飲酒或攝入黃曲霉毒素等病因相關(guān)[2]。大多數(shù)患者確診時(shí)已處于晚期，可選擇的治療方案非常有限。目前，手術(shù)切除仍是HCC 的主要治療手段，但高達(dá)70%的HCC 患者在接受手術(shù)切除5 年后復(fù)發(fā)[3]，此外，對(duì)于大多數(shù)晚期HCC 患者，索拉非尼似乎是臨床上最有效的化療藥物，但其使用和功能受到許多不確定因素的限制[4]。因此，HCC 的總體5 年生存率低于18%，迫切需要新的治療方法來(lái)提高診斷效率，延長(zhǎng)患者的生存期。miRNA 是一種長(zhǎng)約22 個(gè)核苷酸的非編碼RNA，可調(diào)控多種癌癥的進(jìn)展。越來(lái)越多的研究報(bào)道功能性miRNA 在腫瘤組織和細(xì)胞系中表達(dá)失調(diào)，在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[5]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，miR-129-5p 在多種腫瘤中異常表達(dá)，如膠質(zhì)瘤[6]、前列腺癌[7]、肺癌[8]、肝癌[9]、腎癌[10]等。然而，miR-129-5 在HCC 中的確切表達(dá)和功能仍有待確定。人類(lèi)婆羅雙樹(shù)樣基因-4（SALL4）是一種與腫瘤細(xì)胞惡性增殖不可分割的鋅指轉(zhuǎn)錄因子，本研究旨在探討miR-129-5p 在HCC 中的表達(dá)和功能，并分析其潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 正常人肝細(xì)胞株（LO2）和人肝癌細(xì)胞株（HCCLM3、SK-Hep-1、SMMC-7721、PLC/PRF/5、HepG2、HepG2-luc、Huh7、Hep3B）均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院中國(guó)細(xì)胞庫(kù)（上海）。LO2、HCCLM3、SK-Hep-1、SMMC-7721、PLC/PRF/5、HepG2、HepG2-luc、Huh7 和Hep3B 在DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。所有培養(yǎng)基均含有10%胎牛血清（FBS）（Gibco）、1%青霉素和鏈霉素（Gibco）。在37℃含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)所有細(xì)胞系。細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-129-5p mimic 或mimic control（Gene-Pharma），使用Lipofectamine 3 000（Thermo Fisher）按說(shuō)明書(shū)步驟轉(zhuǎn)染48 h，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 樣本收集 本研究收集了2021 年1 月到12月武警特色醫(yī)學(xué)中心接受手術(shù)的20 例HCC 患者及正常人對(duì)照血清。所有患者在手術(shù)前均未接受化療或放療。

1.3 CCK8 檢測(cè)細(xì)胞存活率 收集各組細(xì)胞，將細(xì)胞種于96 孔板中，密度為5×103個(gè)/孔，分別經(jīng)過(guò)24、48、72 h 培養(yǎng)后加入10 μL 的CCK-8 溶液，37℃孵育4 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度（450 nm）。

1.4 細(xì)胞克隆形成檢測(cè) 在克隆形成實(shí)驗(yàn)中，將1 000 個(gè)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞接種在6 孔板中，在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)14 d 后，用PBS 清洗細(xì)胞，4%多聚甲醛固定20 min，0.1%結(jié)晶紫溶液再染色20 min，顯微鏡下計(jì)數(shù)克隆形成情況。

1.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)估肝癌細(xì)胞的遷移能力。將各種細(xì)胞接種于6 孔板，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%，用20 μL 移液管尖端在底部劃出一條直線。37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 后，光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞遷移距離。

1.6 Transwell 小室檢測(cè)細(xì)胞侵襲 在涂有基質(zhì)膠的Transwell 小室中進(jìn)行細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞接種在6 孔板中進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h 后，將細(xì)胞接種到涂有基質(zhì)膠的侵入室的上隔室。孵育16 h 后，將侵入插入物底部的細(xì)胞染色并在顯微鏡下計(jì)數(shù)。

1.7 熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-129-5p 與SALL4 的靶向關(guān)系 使用StarBase 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//starbase.sysu.edu.cn/index.php）預(yù)測(cè)miR-129-5p 的靶基因。實(shí)驗(yàn)分為4 組：pmirGLO/SALL4-UTR+mimics control、pmirGLO/SA-LL4-UTR+miR-129-5p mimics、pmir-GLO/SALL4-mUTR+mimics control 和pmirGLO/SALL4-mUTR+miR-129-5p mimics。將攜帶SALL4 野生型（pmirGLO/SALL4-UTR）、突變型（pmirGLO/SALL4-mUTR）的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入細(xì)胞中，或同時(shí)轉(zhuǎn)入miR-129-5p 模擬物，均培養(yǎng)48 h，隨后吸去培養(yǎng)液，并洗滌細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液處理5～10 min，然后以3 000 r/min 離心5 min，取上清液進(jìn)行發(fā)光測(cè)定。

1.8 RT-qPCR 按照總RNA 提取試劑盒的說(shuō)明從血清或細(xì)胞中提取總RNA，并測(cè)定其濃度和純度。然后根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的RNA 全部反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，檢測(cè)基因表達(dá)水平。

1.9 Western 印跡法 采用RIPA 裂解緩沖液（Beyotime），從細(xì)胞中分離總蛋白。采用BCA 試劑盒（Beyotime）定量總蛋白。使用10%SDS-PAGE 分離蛋白，然后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上（Thermo Fisher）。用5%脫脂牛奶封閉1 h 后，細(xì)胞膜與一抗孵育過(guò)夜：anti-SALL4（1 ∶1 000）、anti-PD-L1（1 ∶1 000）和抗anti-GAPDH（1 ∶10 000）。之后用相應(yīng)的二抗孵育，最終使用ECL 試劑盒來(lái)觀察蛋白條帶，Image J 軟件進(jìn)行蛋白條帶的灰度分析。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，資料采用表示。組間比較采取SNK-t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（One way ANOVA）。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-129-5p 在HCC 患者血清及肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平 與正常對(duì)照組相比，HCC 患者血清miR-129-5p 表達(dá)量顯著降低（t=13.32，P<0.001）。與LO2 細(xì)胞相比，HepG2、Hep3B、HCCLM3、BEL-7402 和QGY-7703 的miR-129-5p 表達(dá)量均顯著降低（t=30.35、33.08、37.11、32.87、8.2，均P<0.05）。

2.2 miR-129-5p 過(guò)表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移 CCK-8、集落實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)表明過(guò)表達(dá)miR-129-5p 可抑制HCCLM3 細(xì)胞的增殖和遷移能力（P<0.05）。Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)顯示，與對(duì)照組相比，miR-129-5p mimics 顯著抑制Hep3B 和HCCLM3 細(xì)胞的穿膜數(shù)量（P<0.05），見(jiàn)圖1 和表1。

表1 各組細(xì)胞活力、克隆形成數(shù)、凋亡率、遷移、侵襲率比較（n=3，）Tab.1 Comparison of cell viability，number of clone formation，migration and invasive rate of each group（n=3，）

表1 各組細(xì)胞活力、克隆形成數(shù)、凋亡率、遷移、侵襲率比較（n=3，）Tab.1 Comparison of cell viability，number of clone formation，migration and invasive rate of each group（n=3，）

?

圖1 過(guò)表達(dá)miR-129-5p 抑制肝癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移（200×）Fig.1 Overexpression of miR-129-5 inhibited invasion and metastasis of HCC cells（200×）

2.3 SALL4 是miR-129-5p 在HCC 中的下游靶點(diǎn)StarBase 預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，miR-129-5p 與SALL4 有潛在結(jié)合位點(diǎn)，見(jiàn)圖2。隨后，通過(guò)熒光素酶實(shí)驗(yàn)以確認(rèn)miR-129-5p 與SALL4 3′-UTR 區(qū)之間的直接結(jié)合序列，與pmirGLO/SALL4-UTR+mimics control組相比，pmirGLO/SALL4-UTR+miR-129-5p mimics組相對(duì)熒光素酶活性降低[（9.47±0.38）vs.（5.36±0.32），t=13.75，P<0.05]；pmirGLO/SALL4-mUTR+mimics control 組與pmirGLO/SALL4-mUTR+miR-129-5p mimics 組相對(duì)熒光素酶活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[（9.24±0.30）vs.（9.37±0.43），t=0.228，P>0.05]。

圖2 StarBase 預(yù)測(cè)miR-129-5p 和SALL4 的結(jié)合位點(diǎn)Fig.2 The binding sites of miR-129-5p and SALL4 predicted by StarBase

2.4 過(guò)表達(dá)miR-129-5p 對(duì)靶基因SALL4 蛋白以及HCC 免疫治療相關(guān)PD-L1 表達(dá)的影響 在HCCLM3 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-129-5p mimics 后，檢測(cè)SALL4 和PD-L1 的蛋白相對(duì)水平，結(jié)果顯示上調(diào)miR-129-5p 表達(dá)后SALL4 [（0.83±0.08）vs.（0.31±0.01），t=12.68，P<0.05]和PD-L1[（0.64±0.08）vs.（0.36±0.02），t=8.798，P<0.05）的蛋白水平明顯降低，見(jiàn)圖3。

圖3 各組HCCLM3 細(xì)胞中SALL4 和PD-L1 蛋白表達(dá)Fig.3 SALL4 and PD-L1 protein expression in HCCLM3 cells of each group

2.5 miR-129-5p 通過(guò)調(diào)控SALL4 的表達(dá)抑制HCC 細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲 與mimics control組相比，miR-129-5p mimics+pcDNA3.1 組細(xì)胞活力降低，克隆形成數(shù)減少，遷移和侵襲率降低（均P<0.05）。與miR-129-5p mimics+pcDNA3.1 組相比，miR-129-5p mimics+pcDNA3.1-SALL4 組細(xì)胞活力增加，克隆形成數(shù)增多，遷移和侵襲率升高（均P<0.05），見(jiàn)表2 和圖4。

表2 各組細(xì)胞活力、克隆形成數(shù)、凋亡率、遷移侵襲率比較（n=3，）Tab.2 Comparison of cell viability,number of clone formation,migration and invasive rate of each group（n=3，）

表2 各組細(xì)胞活力、克隆形成數(shù)、凋亡率、遷移侵襲率比較（n=3，）Tab.2 Comparison of cell viability,number of clone formation,migration and invasive rate of each group（n=3，）

注：*P<0.05；與mimic control 組比較，aP<0.05；與miR-129-5p mimics+pcDNA3.1 組比較，bP<0.05

?

圖4 MiR-129-5p 通過(guò)調(diào)控SALL4 的表達(dá)抑制HCC 細(xì)胞的侵襲和遷移（200×）Fig.4 MiR-129-5p inhibited the invasion and migration of HCC cells by regulating the expression of SALL4（200×）

3 討論

HCC 細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移是影響患者治療效果及導(dǎo)致死亡的主要原因[11]。miRNAs 作為HCC 的調(diào)控基礎(chǔ)，其研究進(jìn)展為HCC 的發(fā)生、發(fā)展提供了新的見(jiàn)解。miR-129-5p 通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期、增殖、凋亡、遷移、侵襲和血管生成等生理和病理過(guò)程，對(duì)多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展發(fā)揮調(diào)控作用[12]。在腎癌細(xì)胞中，miR-129-5p 促進(jìn)細(xì)胞增殖和侵襲,并通過(guò)調(diào)控SOX4 通路抑制腎癌細(xì)胞[10]。之前有研究報(bào)道m(xù)iR-129-5p 通過(guò)靶向TRPM7 和抑制NLRP3 炎癥小體激活緩解心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷[13]。此外，miR-129的表達(dá)可能是前列腺癌患者無(wú)生化復(fù)發(fā)生存的獨(dú)立預(yù)后標(biāo)志物，并且miR-129 的過(guò)表達(dá)通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)水平顯著減弱前列腺癌細(xì)胞的增殖[7]。MiR-129-5p 在HCC 中通過(guò)直接靶向肝癌來(lái)源的生長(zhǎng)因子（HDGF）發(fā)揮Wnt 信號(hào)依賴(lài)性的抑瘤功能[14]。本研究發(fā)現(xiàn)miR-129-5p 可以靶向SALL4，調(diào)控HCC 細(xì)胞周期、增殖、凋亡、遷移和侵襲，從而促進(jìn)HCC 的進(jìn)展，為HCC 的研究和治療提供了新的治療靶點(diǎn)。

本研究通過(guò)生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)分析確定了miR-129-5p 的潛在靶基因?yàn)镾ALL4，并通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)技術(shù)發(fā)現(xiàn)miR-129-5p 可與SALL4 3′UTR 上的靶點(diǎn)結(jié)合。此外，通過(guò)檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-129-5p 模擬物后細(xì)胞中SALL4 的蛋白表達(dá)水平降低，證明SALL4 是miR-129-5p 的靶基因。miR-129-5p 在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控SALL4 的表達(dá)。SALL4 是一種對(duì)胚胎干細(xì)胞自我更新和維持多能性至關(guān)重要的癌胚蛋白[15]，具有阻止干細(xì)胞分化和增強(qiáng)干細(xì)胞自我更新的能力，因此被認(rèn)為在多種類(lèi)型的癌癥中發(fā)揮重要作用[16]。據(jù)報(bào)道，SALL4 高表達(dá)的肝癌祖細(xì)胞樣亞型與臨床侵襲性和不良預(yù)后相關(guān)[17]。因此，SALL4 目前被認(rèn)為是一種新興的候選癌癥生物標(biāo)志物。研究發(fā)現(xiàn)SALL4 和T 細(xì)胞共抑制配體PD-L1 的表達(dá)水平均與miR-200c 水平呈負(fù)相關(guān)。通過(guò)大樣本肝癌患者生存期回顧分析，發(fā)現(xiàn)低表達(dá)SALL4 或PD-L1 及高表達(dá)miR-200c 的患者具有更長(zhǎng)的生存期[18]。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)miR-129-5p 可通過(guò)抑制HCC 細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，發(fā)揮抑癌基因的作用，miR-129-5p 通過(guò)靶向SALL4 抑制HCC 進(jìn)展。因此，miR-129-5p/SALL4 可能成為HCC 治療的一個(gè)有吸引力的靶點(diǎn)。雖然本研究揭示了miR-129-5p/SALL4 軸在HCC 中的抗腫瘤作用，但在未來(lái)的研究中仍有一些問(wèn)題需要改進(jìn)，例如需要更多的HCC 癌組織和對(duì)照組織樣本來(lái)證實(shí)miR-129-5p 在HCC 中的表達(dá)水平，需要在更多的細(xì)胞系中再次證實(shí)miR-129-5p/SALL4 軸在HCC 中的作用。