韓樹旺,尚海濤,張德林,郝成飛,劉軍艦

（天津市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院肝膽胰外科，天津 300100）

阻塞性黃疸（obstructive jaundice，OJ）也稱為外科黃疸，是常見的外科疾病[1-2]。由于膽管的機(jī)械性梗阻引起膽汁流入腸道障礙，造成膽汁淤積，導(dǎo)致膽道內(nèi)壓力增高，膽汁通過肝細(xì)胞和毛細(xì)膽管逆行入血，從而可導(dǎo)致血中膽紅素水平升高引起皮膚黏膜及鞏膜黃染等一系列臨床綜合癥狀，且圍手術(shù)期有較高的并發(fā)癥發(fā)生率及病死率[3-5]。研究表明，OJ發(fā)生期間由于膽道梗阻可導(dǎo)致膽汁淤積、機(jī)體免疫功能紊亂等一系列病理生理變化[6]。有關(guān)報道指出膽總管結(jié)石是OJ 最常見的良性原因[7]。OJ 免疫功能受損是大部分并發(fā)癥的原因，緣于腸肝軸和全身內(nèi)毒素血癥的動態(tài)平衡紊亂[8]。而OJ 引起的機(jī)體免疫功能變化主要表現(xiàn)為細(xì)胞免疫，高膽紅素血癥、高膽汁酸血癥、內(nèi)毒素血癥等改變是機(jī)體OJ 時細(xì)胞免疫功能受損的原因。細(xì)胞ATP 酶、蛋白激酶，線粒體功能可被膽紅素抑制，同時膽紅素可改變細(xì)胞膜的通透性，淋巴細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能可以被高濃度的膽汁酸或膽鹽直接損害[9-10]。及時解除病因使膽道再通是治療本病的關(guān)鍵所在，探索有效且安全可靠的聯(lián)合治療方式顯得格外重要。大量研究表明祖國醫(yī)學(xué)對黃疸的治療在利膽減黃保肝、改善機(jī)體細(xì)胞免疫功能方面有獨(dú)特的優(yōu)勢[11-13]。本研究通過隨機(jī)對照試驗探討清熱利濕方——茵陳五苓散對因膽總管結(jié)石所致OJ 患者膽道術(shù)后細(xì)胞免疫功能的影響。

1 對象和方法

1.1 研究對象 選取2021 年6 月至2022 年3 月天津市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院肝膽胰外科收治的結(jié)石性阻塞性黃疸患者76 例，隨機(jī)分為觀察組（加用茵陳五苓散顆粒劑）與對照組各38 例，觀察期間觀察組1 例因個人原因而脫出，最終觀察組共完成研究37例，對照組38 例。觀察組平均年齡59（50，64）歲，男性14 例，女性23 例，美國麻醉醫(yī)師分級（ASA）Ⅰ級19 例、Ⅱ級18 例；對照組年齡54（44.25，62.25）歲，男性13 例，女性25 例，ASA 分級Ⅰ級24 例、Ⅱ級14 例。所納入患者均因膽總管結(jié)石造成的梗阻且術(shù)前有黃疸癥狀，參考張仲景《金匱要略黃疸病篇并治第十五》《中醫(yī)內(nèi)科學(xué)》（人民衛(wèi)生出版社第2版）濕重于熱型黃疸常見癥狀制定中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn)：主癥：（1）身目發(fā)黃如橘。（2）嗜臥乏力，頭重身困。（3）無發(fā)熱或身熱不揚(yáng)。次癥：（1）右脅疼痛，脘悶腹脹。（2）納呆便溏，厭食油膩。（3）惡心、嘔吐。（4）口黏不渴，小便不利。（5）舌苔厚膩微黃，脈弦滑或濡緩。證型診斷評判標(biāo)準(zhǔn)為主癥（≥2 項）加次癥（≥2項），同時結(jié)合舌脈象。所有患者行膽總管探查取石術(shù)或內(nèi)鏡取石術(shù)解除梗阻。本研究通過了天津市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院倫理委員會審批（批件號：NKYY_YXKT_IRB_2019_004_01），所有受試者均知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 納入和排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）術(shù)前確診為膽總管結(jié)石造成的OJ 患者。（2）膽道術(shù)后患者。（3）中醫(yī)證型診斷為濕重于熱證者。（4）年齡在18～75 歲，有獨(dú)立行為能力者。（5）同意配合治療者。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）肝細(xì)胞性黃疸患者。（2）肝自身免疫性疾病患者。（3）伴有嚴(yán)重心、肝、腎等重要臟器疾病，不耐受麻醉、手術(shù)患者。（4）服用過肝臟毒性藥物的患者。（5）惡性梗阻性黃疸患者。

1.2.2 治療方法 對照組：西醫(yī)常規(guī)治療：（1）術(shù)后禁食。（2）術(shù)后給予抗感染。（3）術(shù)后糾正水、電解質(zhì)和酸堿平衡及營養(yǎng)支持等。（4）術(shù)后止痛：根據(jù)患者情況可給予鹽酸布桂嗪、氯諾西康、哌替啶等止痛藥物。（5）術(shù)后合并癥處理：對合并有其他基礎(chǔ)病，如糖尿病、冠心病、高血壓等，可采取相應(yīng)的西醫(yī)治療措施。（6）為避免試驗干擾，不加用其他如穴位敷貼、針灸、紅外線照射等中醫(yī)治療措施。

觀察組：在西醫(yī)常規(guī)治療的基礎(chǔ)上，術(shù)后第1天開始加用茵陳五苓散（顆粒劑）（顆粒劑由天津市南開醫(yī)院顆粒藥房制備）。方藥：方劑為茵陳五苓散（顆粒劑）（此方出處《金匱要略黃疸病并治第十五》）：茵陳30 g、澤瀉25 g、豬苓15 g、茯苓15 g、白術(shù)15 g、桂枝10 g。服用方法：1 袋/次，2 次/d，早晚200 mL 溫開水沖服或胃管注入。

1.2.3 標(biāo)本收集及檢測 收集患者術(shù)前1 d、術(shù)后5 d、術(shù)后7 d 清晨空腹?fàn)顟B(tài)下外周靜脈血，于精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)科檢驗室檢測CD3+T 淋巴細(xì)胞、CD4+T 淋巴細(xì)胞、CD8+T 淋巴細(xì)胞、CD4+CD25+Treg 細(xì)胞水平，剩余血液樣本給予3 000 r/min 離心10 min 將血清和紅細(xì)胞分離，血漿至于ETDA 抗凝管內(nèi)予以3 000 r/min 離心30 min 取上清，按檢測白細(xì)胞介素（IL）-10、轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β1一次用量分裝，凍存于-20℃，待統(tǒng)一用ELISA 試劑盒檢測。

1.2.4 試劑、儀器 鼠抗人抗體CD3-perCP、CD4-FITC、CD8-PE、CD25-APC（BD 公司，美國）；IL-10 ELISA 試劑盒（巧伊生物，安徽巧伊生物科技有限公司，中國）；TGF-β1ELISA 試劑盒（proteintech 公司，美國）；日本久保田KUBOTA 血液離心機(jī)（型號：KA-220，上海創(chuàng)萌生物科技有限公司，中國）；流式細(xì)胞儀（型號：FACSCalibur，Beckman Coulter公司，美國）；MR-96A 全自動酶標(biāo)儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司，中國）。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測 T 淋巴細(xì)胞亞群水平：（1）檢測CD4+CD25+Treg 細(xì)胞：取EDTA-K2 抗凝血40 μL，加入CD4-FITC 和CD25-APC 熒光抗體5 μL，同型對照管另取40 μL 血加入IgG1-FITC、IgG2a-APC 熒光抗體5 μL，混勻，室溫避光孵育20 min，加入2 mL 溶血劑，加PBS 緩沖液2 mL 重懸細(xì)胞，1 800 r/min 離心5 min，棄上清，再加PBS 緩沖液2 μL，上流式細(xì)胞儀檢測并計數(shù)，以“CD4+CD25+”雙陽性細(xì)胞表示CD25+T 淋巴細(xì)胞。（2）另取ETDA-K2抗凝血40 μL，加入CD4-FITC/CD8-PE/CD3-perCP熒光抗體5 μL，同型對照管另取40 μL 血加入IgG1-FITC/IgG1-pE/IgG1-perCP 抗體5 μL，其他條件同CD4+CD25+Treg 細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測并計數(shù)，以“CD3+”陽性表示CD3+T 淋巴細(xì)胞；“CD3+CD4+”及“CD3+CD8+”均為雙陽性細(xì)胞分別表示CD4+T 淋巴細(xì)胞、CD8+T 淋巴細(xì)胞。

1.2.6 ELISA 檢測血清IL-10、TGF-β1濃度 （1）取出已經(jīng)平衡室溫的試劑、酶標(biāo)板。（2）加樣，分別設(shè)零孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔，零孔加樣樣品稀釋液100 μL，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100 μL。（3）酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，濕盒放置，37℃孵育120 min。（4）洗滌：用洗滌液洗滌板條4 次，每孔350～400 μL，使用毛巾或者濾紙將板內(nèi)殘留液體拍出，最后一次洗滌后確保板內(nèi)無殘留液體，避免毛巾或濾紙纖維進(jìn)入板內(nèi)。（5）每孔加100 μL 檢測抗體，蓋上封板膜，濕盒放置，37℃孵育60 min。重復(fù)步驟4。（6）每孔加100 μL HRP 標(biāo)記抗體，蓋上封板膜，濕盒放置，37℃孵育40 min。重復(fù)步驟4。（7）顯色：每孔加TMB 顯色液100 μL，37℃（不需要置于濕盒環(huán)境）避光顯色15～20 min。（8）終止：每孔加終止液100 μL，加樣后5 min 讀數(shù)。（9）在Excel 工作表中以O(shè)D 值為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)品曲線，對照未知樣本中OD 值，按照曲線方程即可計算出標(biāo)本中IL-10、TGF-β1濃度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 26.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。所有計量資料經(jīng)正態(tài)性檢驗后符合正態(tài)分布，均以表示，組間采用獨(dú)立樣本t檢驗，組內(nèi)比較采用配對樣本t檢驗；非正態(tài)分布計量資料以中位數(shù)和四分位數(shù)間距[M（P25，P75）]表示，組間比較采用Mann-Whitney U檢驗，計數(shù)資料以例數(shù)、構(gòu)成比（%）表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者一般資料及脫失情況比較 兩組性別、年齡、是否合并高血壓、糖尿病、冠心病、是否合并腹部手術(shù)史、ASA 分級等一般資料比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P>0.05），見表1。

表1 兩組患者一般資料比較[（n）%，M（P25，P75）]Tab.1 Comparison of general data between the two groups of patients[（n）%，M（P25，P75）]

2.2 兩組患者治療前后CD3+、CD4+、CD8+T 淋巴細(xì)胞、CD4+/CD8+比值、CD4+CD25+Treg 細(xì)胞變化 兩組患者治療5 d、7 d，CD3+、CD4+T 淋巴細(xì)胞、CD4+/CD8+比值均較術(shù)前1 d 增加，CD4+CD25+Treg 細(xì)胞較術(shù)前1 d 減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.05）；與對照組相比，術(shù)后5 d、7 d CD3+、CD4+T 淋巴細(xì)胞、CD4+/CD8+比值升高，CD4+CD25+Treg 細(xì)胞減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.05），兩組組內(nèi)、組間CD8+T 淋巴細(xì)胞比較均無統(tǒng)計學(xué)差異（均P>0.05），見表2～6。

表2 兩組治療前后血清CD3+T 淋巴細(xì)胞的變化（，%）Tab.2 Changes of serum CD3+T lymphocytes before and after treatment in two groups（，%）

表2 兩組治療前后血清CD3+T 淋巴細(xì)胞的變化（，%）Tab.2 Changes of serum CD3+T lymphocytes before and after treatment in two groups（，%）

注：與術(shù)前1 d 相比，aP<0.05

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表3 兩組治療前后血清CD4+T 淋巴細(xì)胞的變化（，%）Tab.3 Changes of serum CD4+T lymphocytes before and after treatment in two groups（，%）

表3 兩組治療前后血清CD4+T 淋巴細(xì)胞的變化（，%）Tab.3 Changes of serum CD4+T lymphocytes before and after treatment in two groups（，%）

注：與術(shù)前1 d 相比，aP<0.05

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表4 兩組治療前后血清CD8+T 淋巴細(xì)胞的變化（，%）Tab.4 Changes of serum CD8+T lymphocytes before and after treatment in two groups（，%）

表4 兩組治療前后血清CD8+T 淋巴細(xì)胞的變化（，%）Tab.4 Changes of serum CD8+T lymphocytes before and after treatment in two groups（，%）

注：與術(shù)前1 d 相比，aP<0.05

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表5 兩組治療前后CD4+/CD8+的變化（）Tab.5 Changes of CD4+/CD8+before and after treatment in two groups（）

表5 兩組治療前后CD4+/CD8+的變化（）Tab.5 Changes of CD4+/CD8+before and after treatment in two groups（）

注：與術(shù)前1 d 相比，aP<0.05

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表6 兩組治療前后血清CD4+CD25+Treg 細(xì)胞的變化（，%）Tab.6 Changes of serum CD4+CD25+Treg cells before and after treatment in two groups（，%）

表6 兩組治療前后血清CD4+CD25+Treg 細(xì)胞的變化（，%）Tab.6 Changes of serum CD4+CD25+Treg cells before and after treatment in two groups（，%）

注：與術(shù)前1 d 相比，aP<0.05

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2.4 兩組患者治療前后IL-10、TGF-β1變化 術(shù)后5 d、7 d，與對照組比較，IL-10、TGF-β1降低較明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.05）；與術(shù)前1 d 比較，兩組術(shù)后5 d、7 d，IL-10、TGF-β1降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.05），見表7、8。

表7 兩組治療前后TGF-β1 濃度變化（，pg/mL）Tab.7 Changes of TGF-β1 concentration before and after treatment in two groups（，pg/mL）

表7 兩組治療前后TGF-β1 濃度變化（，pg/mL）Tab.7 Changes of TGF-β1 concentration before and after treatment in two groups（，pg/mL）

注：與術(shù)前1 d 相比，aP<0.05；TGF：轉(zhuǎn)化生長因子

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表8 兩組治療前后IL-10 變化（，pg/mL）Tab.8 Changes of IL-10 before and after treatment in two groups（，pg/mL）

表8 兩組治療前后IL-10 變化（，pg/mL）Tab.8 Changes of IL-10 before and after treatment in two groups（，pg/mL）

注：與術(shù)前1 d 相比，aP<0.05；與對照組術(shù)后5 d、7 d 相比，bP<0.05；IL：白細(xì)胞介素

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3 討論

OJ 是常見的外科疾病，是多因素共同作用的結(jié)果，其中最常見的良性原因是由膽總管結(jié)石引起[7，14]。膽道梗阻可引起高膽紅素血癥、內(nèi)毒素血癥的發(fā)生，導(dǎo)致圍手術(shù)期并發(fā)癥發(fā)病率增加、免疫功能受損、全身多器官功能損害、營養(yǎng)障礙等。既往研究發(fā)現(xiàn)茵陳五苓散對OJ 機(jī)體細(xì)胞免疫功能具有改善作用，增強(qiáng)機(jī)體抗感染能力。茵陳五苓散最早出自張仲景的《金匱要略·黃疸病》，其屬于經(jīng)典方劑，在清熱利濕、利膽退黃方面一直備受推崇。其中君藥茵陳，具有清熱利濕功效；澤瀉、茯苓、豬苓具有利水滲濕的功效；白術(shù)具有健脾燥濕的功效；桂枝具有通陽化氣行水的功效，諸藥相配伍共湊清熱利濕、利膽退黃功效?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，茵陳五苓散的化學(xué)成分主要是香豆素、多糖類、萜類及揮發(fā)油，具有抗脂質(zhì)過氧化以及減黃保肝的功效，同時對化學(xué)物質(zhì)導(dǎo)致的肝損傷具有保護(hù)作用，可促進(jìn)肝再生，調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫[15-17]。

OJ 患者因膽汁淤積、高膽紅素血癥等因素對機(jī)體免疫功能產(chǎn)生了影響，尤其細(xì)胞免疫功能被抑制。本研究觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OJ 患者通過手術(shù)有效解除梗阻之后可以改善免疫功能，觀察組聯(lián)合茵陳五苓散可以加快機(jī)體細(xì)胞免疫功能恢復(fù)。在本研究中兩組患者在膽道術(shù)后治療5、7 d，CD3+T 淋巴細(xì)胞、CD4+T 淋巴細(xì)胞、CD4+/CD8+比值均較術(shù)前1 d 增加，CD4+CD25+Treg 細(xì)胞較術(shù)前1 d 減少；術(shù)后5、7 d觀察組和對照組組間比較顯示，CD3+、CD4+T 淋巴細(xì)胞、CD4+/CD8+比值變化差異有統(tǒng)計學(xué)意義，說明聯(lián)合茵陳五苓散治療可加快改善細(xì)胞免疫功能，且治療時間越長對改善細(xì)胞免疫功能的作用越明顯。CD8+在觀察組及對照組組內(nèi)、組間各時間段比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，提示CD8+T 淋巴細(xì)胞在OJ 病理過程中數(shù)量無明顯變化。而CD4+/CD8+術(shù)前術(shù)后變化顯著，說明CD4+/CD8+越高，T 細(xì)胞免疫應(yīng)答能力越強(qiáng)，提示對照組患者術(shù)后細(xì)胞免疫功能恢復(fù)慢于觀察組。這與先前的研究相一致[12，18-19]。

TGF-β1、IL-10 是由Treg 細(xì)胞分泌的抑制性細(xì)胞因子，通過細(xì)胞因子發(fā)揮免疫抑制功能。研究發(fā)現(xiàn)通過某種手段降低OJ 患者Treg 細(xì)胞的表達(dá)進(jìn)而減少TGF-β、IL-10 的表達(dá)，Treg 細(xì)胞在其體內(nèi)所介導(dǎo)的免疫抑制效應(yīng)將可能降低甚至逆轉(zhuǎn)，從而在提高OJ 患者免疫功能，降低并發(fā)癥發(fā)生率、提高治療效果和改善預(yù)后方面發(fā)揮積極作用[20-21]。既往研究證實中醫(yī)藥可以改善OJ 患者機(jī)體免疫細(xì)胞功能，主要表現(xiàn)為Treg 細(xì)胞數(shù)量減少，本研究結(jié)果顯示，細(xì)胞因子TGF-β1、IL-10 隨Treg 細(xì)胞變化而變化，說明茵陳五苓散在細(xì)胞免疫恢復(fù)方面起到了積極的輔助作用，且對照組慢于觀察組。

綜上所述，本研究通過臨床隨機(jī)對照觀察發(fā)現(xiàn)，利用外科手術(shù)可有效解決膽道梗阻問題，術(shù)后聯(lián)合茵陳五苓散能在保證安全的前提下，加快利膽減黃，恢復(fù)機(jī)體細(xì)胞免疫，中西醫(yī)憑借各自的優(yōu)勢，相互補(bǔ)充，加快患者術(shù)后恢復(fù)。中醫(yī)藥可以作為OJ圍手術(shù)期的重要輔助措施，并且安全可靠，值得臨床推廣。