牛琛，付麗

（天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院乳腺病理科，國(guó)家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津 300060）

乳腺癌的發(fā)病率已經(jīng)上升為全球惡性腫瘤的第一位，腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是患者死亡的主要原因[1-3]。如何能術(shù)前精準(zhǔn)標(biāo)記出具有播散和轉(zhuǎn)移潛能的腫瘤細(xì)胞，是解決腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵[4-5]。目前，組織病理學(xué)是診斷腫瘤的金標(biāo)準(zhǔn)，但是其有創(chuàng)、滯后、取材有限導(dǎo)致不能觀察到腫瘤的全貌[6-7]。如果能夠通過分子影像技術(shù)準(zhǔn)確預(yù)判腫瘤范圍及轉(zhuǎn)移潛能，不但可以指導(dǎo)精準(zhǔn)取材，也可以實(shí)時(shí)指導(dǎo)手術(shù)，避免病灶殘留，對(duì)患者的診斷、治療以及預(yù)后極為重要。近紅外光學(xué)成像因其靈敏度高、背景熒光干擾小、組織光損傷較低、無輻射、成本低等優(yōu)點(diǎn)，在腫瘤診斷、光學(xué)手術(shù)導(dǎo)航和實(shí)時(shí)可視化評(píng)價(jià)療效等方面做出了顯著貢獻(xiàn)[8-10]。

乙醛脫氫酶2（ALDH2）屬于醛脫氫酶家族[11]，在維持腫瘤細(xì)胞干性和介導(dǎo)微管抑制劑抗性中起關(guān)鍵作用[12-14]。前期研究表明，ALDH2 在浸潤(rùn)性微乳頭狀癌（IMPC）這種高轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織中高表達(dá)，其表達(dá)水平與腫瘤細(xì)胞的播散、遷移和轉(zhuǎn)移能力成正比，是患者死亡的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素[15]。因此，ALDH2是識(shí)別具有播散和轉(zhuǎn)移潛能腫瘤細(xì)胞的重要分子。設(shè)計(jì)并合成一種脂質(zhì)體納米探針ALDH2-Cy7@LPFA，評(píng)估其在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平，實(shí)現(xiàn)在體、無創(chuàng)、精準(zhǔn)、高效診斷具有高侵襲和轉(zhuǎn)移特性的乳腺癌，可為精準(zhǔn)診療方案的制定及患者的預(yù)后預(yù)測(cè)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器 人乳腺癌細(xì)胞系BT474、MDA-MB-231、T47D、MCF-7 和人正常乳腺細(xì)胞MCF-10A 均購自Procell 公司；ALDH2 抗體和GAPDH 抗體購于美國(guó)Abcam 公司；DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清和青霉素-鏈霉素雙抗購于美國(guó)Gibco 公司；Cy7 購自北京范博生化；超干二甲基亞砜（DMSO）、三乙胺（TEA）購自北京百靈威科技有限公司；乙醚購自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無水甲醇（CH3OH）購自天津天力化學(xué)試劑有限公司；（2，3-二油?；?丙基）-三甲胺（DOTAP）、1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸膽堿（DOPC）、1，2-二硬脂基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[葉酸（聚乙二醇）]（DSPEPEG2k-folate）、膽固醇（Chol） 購自Avanti Polar Lipids 生物公司。

紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司，TU-1900）、熒光光譜儀（愛丁堡儀器公司，F(xiàn)LS1000）、磁力攪拌器（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司，DF-101S）、混勻儀（上海仙象儀器有限公司，ELEMS100）、納米粒徑電位分析儀（Malvern，ZEN3690）、臺(tái)式高速離心機(jī)（eppendorf，5810R）、脂質(zhì)體薄膜擠出器（加拿大ATS 工業(yè)系統(tǒng)有限公司，LEPEX）。

1.2 方法

1.2.1 探針合成及制備 參照文獻(xiàn)方法[16-17]，先將葉酸-NHS 和DSPE-PEG2000-NH2 溶解于PBS中，TEA 為催化劑，室溫?cái)嚢?2 h。用透析袋對(duì)反應(yīng)液透析3 次，去除未反應(yīng)的葉酸，真空冷凍干燥得到Folate-PEG2000。然后，采用薄膜水化法合成脂質(zhì)體納米顆粒，將二棕櫚酰磷脂膽堿（DPPC）、膽固醇和Folate-PEG2000 混合溶于甲醇/氯仿（9/1，v/v）混合液中，減壓去除有機(jī)溶劑，形成脂質(zhì)干膜。分別將含有ALDH2-Cy7 與ALDH2-Cy5 的PBS 溶液加入脂質(zhì)干膜中，50℃水化1 h，得到多層脂質(zhì)體，再用脂質(zhì)體擠出器（聚碳酸酯膜100 nm）擠出多層脂質(zhì)體10 次后，得到納米脂質(zhì)體，最后用透析袋透析3次，去除未包封的ALDH2-熒光基團(tuán)原料，得到脂質(zhì)體納米探針ALDH2-Cy7@LP-FA。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人乳腺癌細(xì)胞系BT474、MDAMB-231、T47D、MCF-7 和人正常乳腺細(xì)胞MCF-10A 在補(bǔ)充有10%胎牛血清的DMEM 中培養(yǎng)，37℃下在5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3 免疫組化染色 采用免疫組織化學(xué)染色方法分析ALDH2 在腫瘤組織和癌旁組織中的表達(dá)情況。4%的多去甲醛（PFA）固定腫瘤組織，連續(xù)切取5 μm 厚度的組織切片進(jìn)行免疫組化染色。染色步驟和評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)詳見前期實(shí)驗(yàn)步驟[15]。

1.2.4 蛋白質(zhì)印跡 采用蛋白質(zhì)印跡法分析ALDH2 在乳腺癌細(xì)胞BT474、T47D、MDA-MB-231、SKBR3、MCF-7 和人正常乳腺細(xì)胞MCF-10A 中的表達(dá)水平。使用苯基甲磺酰氟（PMSF）（#8553，CST）的細(xì)胞裂解緩沖液（#9803，CST）裂解乳腺癌細(xì)胞。SDS-PAGE 凝膠（10%）分離蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，5%脫脂奶粉封閉。將PVDF 膜與ALDH2（ab133306，Abcam，1 ∶1 000）一抗在4℃下孵育過夜。與HRP 耦聯(lián)的抗兔IgG（7074 s，CST，1 ∶5 000）在室溫下孵育1 h，使用ECL 檢測(cè)試劑盒（P90719，Immobilon）分析蛋白質(zhì)表達(dá)。

1.2.5 流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn) 將BT474 細(xì)胞以2×104密度平鋪到12 孔板，并設(shè)置空白對(duì)照組。待細(xì)胞貼壁后，去除舊培養(yǎng)基，在空白對(duì)照組中加入新鮮培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組中加入對(duì)應(yīng)的探針，孵育不同時(shí)間（0、2、4、6 h）后，再次去除舊培養(yǎng)基，PBS 清洗3次，500 μL 胰酶消化2 min，然后加入500 μL 培養(yǎng)基終止消化。將細(xì)胞1 000 r/min 離心3 min，去除上清，然后200 μL PBS 重懸。吹打均勻，流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞進(jìn)行熒光定量。MDA-MB-231 和MCF-10A 細(xì)胞組處理方法類似。

1.2.6 激光共聚焦成像實(shí)驗(yàn) 以BT474、MDA-MB-231 細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組，MCF-10A 細(xì)胞作為對(duì)照組。將BT474 細(xì)胞以20 000 個(gè)/皿的密度平鋪到共聚焦小皿（35 mm×10 mm）上，5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中孵育過夜。待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，去除舊培養(yǎng)基，加入含有ALDH2-Cy7@LP-FA（5 μmol/L）的培養(yǎng)基孵育4 h。隨后去除培養(yǎng)基，PBS 清洗3 次，加入含有Mito Tracker Green FM（50 nmol/L）的培養(yǎng)基孵育20 min以進(jìn)行線粒體染色，然后PBS 清洗3 次，使用500 μL Hoechst 33 342 溶液孵育10 min 進(jìn)行細(xì)胞核染色，最后PBS 清洗3 次，將各共聚焦小皿分別置于激光共聚焦顯微鏡下觀察拍攝。MDA-MB-231 和MCF-10A 細(xì)胞組處理方法類似。

1.2.7 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 采用CCK8 法檢測(cè)納米脂質(zhì)體探針的細(xì)胞毒性。將傳代培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的乳腺癌細(xì)胞BT474、MDA-MB-231 消化、離心、吹勻，以每孔5×103密度平鋪至96 孔板，在37℃培養(yǎng)箱孵育。隨后去除舊培養(yǎng)基，對(duì)照組加入新鮮培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組加入用培養(yǎng)基配置的不同濃度的探針（濃度分別為0、5、10、15、20、30 μg/mL），然后分別以100 μL/孔加入96 孔板，在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。孵育結(jié)束后，加入10 μL/孔的CCK8 溶液，將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中孵育4 h，之后使用酶標(biāo)儀檢測(cè)每孔的吸光度值（OD），波長(zhǎng)設(shè)置為450 nm，對(duì)腫瘤細(xì)胞的存活率進(jìn)行計(jì)算，檢測(cè)探針對(duì)腫瘤細(xì)胞毒性的影響。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用GraphPad Prism 6.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，蛋白質(zhì)印跡及其他實(shí)驗(yàn)差異分析，采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，P<0.05 為差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 探針的表征 制備得到粒徑均一分布的葉酸靶向脂質(zhì)體FA-Lipo，其粒徑大小為（155±2）nm（圖1A）。在不同pH 值條件下均為電中性（zeta 電勢(shì)<10 mV）（圖1B）。由于需要遞送的ALDH2 抗體的等電點(diǎn)為7.49，在中性條件下也為電中性。因此通過超聲法制備含有ALDH2-Cy7 的脂質(zhì)體ALDH2-Cy7@LP。粒徑分析表明其粒徑與原脂質(zhì)體FA-Lipo 相當(dāng)，為（155±4）nm（圖1C）。進(jìn)一步對(duì)ALDH2-Cy7@LP 的紫外吸收光譜和熒光發(fā)射光譜進(jìn)行表征，結(jié)果表明，脂質(zhì)體的包載使得標(biāo)記抗體的紫外吸收和熒光發(fā)射分別發(fā)生了4 nm 和5 nm的藍(lán)移。光譜性質(zhì)表明（圖1D），Cy7 對(duì)ALDH2 的抗體標(biāo)記成功，脂質(zhì)體的包載實(shí)現(xiàn)了抗體納米化，同時(shí)對(duì)標(biāo)記抗體的光譜性質(zhì)影響很小（圖1E）。

圖1 ALDH2-Cy7@LP-FA 的表征結(jié)果Fig.1 Characterization results of ALDH2-Cy7@LP-FA

2.2 ALDH2 蛋白在不同乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)免疫組化對(duì)比IMPC 組織與癌旁組織中ALDH2 的蛋白表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)ALDH2 在IMPC 組織中顯著高表達(dá)（圖2A）。通過蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ALDH2 蛋白在6 種乳腺細(xì)胞中的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)ALDH2 在人正常乳腺細(xì)胞MCF-10A 極低表達(dá)，在乳腺癌細(xì)胞BT474 和MDA-MB-231 中高表達(dá)，在T47D、SKBR3、MCF-7 細(xì)胞中較低表達(dá)（圖2B，BT474：t=29.123，P<0.001；T47D：t=9.512，P<0.01；MDA-MB-231：t=27.162，P<0.001；SKBR3：t=21.279，P<0.001；MCF-7：t=3.628，P<0.05）。

圖2 ALDH2 在乳腺癌組織和細(xì)胞的表達(dá)水平Fig.2 ALDH2 expression levels in breast cancer tissues and cells

2.3 探針的體外攝取及成像結(jié)果 采用流式細(xì)胞術(shù)分析探針在腫瘤細(xì)胞中的攝取情況，將探針與BT474 和MDA-MB-231 細(xì)胞共孵育，發(fā)現(xiàn)結(jié)合率隨時(shí)間逐漸增高，在4 h 后達(dá)到飽和（圖3A）。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MCF-10A、MDA-MB-231 和BT474 細(xì)胞的ALDH2-Cy7@LP-FA 探針結(jié)合率，與MCF-10A細(xì)胞相比，在高表達(dá)ALDH2 的BT474 細(xì)胞中的結(jié)合率最高，MDA-MB-231 細(xì)胞次之（BT474：t=9.976，P<0.01；MDA-MB-231：t=12.026，P<0.05）。CCK8 結(jié)果顯示，ALDH2-Cy7@LP-FA 探針在濃度高達(dá)30 μg/mL 時(shí)，BT474 和MDA-MB-231 的細(xì)胞存活率仍在80%以上，與對(duì)照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，并未發(fā)現(xiàn)明顯的細(xì)胞毒性（圖3B）。

圖3 ALDH2-Cy7@LP-FA 對(duì)細(xì)胞的攝取及毒性Fig.3 Cellular uptake and toxicity of ALDH2-Cy7@LP-FA

共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示，ALDH2-Cy7@LP-FA探針熒光與Mito Tracker 線粒體發(fā)光高度重疊，提示主要定位在胞漿線粒體。探針BT474 中呈強(qiáng)熒光著色，在MCF-10A 中呈極弱熒光著色，與蛋白質(zhì)印跡結(jié)果一致（圖4A）。共定位實(shí)驗(yàn)表明，探針與線粒體染料Mito Tracker 高度重合，在BT474、MDA-MB-231 中的Pearson相關(guān)系數(shù)分別高達(dá)0.88 和0.78，成功釋放和定位在線粒體（圖4B）。

圖4 ALDH2-Cy7@LP-FA 的成像效果Fig.4 Imaging effect of ALDH2-Cy7@LP-FA

3 討論

2020 年全球確診了230 萬例乳腺癌新病例（占所有腫瘤的11.7%），其已超過肺癌，成為全球最常見的腫瘤，是女性腫瘤死亡的主要原因。乳腺癌的局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是臨床致死的主要原因，尋找腫瘤特異性靶向分子，利用分子影像學(xué)技術(shù)實(shí)現(xiàn)在體、精準(zhǔn)標(biāo)記播散及轉(zhuǎn)移細(xì)胞是提高患者生存率的關(guān)鍵。

在過去的幾十年里，醫(yī)學(xué)成像技術(shù)飛速發(fā)展，在臨床腫瘤學(xué)中發(fā)揮著核心作用。分子成像不僅可以可視化腫瘤在體內(nèi)的位置，而且能夠可視化影響腫瘤行為或治療反應(yīng)的特定分子的表達(dá)以及生物過程（如凋亡、血管生成和轉(zhuǎn)移）[16]。其中，近紅外熒光分子影像技術(shù)具有高靈敏度、高分辨率、無輻射、低成本等優(yōu)點(diǎn)，能夠在多水平對(duì)關(guān)鍵分子靶標(biāo)進(jìn)行體內(nèi)成像，在術(shù)前提供腫瘤的精準(zhǔn)定位信息，并適用于手術(shù)導(dǎo)航，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和精準(zhǔn)切除[19-20]。菁染料是近紅外熒光染料中最常用的一類熒光染料，其摩爾吸光系數(shù)在熒光染料中是最高的，其中Cy7 的吸收在近紅外區(qū)背景非常低，是熒光強(qiáng)度最高、最穩(wěn)定的長(zhǎng)波長(zhǎng)染料[21-22]，特別適合代替放射性元素用于活體小動(dòng)物體內(nèi)成像[23-24]。

課題組前期對(duì)IMPC 腫瘤細(xì)胞團(tuán)全基因組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)IMPC 組織中具有高轉(zhuǎn)移潛能的腫瘤轉(zhuǎn)移種子細(xì)胞，并鑒定出了腫瘤轉(zhuǎn)移種子細(xì)胞演進(jìn)的3個(gè)關(guān)鍵分子：ALDH2、免疫球蛋白超級(jí)家族9 號(hào)成員（immunoglobulin superfamily member 9，IGSF9）和PR結(jié)構(gòu)域家族16 號(hào)成員（PR-domain containing 16，PRDM16）。其中，ALDH2 在IMPC 組織中高表達(dá)，提示ALDH2 是促進(jìn)IMPC 高侵襲和轉(zhuǎn)移的種子基因。因此，設(shè)計(jì)ALDH2 靶向熒光探針標(biāo)記體內(nèi)高轉(zhuǎn)移潛能的腫瘤細(xì)胞，可實(shí)現(xiàn)在體腫瘤細(xì)胞的定位，并可評(píng)估腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能。

ALDH2 屬于醛脫氫酶家族，位于線粒體。早期研究表明其主要功能是將乙醛代謝成無毒的乙酸，參與乙醇氧化代謝過程[25]。近年來，多研究表明ALDH2 在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，ALDH2 失活或活性降低使乙醛在體內(nèi)蓄積，過量的乙醛與谷胱甘肽結(jié)合抑制抗氧化防御系統(tǒng)，增加體內(nèi)的活性氧簇（ROS），促進(jìn)氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而導(dǎo)致腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移[26]。多項(xiàng)研究表明，ALDH2 在多種不同類型的腫瘤中表達(dá)增加，且與不良預(yù)后顯著相關(guān)。Chen 等[12]研究表明，ALDH2 高表達(dá)可增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力。Ramakrishnan 等[27]研究發(fā)現(xiàn)，在浸潤(rùn)性膀胱癌中ALDH2 高表達(dá)的亞群具有侵襲性表型。Aboulouard 等[28]通過對(duì)子宮內(nèi)膜癌和其前哨淋巴結(jié)的臨床樣本進(jìn)行空間蛋白組學(xué)測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)了高表達(dá)分子ALDH2 更多在子宮內(nèi)膜癌的Ⅱ級(jí)和Ⅲ級(jí)中表達(dá)，故被認(rèn)為是腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵分子之一。

ALDH2 不僅在IMPC 這種高轉(zhuǎn)移的乳腺癌中高表達(dá)，還與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力成正比。ALDH2在乳腺正常組織中低表達(dá)，在乳腺癌中高表達(dá)，其蛋白表達(dá)水平與腫瘤細(xì)胞的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，與患者的極差預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，是患者死亡風(fēng)險(xiǎn)的獨(dú)立預(yù)后因素。以上研究結(jié)果均顯示ALDH2 是識(shí)別具有轉(zhuǎn)移潛能腫瘤細(xì)胞的重要候選分子，使ALDH2體內(nèi)成像，評(píng)估其在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平，可實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)高效的病理診斷。另外，ALDH2 體內(nèi)成像可為術(shù)中精準(zhǔn)、徹底地切除腫瘤提供依據(jù)。

本研究依據(jù)前期研究鑒定出腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵分子ALDH2，對(duì)脂質(zhì)體納米表面修飾Folate 并包載ALDH2 抗體，構(gòu)建高靈敏、高特異性的線粒體靶向熒光分子探針，并借助近紅外分子影像技術(shù)，識(shí)別具有高侵襲轉(zhuǎn)移潛能的腫瘤干細(xì)胞。同時(shí)選取人源乳腺癌細(xì)胞系具有高侵襲/轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)的MDAMB-231（三陰型）和BT474（Luminal B 型）與探針共孵育，評(píng)估探針的體外靶向結(jié)合能力。結(jié)果顯示，ALDH2-Cy7@LP-FA 可特異性靶向線粒體中的ALDH2，選擇性結(jié)合ALDH2 高表達(dá)癌細(xì)胞，共定位分析顯示該探針在線粒體中特異性積累，其線粒體定位能力優(yōu)異。且探針對(duì)細(xì)胞的毒性極低，具有良好的生物相容性。未來將進(jìn)一步完善在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證。希望可以精準(zhǔn)顯像具有轉(zhuǎn)移潛能的腫瘤細(xì)胞和癌灶邊界，實(shí)現(xiàn)檢測(cè)ALDH2 過表達(dá)的早期乳腺癌，對(duì)腫瘤和轉(zhuǎn)移灶進(jìn)行精準(zhǔn)全切除。此外，ALDH2同樣在子宮內(nèi)膜癌、肺癌、肝癌等中參與腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移過程，被認(rèn)為是腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵分子之一。因此，基于ALDH2 合成的靶向分子探針可能在多種腫瘤中具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。