元喆悅，白易，童文，張曉雨，崔壯

（1.天津醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，天津 300070；2.天津市第一中心醫(yī)院肝膽胰外科，天津 300192；3.天津醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)系，天津 300070）

肝細(xì)胞癌是全球發(fā)病率第五的腫瘤，死亡率卻高達(dá)第二，且仍有上升趨勢(shì)[1]。最近在中國(guó)進(jìn)行的一項(xiàng)全國(guó)性研究顯示，腫瘤患者感染新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）后，會(huì)較正常人群出現(xiàn)更為嚴(yán)重的臨床癥狀[2]。此外免疫狀態(tài)改變、炎癥通路增加、宿主基因表達(dá)增加和表觀遺傳改變還會(huì)讓腫瘤患者成為易感人群[3]。

新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）具有廣泛的器官親和性，并且可在肝臟和許多其他肺外器官中檢測(cè)到其RNA 表達(dá)[4]。原位雜交顯示，SARS-CoV-2 病毒粒子在血管管腔和門靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中富集[5]。透射電鏡觀察到肝細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中存在典型的SARSCoV-2 病毒顆粒，表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞膜功能障礙、線粒體腫脹和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張[6]。這些發(fā)現(xiàn)表明，SARSCoV-2 可能直接導(dǎo)致肝細(xì)胞病變。

COVID-19 相關(guān)基因是指與SARS-CoV-2 感染和COVID-19 疾病發(fā)展相關(guān)的基因。這些基因可以影響病毒的入侵和復(fù)制，調(diào)控宿主免疫應(yīng)答以及改變個(gè)體對(duì)疫苗和藥物的治療反應(yīng)。通過研究這些基因，可以更好的理解疾病的發(fā)病機(jī)制、尋找潛在的治療靶點(diǎn)和開發(fā)個(gè)體化的治療策略。如血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（ACE2）是SARS-CoV-2 的主要受體，可介導(dǎo)病毒進(jìn)入細(xì)胞[7]。肝臟單細(xì)胞RNA 測(cè)序分析顯示，ACE2 在膽管細(xì)胞中的表達(dá)水平最高，其次是肝竇內(nèi)皮細(xì)胞（LSECs）和肝細(xì)胞[8]。肝導(dǎo)管類器官培養(yǎng)顯示，部分COVID-19 肝損傷可能是由于SARS-CoV-2 感染引起的膽管細(xì)胞直接損傷和膽汁酸積聚[9]。這些數(shù)據(jù)表明，肝臟是SARS-CoV-2 的潛在靶點(diǎn)，SARSCoV-2 直接與膽管細(xì)胞結(jié)合，導(dǎo)致膽管細(xì)胞損傷和膽管功能障礙，可能是肝損傷的機(jī)制之一[10-12]。

本研究基于COVID-19 相關(guān)基因?qū)Ω渭?xì)胞癌進(jìn)行分子亞型分類，并評(píng)估不同分子亞型與預(yù)后及臨床特征的關(guān)系，以期為尋找肝細(xì)胞癌新的治療靶點(diǎn)提供思路。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)下載及相關(guān)基因集的來源 肝細(xì)胞癌患者組織的基因表達(dá)數(shù)據(jù)和臨床隨訪信息分別從TCGA、HCCDB18 數(shù)據(jù)庫（http：//lifeome.net/database/hccdb/home.html）及Gene Expression Omnibus（GEO）數(shù)據(jù)庫下載。從NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）以及genecards（https：//www.genecards.org/）網(wǎng)站搜集到134 個(gè)COVID-19 相關(guān)的基因。

1.2 數(shù)據(jù)預(yù)處理 對(duì)TCGA-LIHC 的RNA-Seq 數(shù)據(jù)做如下處理：（1）去掉沒有臨床隨訪信息、生存時(shí)間、生存狀態(tài)的樣本。（2）將Ensembl ID 轉(zhuǎn)換為基因名。（3）相同基因具有多個(gè)表達(dá)值的取均值。（4）過濾掉在樣本中的表達(dá)量低于1 且占比高于50%的基因。

對(duì)GEO 的數(shù)據(jù)集做以下處理：（1）去掉沒有臨床隨訪信息、生存時(shí)間、生存狀態(tài)的樣本。（2）將探針轉(zhuǎn)為基因名。（3）如一個(gè)探針對(duì)應(yīng)多個(gè)基因，去除該探針。（4）相同基因具有多個(gè)表達(dá)值的取均值。

對(duì)HCCDB18 的RNA-Seq 數(shù)據(jù)做如下處理：去除沒有臨床隨訪信息、生存時(shí)間、生存狀態(tài)、基因表達(dá)數(shù)據(jù)的樣本。

3 組數(shù)據(jù)經(jīng)預(yù)處理后，TCGA-LIHC 共有365 個(gè)樣本；HCCDB18 數(shù)據(jù)集共有203 個(gè)樣本；GSE14520共有221 個(gè)樣本。

1.3 鑒定COVID-19 基因相關(guān)肝細(xì)胞癌分子亞型TCGA 表達(dá)譜數(shù)據(jù)去除所有樣本中表達(dá)量小于1 且占比低于50%的基因后，有103 個(gè)COVID-19 相關(guān)基因。提取這些基因的表達(dá)量進(jìn)行單因素Cox分析，以閾值P<0.05 進(jìn)行過濾，得到預(yù)后相關(guān)基因。使用ConsensusClusterPlus（V1.48.0；參數(shù)：reps=100，pItem=0.8，pFeature=1，distance="euclidean"）對(duì)TCGA 樣本進(jìn)行一致性聚類。D2 和歐氏距離分別作為聚類算法和距離度量。

1.4 分子亞型之間的免疫評(píng)分比較分析 分別使用R軟件包StromalScore、ImmuneScore、ESTIMATEScore以及MCPcounter 評(píng)估10 種免疫細(xì)胞的評(píng)分。GSCA包的ssGSEA 方法計(jì)算28 種免疫細(xì)胞的評(píng)分。CIBERSSORT 包計(jì)算22 種免疫細(xì)胞的評(píng)分。

1.5 構(gòu)建基于COVID-19 基因的預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型

1.5.1 訓(xùn)練集和驗(yàn)證集劃分 首先將TCGA 數(shù)據(jù)集中的365 個(gè)樣本分成訓(xùn)練集和驗(yàn)證集，為避免隨機(jī)分配偏差影響后續(xù)建模的穩(wěn)定性，預(yù)先對(duì)所有樣本進(jìn)行100 次有放回隨機(jī)分組，分組抽樣按照訓(xùn)練集∶驗(yàn)證集=1∶1 比例進(jìn)行。根據(jù)以下條件挑選最合適的訓(xùn)練集和驗(yàn)證集：（1）在年齡的分布、性別、隨訪時(shí)間以及患者死亡比例上兩組相似。（2）隨機(jī)分組的兩個(gè)數(shù)據(jù)集基因表達(dá)譜聚類后，二分類樣本數(shù)量接近。訓(xùn)練集和測(cè)試集樣本使用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行比較。將HCCDB18 數(shù)據(jù)集及GSE14520 數(shù)據(jù)集作為外部驗(yàn)證集。

1.5.2Lasso Cox回歸分析 使用R 軟件包glmnet進(jìn)行l(wèi)asso Cox回歸分析，首先分析每個(gè)自變量的變化軌跡，再使用10-fold 交叉驗(yàn)證進(jìn)行模型構(gòu)建，分析每個(gè)lambda 下的置信區(qū)間，找到模型最優(yōu)時(shí)候的目標(biāo)基因數(shù)目。

1.6 風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與通路的關(guān)系 為了觀察不同樣本的風(fēng)險(xiǎn)得分與生物學(xué)功能的關(guān)系，選擇這些樣本對(duì)應(yīng)的基因表達(dá)譜，使用R 軟件包GSVA 進(jìn)行單樣本GSEA 分析，計(jì)算每個(gè)樣本在不同功能上的得分即得到了每個(gè)功能對(duì)應(yīng)各個(gè)樣本的ssGSEA 評(píng)分，進(jìn)一步計(jì)算這些功能與風(fēng)險(xiǎn)得分的相關(guān)性，選擇相關(guān)性大于0.45 的功能進(jìn)行聚類分析。

1.7 風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與臨床特征構(gòu)建列線圖 利用TCGA全部數(shù)據(jù)集，整合風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和其他多因素變量構(gòu)建列線圖模型。并使用校正曲線評(píng)估模型的準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果

2.1 基于預(yù)后基因聚類3 個(gè)分子亞型 通過預(yù)后分析，得到28 個(gè)與預(yù)后相關(guān)的COVID-19 基因?；谶@些基因，使用ConsensusClusterPlus 在K=3 時(shí)的分組，得到了3 個(gè)分子亞型（C1、C2、C3），見圖1A。同時(shí)分析了28 個(gè)基因在不同亞型中的表達(dá)熱圖（圖1B）。結(jié)果顯示：無論在總生存時(shí)間還是在無進(jìn)展生存時(shí)間方面，不同亞型之間均有差異，其中C2亞型預(yù)后最好（圖1C、D）。

圖1 基于ConsensusClusterPlus 包對(duì)肝細(xì)胞癌患者進(jìn)行分型Fig.1 Hepatocellular carcinoma patients were typing based on the ConsensusClusterPlus package

2.2 比較分析不同分子亞型之間的免疫評(píng)分 分別使用StromalScore、ImmuneScore、ESTIMATEScore和MCPcounter R 包評(píng)估10 種免疫細(xì)胞的評(píng)分。GSCA 包的ssGSEA 方法計(jì)算28 種免疫細(xì)胞的評(píng)分。CIBERSSORT 包計(jì)算22 種免疫細(xì)胞的評(píng)分。結(jié)果顯示，4 種方法的免疫評(píng)分中C2 亞型的免疫評(píng)分普遍高于C1 和C3 亞型（圖2）。

圖2 肝細(xì)胞癌分子亞型之間免疫評(píng)分的比較Fig.2 Comparison of immune scores among molecular subtypes of hepatocellular carcinoma

2.3 構(gòu)建基于COVID-19 基因的肝細(xì)胞癌預(yù)后模型

2.3.1 訓(xùn)練集樣本隨機(jī)分組 根據(jù)方法部分的分組方式，最終訓(xùn)練集數(shù)據(jù)共182 個(gè)樣本，驗(yàn)證集數(shù)據(jù)共183 個(gè)樣本，χ2檢驗(yàn)結(jié)果表明本研究分組合理，組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。使用訓(xùn)練集數(shù)據(jù)，針對(duì)每1 個(gè)COVID-19 基因以及生存數(shù)據(jù)利用R包survival coxph function 構(gòu)建單變量Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型，選擇P<0.05 作為閾值進(jìn)行過濾，最后得到預(yù)后相關(guān)基因，分別為VEGFA、CD14、CD209、REN、PSMD1。

2.3.2 預(yù)后模型的構(gòu)建與評(píng)估 使用R 軟件包glmnet 進(jìn)行l(wèi)asso Cox回歸分析，對(duì)這6 個(gè)基因進(jìn)一步降維，以減少風(fēng)險(xiǎn)模型的基因數(shù)量。如圖3A 所示，首先分析每個(gè)自變量的變化軌跡，可以看出隨著lambda 的逐漸增大，自變量系數(shù)趨于0 的個(gè)數(shù)也逐漸增多，使用10-fold 交叉驗(yàn)證進(jìn)行模型構(gòu)建，分析每個(gè)lambda 下的置信區(qū)間。如圖3B 所示，當(dāng)lambda=0.012 時(shí)模型達(dá)到最優(yōu)，選擇對(duì)應(yīng)的5 個(gè)基因進(jìn)行后續(xù)分析。對(duì)篩選的5 個(gè)基因進(jìn)行多因素Cox分析，并計(jì)算每一個(gè)基因的風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)，并得到風(fēng)險(xiǎn)得分的公式：風(fēng)險(xiǎn)得分=（0.227×VEGFA）-（0.125×CD14）+（0.208×CD209）+（-0.124×REN）+（0.034×PSMD1）。

圖3 使用lasso 回歸算法構(gòu)建預(yù)后模型Fig.3 Constructing a prognostic model using lasso regression algorithm

如圖3C 所示，根據(jù)樣本的表達(dá)水平分別計(jì)算每個(gè)樣本的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，并繪制樣本的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分分布。此外，使用R 包timeROC 對(duì)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分用于預(yù)后分類的受試者工作特征（ROC）曲線進(jìn)行分析，如圖3D所示，通過分別分析1、3、5 年生存率的預(yù)后預(yù)測(cè)效率，可以看出該模型具有較高的曲線下面積（AUC）；最后對(duì)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分進(jìn)行zscore 分析，將樣本劃分為高風(fēng)險(xiǎn)組（n=89，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分>0）和低風(fēng)險(xiǎn)組（n=93，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分<0）。此外，通過繪制KM 生存曲線可以看出高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組存在顯著差異（圖3E，P<0.05）。

2.3.3 內(nèi)部數(shù)據(jù)集驗(yàn)證5 種基因風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的魯棒性 TCGA 的驗(yàn)證集采用與訓(xùn)練集相同的模型和相同的系數(shù)，根據(jù)樣本的表達(dá)水平分別計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)得分，并繪制RiskScore 分布（圖4A），由圖可見，風(fēng)險(xiǎn)得分高的樣本具有更差的預(yù)后。1、3、5 年的預(yù)后ROC 分析如圖4B 所示。最后對(duì)風(fēng)險(xiǎn)得分進(jìn)行zscore 轉(zhuǎn)化，將大于零的樣本劃分為高風(fēng)險(xiǎn)組，小于零的樣本劃至低風(fēng)險(xiǎn)組，并繪制KM 曲線，可以看到顯著的生存差異（圖4C，P<0.001）。

圖4 內(nèi)部數(shù)據(jù)集驗(yàn)證預(yù)后模型的魯棒性Fig.4 Internal data sets validated the robustness of the prognostic model

2.3.4 外部數(shù)據(jù)集驗(yàn)證5 種基因風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的魯棒性 在外部驗(yàn)證集GSE14520 和HCCDB18 中采用與訓(xùn)練集相同的模型和相同的系數(shù)。同樣根據(jù)樣本的表達(dá)水平分別計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)得分，并繪制樣本的風(fēng)險(xiǎn)得分分布。如圖5A 所示，風(fēng)險(xiǎn)得分高的樣本預(yù)后更差。該模型在GSE14520 集合中的1、3、5 年的預(yù)后預(yù)測(cè)分類效率如圖5B 所示；對(duì)風(fēng)險(xiǎn)得分進(jìn)行zscore 轉(zhuǎn)化，將大于零的樣本定義為高風(fēng)險(xiǎn)組（n=101），小于零的樣本定義為低風(fēng)險(xiǎn)組（n=120），生存分析顯示高風(fēng)險(xiǎn)組患者預(yù)后顯著劣于低風(fēng)險(xiǎn)組（圖5C，P<0.001）。

圖5 外部數(shù)據(jù)集GSE14520 驗(yàn)證預(yù)后模型的魯棒性Fig.5 External data set GSE14520 verified the robustness of the prognostic model

獨(dú)立驗(yàn)證數(shù)據(jù)集HCCDB18 的風(fēng)險(xiǎn)得分分布如圖6A 所示，也得到了相似的結(jié)果。進(jìn)一步使用timeROC 對(duì)風(fēng)險(xiǎn)得分進(jìn)行預(yù)后分類的ROC 分析，因?yàn)樵摂?shù)據(jù)集中，5 年生存樣本太少，因此只分析了1、3、4 年的預(yù)后預(yù)測(cè)分類效率（圖6B）；最后對(duì)風(fēng)險(xiǎn)得分進(jìn)行zscore 轉(zhuǎn)化，發(fā)現(xiàn)高風(fēng)險(xiǎn)組（n=95）和低風(fēng)險(xiǎn)組（n=108）間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖6C，P<0.05）。

圖6 外部數(shù)據(jù)集HCCDB18 驗(yàn)證預(yù)后模型的魯棒性Fig.6 External dataset HCCDB18 verified the robustness of the prognostic mode

2.4 風(fēng)險(xiǎn)模型與肝細(xì)胞癌患者臨床特征的預(yù)后分析 基于血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子α（VEGFA）、CD14、CD209、REN及PSMD1構(gòu)建的5 基因風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型的臨床亞組生存分析顯示，該預(yù)測(cè)模型可以顯著區(qū)分年齡、性別、T 分期、N0 分期、M0 分期、Ⅰ+Ⅱ期、分級(jí)、復(fù)發(fā)亞組的預(yù)后（圖7，P<0.05）。

圖7 預(yù)后模型在不同臨床特征上的表現(xiàn)Fig.7 The performance of the prognostic model on different clinical features

2.5 構(gòu)建基于風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的列線圖 使用多因素Cox回歸分析5 基因特征模型在TCGA 數(shù)據(jù)集中的臨床獨(dú)立性，結(jié)果顯示，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分（圖8A，HR=1.8，95%CI：1.23～2.65，P=0.003）與生存顯著相關(guān)。根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分構(gòu)建了列線圖模型（圖8B）。校準(zhǔn)曲線證明該模型具有準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)性能（圖8C）。

圖8 基于5 基因預(yù)后模型構(gòu)建列線圖及其預(yù)測(cè)表現(xiàn)的驗(yàn)證Fig.8 Construction of a nomogram based on a 5-gene prognostic model and validation of its predictive performance

3 討論

由于肝細(xì)胞癌的異質(zhì)性，肝細(xì)胞癌患者可能存在與預(yù)后相關(guān)的不同分子亞型，考慮到肝細(xì)胞癌有限的治療獲益和極差的預(yù)后，迫切需要建立新的預(yù)后模型。本研究基于28 個(gè)COVID-19 預(yù)后相關(guān)的基因?qū)CGA 的365 個(gè)肝細(xì)胞癌樣本進(jìn)行分子分型，發(fā)現(xiàn)可以將這些樣本分為3 個(gè)亞型，且具有不同的臨床特征和預(yù)后結(jié)局。

近年來，關(guān)于肝細(xì)胞癌預(yù)后模型的研究越來越多，但基于COVID-19 相關(guān)基因?qū)Ω渭?xì)胞癌預(yù)后進(jìn)行評(píng)估尚無相關(guān)報(bào)道。本研究基于COVID-19 相關(guān)分子分型建立了一個(gè)新的5 基因模型（包括VEGFA、CD14、CD209、REN、PSMD1）用于肝細(xì)胞癌預(yù)后預(yù)測(cè)，并采用內(nèi)部和外部驗(yàn)證的方法，在多個(gè)數(shù)據(jù)庫中得到了驗(yàn)證。其中VEGFA 在血管生成過程中起關(guān)鍵作用[13]。而血管生成是惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要過程，與腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移有關(guān)。腫瘤細(xì)胞可以上調(diào)VEGFA 的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤血管生成[14]。研究表明，增加VEGFA 在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)，可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移[15-18]。CD14 抗原是一種糖基磷脂酰肌醇連接的糖蛋白，在Toll 樣受體（TLR）的信號(hào)通路中起著至關(guān)重要的作用[19]。CD14 在膀胱癌細(xì)胞中的表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞因子產(chǎn)生和腫瘤生長(zhǎng)[20]。CD14 陽性巨噬細(xì)胞的大量浸潤(rùn)預(yù)示著乳腺癌的早期復(fù)發(fā)[21]。研究提示，CD14 多態(tài)性可能增加幽門螺桿菌感染者患胃癌的風(fēng)險(xiǎn)[22]。在肝細(xì)胞癌細(xì)胞中，CD14 的過度表達(dá)可以減少肝細(xì)胞癌細(xì)胞的凋亡，抑制CD14 表達(dá)可抑制脂多糖/TLR4 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而明顯減輕肝細(xì)胞癌的炎癥和進(jìn)展[23]。這些研究提示CD14 可能是一個(gè)潛在的侵襲性生物標(biāo)志物。DC-SIGN（CD209）是樹突狀細(xì)胞特異性的C 型凝集素超家族受體，在感染、樹突狀細(xì)胞遷移和T 細(xì)胞激活的初始步驟中具有模式識(shí)別受體的功能[24]。一些證據(jù)表明DC-SIGN（CD209）和傳染病之間存在聯(lián)系，例如登革熱、結(jié)核病和艾滋病和川崎病等[25-27]，并且CD209L 和CD209 在SARS-CoV-2 靶器官中廣泛表達(dá)，可能參與感染和致病過程[28]。在腫瘤領(lǐng)域[29]，DC-SIGN（CD209）還通過調(diào)節(jié)Janus 激酶2/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3 信號(hào)通路介導(dǎo)胃癌進(jìn)展[30]。LSIGN（CD209L）和DC-SIGN（CD209）介導(dǎo)丙型肝炎病毒對(duì)肝細(xì)胞的反復(fù)感染，而持續(xù)感染丙型肝炎病毒可能發(fā)展為肝炎或肝硬化，甚至引起肝細(xì)胞癌[31]。有證據(jù)顯示，REN 基因與終末期腎病相關(guān)[32]，但尚無腫瘤方面研究。PSMD1 和PSMD2 都是蛋白酶體26S 的重要亞基[33]。許多研究也報(bào)道了PSMD1 在細(xì)胞增殖中的作用。例如，PSMD1 在未分化的甲狀腺癌組織中表達(dá)上調(diào)[28]，可以調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，在乳腺癌細(xì)胞對(duì)三苯氧胺耐藥的發(fā)展過程中起重要作用[34]。腫瘤內(nèi)表達(dá)PSMD1 是胃癌患者無病生存率和總生存期的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子[35]。此外，PSMD1 通過促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)脂滴的積累而促進(jìn)肝細(xì)胞性肝細(xì)胞癌細(xì)胞系的增殖，有望成為一個(gè)新的治療靶點(diǎn)[36]。本研究構(gòu)建預(yù)測(cè)模型中的大部分基因參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程，并且與肝細(xì)胞癌腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移或侵襲密切相關(guān)，這些發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步研究肝細(xì)胞癌的預(yù)后和尋找晚期肝細(xì)胞癌治療的分子靶點(diǎn)提供了新的視角。

本研究也存在一定局限性。首先，這些結(jié)論基于單一平臺(tái)，并且是回顧性研究，因此還需要來自不同中心和不同平臺(tái)的數(shù)據(jù)來進(jìn)一步測(cè)試評(píng)估模型的性能。其次，由于樣本數(shù)量有限，可能會(huì)導(dǎo)致選擇偏倚。因此建議開展大規(guī)模、多中心、前瞻性的研究來驗(yàn)證本研究結(jié)果，并對(duì)本研究中鑒定的5 種基因進(jìn)行更深入的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物研究，以確保該模型在肝細(xì)胞癌預(yù)后和治療價(jià)值方面的作用。