王芮琦，張云龍，方彥雯，李心樂，4，衛(wèi)敏，廖鐘財，張平，4，5

（1.天津醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院人體解剖與組織胚胎學系，天津 300070；2.天津醫(yī)科大學口腔醫(yī)院口腔綜合科，天津 300070；3.和也健康科技有限公司，安吉 313399；4.國家衛(wèi)生健康委員會激素與發(fā)育重點實驗室，天津市代謝性疾病重點實驗室，朱憲彝紀念醫(yī)院，天津醫(yī)科大學，天津 300134；5.天津市脊柱脊髓重點實驗室，天津 300052）

股骨頭壞死（ON）是指由于股骨頭發(fā)生缺血、缺氧而引起骨細胞及骨髓壞死，導致股骨頭結構改變，最終使股骨頭塌陷的一種慢性疾病，是骨科領域一種常見的難治性疾病[1]。缺血性股骨頭壞死多發(fā)生于青壯年，致殘率高，是目前國內(nèi)外研究的重點、難點[2]。研究表明，在股骨頭壞死發(fā)生時，由于組織內(nèi)部缺血、缺氧，可能有利于成骨細胞和破骨細胞的活性變化，導致正常骨代謝進程被破壞，進而導致股骨頭壞死[3]。因此，調(diào)節(jié)壞死區(qū)成骨細胞和破骨細胞的活性，可能是延緩股骨頭壞死疾病進展的有效方法之一。

靜磁場也稱穩(wěn)態(tài)磁場或穩(wěn)恒磁場，是具有恒定磁感應強度和方向的磁場[4]。根據(jù)磁場強度，靜磁場可分為亞磁場（<5 μT）、弱磁場（5 μT～1 mT）、中強磁場（1 mT～1 T）和強磁場（>1 T）[5]。前期研究表明，中等強度靜磁場可用于臨床實踐，是直接治療損傷部位、疼痛、炎癥以及各種類型疾病的無創(chuàng)、安全、簡單的方法[6]。目前靜磁場已經(jīng)廣泛應用于骨生物學研究，可以預防和治療骨質(zhì)疏松癥、修復骨缺損、促進骨折愈合并減輕癥狀[7]。然而，靜磁場作為一種穿透性強且能量損耗低的物理治療方式，能否延緩股骨頭壞死的病理進程尚不清楚。本實驗采用將大鼠股骨頭圓韌帶切斷、縫線結扎股骨頸遠端，模擬股骨頭血供受損的股骨頭壞死模型，評估靜磁場對股骨頭壞死骨重建與血管生成的影響，為物理治療股骨頭壞死提供新的見解。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 45 只約12 周齡的SPF 級雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，體重230～250 g，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供[生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2022-0002，動物批號：NO.111251221100144445]。每籠飼養(yǎng)5 只大鼠，飼養(yǎng)室光照-黑暗周期為12 h，溫度控制在25℃下，允許其自由攝取飼料和水。所有實驗根據(jù)天津醫(yī)科大學實驗動物管理規(guī)定進行，并經(jīng)天津醫(yī)科大學倫理委員會批準［SYXK（津）2019-0004］。

1.1.2 主要儀器和試劑 數(shù)字化雙能X 線骨密度儀購自美國Norland 公司。石蠟切片機（RM255）購自德國Leica 公司。光學顯微鏡BX53 購自日本Olympus 公司。HE、MacNeal′s、TRAP 染料、β-actin 一抗均購自美國Sigma 公司。墨汁購自中國北京索萊寶公司。RUNX2、NFATc1 一抗均購自美國Abcam 公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及造模 45 只大鼠采用隨機數(shù)字表法分成為對照組（Sham 組，n=15）、股骨頭壞死組（ON 組，n=15）、股骨頭壞死靜磁場治療組（ONS 組，n=15）。如前所述進行股骨頭壞死造模[8-9]。用2%異氟烷麻醉大鼠，側(cè)臥備皮，以股骨大轉(zhuǎn)子為中心取髖部外側(cè)切口，分離皮下組織及肌肉層，打開髖關節(jié)囊并顯露股骨頭，隨后將髖關節(jié)脫位，切斷股骨頭圓韌帶，使用3.0 縫線結扎股骨頸遠端，使股骨頭血供受損，造成股骨頭缺血性壞死模型，雙側(cè)股骨頭同時造模（圖1）。隨后將髖關節(jié)復位，分層縫合肌肉組織、皮下組織和表皮。確保術中股骨頭完整分離、縫線結扎牢固，及時消毒清理術后手術器械，避免細菌污染。Sham 組在不破壞股骨頭解剖結構的前提下，切開后只分離臀大肌后縫合。術后3 d 內(nèi)，給予大鼠1%的鹽酸丙嗎卡因和恩諾沙星（5 mg/kg）藥膏局部涂抹（1 次/d），分別緩解手術創(chuàng)傷所致疼痛和預防感染。

圖1 股骨頭壞死造模示意圖Fig.1 Schematic diagram of femoral head necrosis modeling

1.2.2 靜磁場治療 手術造模后第2 天，ONS 組接受靜磁場治療。在鼠籠底部放置定制的靜磁場設備治療4 周，每天持續(xù)24 h（圖2）。根據(jù)前期實驗的結果，選擇200 mT 為合適的靜磁場強度[10]。放置靜磁場后，允許大鼠在籠子中正?；顒?。Sham 組和ON組僅放置在鼠籠中，沒有靜磁場干預。

圖2 靜磁場裝置示意圖Fig.2 Schematic diagram of static magnetic field device

1.3 骨密度（BMD）檢測 在靜磁場治療后，使用2%異氟烷對大鼠進行吸入式麻醉，雙能X 線骨密度儀（pDEXA）檢測大鼠BMD，定位在大鼠雙側(cè)股骨頭，指標為BMD 和骨礦含量（BMC）。

1.4 組織學分析

1.4.1 組織處理 30 只大鼠（每組n=10）在造模后第4 周末進行人道主義處死。剝離大鼠后腿，剔除皮膚、軟組織及韌帶，保留完整股骨頭。將股骨頭組織置于10%中性福爾馬林中固定2 d，14%的EDTA中脫鈣5 周。將骨組織標本用石蠟包埋，冠狀位切片，厚度為5 μm。

1.4.2 HE、MacNeal′s、TRAP 染色 使用石蠟包埋的大鼠股骨頭標本（n=6），組織切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化后，進行HE、MacNeal′s、TRAP 染色，脫水透明后樹膠封片，顯微鏡下每張切片隨機選取5 個高倍視野，觀察組織病理形態(tài)學改變。使用Olympus CCD DP73 軟件進行骨小梁的面積/總面積、空骨陷凹率等相關數(shù)據(jù)的測量。

1.4.3 墨汁灌注 首先麻醉動物，將15 只大鼠在實驗結束后第4 周末（每組n=5）腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）進行麻醉。然后將大鼠四肢固定，用肝素生理鹽水灌注心臟（每只大鼠生理鹽水用量約為80 mL），直至灌注液可以從右心房造口處流出，保證流出液清亮時停止灌注。抽取墨汁灌注液并進行左心室灌注，保證灌注液能從右心房造口處流出，至大鼠皮膚黏膜全部變黑為止（每只大鼠灌注液用量約為100 mL）。灌注結束后，處死大鼠，將大鼠靜置于4℃過夜。保留股骨頭組織，脫鈣5 周后進行石蠟包埋并切片，切片厚度為25 μm。使用中性樹膠封片并在正置顯微鏡下觀察并測量單位面積內(nèi)的血管面積。

1.5 Western 印跡分析 充分研磨股骨頭組織，在RIPA 裂解緩沖液中提取總蛋白。在4℃下離心10 min 去除雜質(zhì)。采用一抗RUNX2（1∶1 000）、NFATc1（1∶1 000）和β-actin（1∶10 000）在4℃過夜孵育。二抗室溫（1∶20 000）孵育90 min 后，經(jīng)化學發(fā)光后用凝膠成像系統(tǒng)檢測相關蛋白的表達并通過Image J軟件分析各組蛋白條帶的灰度值。

1.6 統(tǒng)計學處理 使用IBM SPSS Statistics 26 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，并采用Graphpad Prism 7 軟件進行統(tǒng)計圖制作。符合正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)采用表示，多組間比較采用單因素方差分析（oneway ANOVA），組間多重比較行最小顯著差法（LSDt檢驗）。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 靜磁場增強股骨頭壞死大鼠的BMD 與Sham組相比，ON 組股骨頭壞死區(qū)域的BMD、BMC 降低（t=22.030、13.088，均P<0.001），而應用靜磁場治療4 周后，與ON 組相比，ONS 組大鼠股骨頭壞死區(qū)域的BMD、BMC 降低情況得到改善（t=-5.372、-4.584，均P<0.001，圖3）。

圖3 各組大鼠股骨頭骨密度的改變Fig.3 Changes in bone density of the femoral head in each group

2.2 靜磁場促進股骨頭壞死大鼠骨量的增加 在顯微鏡下，對HE 染色的股骨頭石蠟切片照相、分析骨小梁的面積/總面積（%），并觀察代表骨壞死形成的空骨陷凹。結果表明，與Sham 組相比，ON 組骨量明顯減少（t=1.352，P<0.001）；而靜磁場治療后，與ON 組相比，ONS 組骨量顯著增加（t=-4.038，P<0.001）。高倍鏡視野顯示：與Sham 組相比，ON 組視野內(nèi)可見大量空骨陷凹（t=-6.662，P<0.001）；而經(jīng)過靜磁場治療后，ONS 組比ON 組空骨陷凹數(shù)明顯減少（t=2.056，P<0.05，圖4）。

圖4 股骨頭HE 染色形態(tài)學檢查（40×，200×）Fig.4 Morphological examination of the femoral head by HE staining（40×，200×）

2.3 靜磁場促進股骨頭壞死大鼠的骨形成 Mac-Neal′s 染色結果顯示，與Sham 組相比，ON 組股骨頭的成骨細胞數(shù)/骨表面明顯減少（t=18.762，P<0.001），但靜磁場治療后，與ON 組相比，ONS 組成骨細胞數(shù)/骨表面顯著增加（t=-8.227，P<0.001，圖5）。與Sham 組相比，ON 組RUNX2 蛋白的表達水平明顯降低，而經(jīng)靜磁場治療后，ONS 組比ON 組RUNX2 蛋白的表達水平明顯提高（t=12.080、-5.850，均P<0.05，圖6）。

圖5 股骨頭MacNeal′s 染色（400×）Fig.5 MacNeal′s staining of the femoral head（400×）

圖6 Western 印跡檢測各組RUNX2 表達Fig.6 Western blotting was used to detect the expression of RUNX2 in each group

MacNeal′s 染色結果顯示，與Sham 組相比，ON組股骨頭的成骨細胞數(shù)/骨表面明顯減少（t=18.762，P<0.001），但靜磁場治療后，與ON 組相比，ONS 組成骨細胞數(shù)/骨表面顯著增加（t=-8.227，P<0.001，圖5）。與Sham 組相比，ON 組RUNX2 蛋白的表達水平明顯降低，而經(jīng)靜磁場治療后，與ON 組相比，ONS組RUNX2 蛋白的表達水平明顯提高（t=12.080、-5.850，均P<0.05，圖6）。

2.4 靜磁場抑制股骨頭壞死大鼠的骨吸收 TRAP染色顯示，與Sham 組相比，ON 組中破骨細胞數(shù)/骨表面明顯增加，破骨細胞異?；钴S（t=-9.803，P<0.001）；而與ON 組相比，ONS 組破骨細胞數(shù)/骨表面顯著減少（t=4.116，P<0.05），見圖7。采用Western印跡結果表明，ON 組股骨的NFATc1 表達量比Sham 組明顯增加（t=-6.033，P<0.001）；而靜磁場治療后，ONS 組比ON 組NFATc1 表達量顯著減少（t=3.618，P<0.05，圖8）。

圖7 股骨頭TRAP 染色（400×）Fig.7 TRAP staining of the femoral head（400×）

圖8 Western 印跡檢測各組NFATc1 表達Fig.8 Western blotting was used to detect the expression of NFATc1 in each group

2.5 靜磁場促進股骨頭壞死大鼠的血管生成 墨汁灌注實驗顯示，與Sham 組相比，ON 組血管面積明顯減少（t=7.389，P<0.001），而與ON 組相比，ONS 組血管面積減少得到顯著改善（t=-3.613，P<0.01，圖9）。

圖9 墨汁灌注實驗檢測靜磁場對大鼠血管生成的影響（100×）Fig.9 The effect of static magnetic field on angiogenesis was detected by ink perfusion experiment in rats（100×）

3 討論

股骨頭壞死又稱股骨頭缺血性壞死，是由于股骨頭缺乏血供而導致骨壞死的一種骨科疾病[11]。統(tǒng)計顯示股骨頸骨折、髖關節(jié)脫位、皮質(zhì)類固醇類激素治療和酗酒是導致股骨頭壞死發(fā)生、發(fā)展的常見原因[12]。目前，股骨頭壞死的發(fā)病率逐年升高，已經(jīng)造成了嚴重的社會和經(jīng)濟負擔[13]。因此，找到有效治療股骨頭壞死的方法顯得格外迫切。

因為股骨頭壞死多發(fā)于青壯年，而置換的假體使用壽命有限，且青年人活動量大，容易造成假體松動，因此并不適合進行髖關節(jié)置換手術，臨床上進行早期診斷和治療可有效保護髖關節(jié)，延緩關節(jié)置換時間[14]。研究表明，靜磁場作為一種無創(chuàng)、安全且簡便的治療方式，可以通過促進成骨細胞增殖和分化，增加BMD、促進骨愈合、維持骨骼健康和治療骨骼疾病[15-16]。本實驗以股骨頭壞死大鼠為研究對象，探究靜磁場改善股骨頭組織骨重建與血管生成的機制，證實靜磁場通過增強成骨細胞的骨形成，抑制破骨細胞的骨吸收，增加血管生成，延緩股骨頭壞死。本結果與之前報道的靜磁場對骨骼、關節(jié)的有益作用相一致[17]。股骨頭塌陷可能與成骨細胞和破骨細胞活性的變化有關[18]。研究證明，骨壞死區(qū)內(nèi)參與血管生成的內(nèi)皮祖細胞功能發(fā)生障礙，死亡的細胞會釋放內(nèi)源性炎癥因子，刺激破骨細胞的活化增加，導致組織進一步的損傷[19]。股骨頭壞死也會導致患者骨壞死區(qū)內(nèi)骨髓干細胞和成骨細胞的功能下降[20]。在壞死區(qū)，骨修復差，參與骨組織修復的骨細胞增殖能力降低，破骨細胞活性增加，進而導致骨丟失[20]。因此，調(diào)節(jié)壞死區(qū)的成骨和破骨細胞活性可能是延緩股骨頭壞死進展的有效方法之一。在本研究中，與ON 組相比，靜磁場治療增加了股骨頭組織的骨量。MacNeal′s 染色顯示，靜磁場治療增加了股骨頭組織骨小梁表面成骨細胞的數(shù)量。TRAP染色顯示，經(jīng)過靜磁場治療后，股骨頭組織骨小梁表面破骨細胞的數(shù)量減少。Western 印跡結果顯示，靜磁場治療增加了股骨中RUNX2 的表達，降低了NFATc1 的表達。另外，成功的血管生成可以有效刺激骨再生，而新生血管的減少會導致骨再生下降[21]。筆者之前的研究發(fā)現(xiàn)，機械加載作為一種動態(tài)力學刺激，通過周期循環(huán)的力學刺激和骨應力變化，引起骨髓腔內(nèi)壓改變、骨質(zhì)內(nèi)液體流動與分子轉(zhuǎn)運，增加H 血管的表達，促進成骨，抑制破骨，影響骨髓間充質(zhì)干細胞分化，調(diào)節(jié)血管生成，進而達到治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的目的[22-24]。但機械加載作用于體表，通過間接的方式刺激骨髓腔內(nèi)壓改變、骨質(zhì)內(nèi)液體流動與分子轉(zhuǎn)運而發(fā)揮治療作用，且在轉(zhuǎn)化到臨床治療過程中，由于個體差異大，無法達到統(tǒng)一的作用效果，故仍有局限性。而靜磁場屬于靜態(tài)力學刺激，可以更直接的影響到深層組織細胞，更快發(fā)揮作用。且相關研究表明，靜磁場可以通過增強細胞活力，增加血管生成，促進傷口愈合[25]。故在此基礎上，本實驗擴展了之前的研究范圍，探究靜磁場對股骨頭壞死血管生成的作用機制。在本研究中，墨汁灌注實驗顯示，靜磁場治療可以增加股骨頭組織內(nèi)血管的生成。這與靜磁場治療可促進血管生成的結果相一致[26]。

綜上所述，本研究表明靜磁場可以作為股骨頭壞死的一種新的治療方法，創(chuàng)新性地證實了靜磁場對促進成骨細胞的骨形成、抑制破骨細胞的骨吸收從而改善骨重建并增加血管生成的治療效果。但是本研究還有不足之處，如靜磁場對股骨頭骨壞死區(qū)域內(nèi)血管微環(huán)境的調(diào)節(jié)，延緩骨壞死的具體機制還需要進一步探究。