張春芝, 王明清, 黃國(guó)清, 肖軍霞

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院1,青島 266109)

(山東省花生研究所2,青島 266109)

鈣是機(jī)體內(nèi)一種重要的營(yíng)養(yǎng)素,對(duì)維持機(jī)體的健康起著無(wú)法替代的作用,其與細(xì)胞代謝、神經(jīng)傳導(dǎo)、骨骼生長(zhǎng)、肌肉收縮和心臟功能密切相關(guān)[1]。當(dāng)鈣攝入量不足時(shí)可導(dǎo)致諸多疾病,如骨質(zhì)疏松、骨折、退行性骨病、兒童佝僂病及高血壓、結(jié)腸癌、肥胖癥和腎結(jié)石等[2,3]。飲食攝入是機(jī)體補(bǔ)充骨骼中鈣儲(chǔ)存的唯一來(lái)源[4]。目前市場(chǎng)上已有多種補(bǔ)鈣產(chǎn)品,其中以無(wú)機(jī)(如碳酸鈣)和有機(jī)鈣(如葡萄糖酸鈣)為主,這些產(chǎn)品在胃酸中釋放出游離的鈣離子,后者在堿性腸道條件下形成不溶性氫氧化鈣,從而導(dǎo)致鈣吸收困難[5];此外,氫氧化鈣會(huì)附著在腸壁表面,進(jìn)而對(duì)其他營(yíng)養(yǎng)素的吸收造成不利影響[6]。氨基酸螯合鈣克服了上述鈣補(bǔ)充劑的缺點(diǎn),但是其成本較高且有引起脂肪氧化的傾向,這在一定程度上限制了其應(yīng)用[7]。肽鈣螯合物具有獨(dú)特的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制,能夠顯著提高機(jī)體對(duì)鈣的吸收,同時(shí)多肽還可以提高其他礦物元素的生物利用度,因此肽鈣螯合物是一種有潛力的新型鈣補(bǔ)充劑。目前已從多種不同來(lái)源的蛋白質(zhì)中制備得到了鈣螯合肽,如酪蛋白磷酸肽、太平洋鱈魚(yú)骨膠原肽、大豆肽等[7]。已有學(xué)者從多肽分子質(zhì)量、氨基酸組成及與鈣離子的螯合方式等角度初步揭示了鈣螯合肽的構(gòu)效關(guān)系[8],并對(duì)其體內(nèi)吸收途徑及生物利用度進(jìn)行了一定研究[9,10],這為新型肽鈣螯合物的開(kāi)發(fā)及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用提供了參考。

花生是全世界及我國(guó)的重要農(nóng)作物,其總產(chǎn)量的54%用于榨油。由于高溫壓榨使花生蛋白發(fā)生變性導(dǎo)致其功能性質(zhì)較差,榨油后的花生餅粕并未得到充分利用,這造成了較嚴(yán)重的資源浪費(fèi)[11]?；ㄉ鞍装被岱N類齊全,必需氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)38.29%,生物活性肽是花生蛋白重要的綜合利用途徑之一,已從花生蛋白成功制備了具有降血壓[12]、抗氧化[13]、抗菌[14]等多種生理功能的多肽水解物。

以花生蛋白為原料來(lái)制備鈣螯合肽的研究已有少量報(bào)道。馮文君[15]用蛋白酶M(protease M)對(duì)花生蛋白進(jìn)行單酶水解,然后再用谷氨酰胺酶進(jìn)行脫酰胺處理,得到了鈣結(jié)合能力為110.8 mg/g 的花生多肽;在此基礎(chǔ)上,又對(duì)花生蛋白水解物進(jìn)行超濾,得到了鈣結(jié)合能力達(dá)(124.70±0.80)mg/g的級(jí)分,該級(jí)分可以有效提高鈣在骨骼中的積累[9],并促進(jìn)鈣離子在Caco-2細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運(yùn)且不會(huì)影響細(xì)胞的通透性[10]。

花生肽與鈣離子形成的螯合物具有顯著的生理功能,但是其鈣結(jié)合能力仍然有提升的空間。本實(shí)驗(yàn)以花生蛋白為原料,通過(guò)多酶水解的方式來(lái)進(jìn)一步提高花生蛋白的水解度和花生肽的鈣結(jié)合能力,利用大孔樹(shù)脂吸附對(duì)鈣螯合肽進(jìn)行富集,并對(duì)所得鈣肽螯合物的性質(zhì)進(jìn)行表征,以期為花生蛋白的綜合利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花生蛋白粉(山東,蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)47%);Alcalase 2.4 L堿性蛋白酶(2.4 AU/g)、Neutrase 0.8 L中性蛋白酶(600 U/mg)、Protamex復(fù)合蛋白酶(1.5 AU/g)、FlavourzymeTM蛋白酶(1 000 LAPU/g)、木瓜蛋白酶(800 U/mg)、酸性蛋白酶(800 U/mg)、Corolase?LAP外切蛋白酶(350 LAP/g)、ProteAXH肽酶(1 400 U/g);大孔樹(shù)脂D101、ADS-7、AB-8、DM301、XAD-2,離子交換樹(shù)脂IRA900C1、IRC76RCF,其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Nano ZS90納米粒度及zeta電位分析儀,F2700熒光分光光度計(jì),Chiransan圓二光譜儀,NicoletIR200傅里葉變換紅外光譜儀,SHA-B水浴恒溫振蕩器,UV-1200紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)。

1.3 方法

1.3.1 蛋白酶的篩選

按酶底比0.05%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))分別將Alcalase 2.4 L、Neutrase、酸性蛋白酶、木瓜蛋白酶、Protamex和FlavourzymeTM加入裝有100 mL質(zhì)量濃度為2 mg/100 mL的花生蛋白懸浮液的三角瓶中,然后在各自推薦的最適條件下(詳見(jiàn)表1)在水浴中振蕩4 h。反應(yīng)結(jié)束后,100 ℃沸水浴滅酶10 min,然后在8 000 g下離心15 min,取上清液凍干,測(cè)定水解度、氮回收率及鈣結(jié)合能力。

表1 8種市售蛋白酶的推薦最適反應(yīng)條件

1.3.2 復(fù)合蛋白酶體系的篩選

按酶底比0.05%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))將Alcalase 2.4 L堿性蛋白酶加入裝有100 mL質(zhì)量濃度為2 mg/100 mL的花生蛋白懸浮液的三角瓶中,然后在其推薦的最適條件下(見(jiàn)表1)水浴中振蕩4 h;反應(yīng)結(jié)束后,用0.1 mol/L NaOH或HCl溶液調(diào)節(jié)到合適的pH值,再按照酶底比0.05%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))分別加入ProteAXH肽酶、木瓜蛋白酶、Protamex復(fù)合蛋白酶或Corolase?LAP外切蛋白酶,按照表1的最適條件繼續(xù)水解4 h。反應(yīng)結(jié)束后,100 ℃沸水浴滅酶10 min,然后在8 000 g下離心15 min,取上清液凍干,測(cè)定水解度、氮回收率及鈣結(jié)合能力。

1.3.3 花生肽脫酰胺

采用酸化法對(duì)花生肽進(jìn)行脫酰胺處理[16]。準(zhǔn)確稱取花生肽凍干粉溶于0.4 mol/L的鹽酸中使其質(zhì)量濃度達(dá)到3 mg/100 mL,密封后于90 ℃下反應(yīng)4 h。反應(yīng)結(jié)束后,用NaOH調(diào)節(jié)其pH至7.0,利用分子截留量為100 u的透析袋在去離子水中透析以除去鹽份,冷凍干燥后測(cè)定其鈣結(jié)合能力。

1.3.4 花生肽鈣螯合物制備條件的優(yōu)化

以CaCl2為鈣離子來(lái)源,采用單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)花生肽鈣螯合物的制備工藝進(jìn)行優(yōu)化。向質(zhì)量濃度為3 mg/100 mL的脫酰胺花生肽溶液中加入CaCl2,使多肽與鈣離子的質(zhì)量比達(dá)到1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1,用0.1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH值至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0,然后在30、40、50、60、70 ℃下靜置20、40、60 、80、100、120 min,使花生肽與鈣離子發(fā)生螯合作用。反應(yīng)結(jié)束后,向體系中加入5倍體積的無(wú)水乙醇,8 000 g下離心15 min,收集沉淀即得花生肽鈣螯合物,冷凍干燥后備用。

1.3.5 花生鈣螯合肽富集條件的優(yōu)化

1.3.5.1 大孔樹(shù)脂的篩選

稱取處理好的D101、AB-8、DM301、XAD-2、ADS-7、IRA900C1、IRC76RCF樹(shù)脂各10 g,分別放入200 mL具塞錐形瓶中,隨后分別加入50 mL質(zhì)量濃度為20 mg/mL的脫酰胺花生肽溶液,置于30 ℃恒溫?fù)u床中150 r/min振蕩12 h,然后抽濾收集濾液,測(cè)定剩余多肽的鈣結(jié)合能力及損失率。

1.3.5.2 大孔樹(shù)脂吸附富集工藝優(yōu)化

稱取處理好的最優(yōu)樹(shù)脂10 g,放入200 mL具塞錐形瓶中,按照大孔樹(shù)脂與多肽質(zhì)量比5∶1、7.5∶1、10∶1、12.5∶1、15∶1加入脫酰胺花生肽溶液,調(diào)節(jié)其pH值至1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0,在25、30、35、40、45、50 ℃下反應(yīng)3、6、9、12、18 h,然后抽濾收集濾液,測(cè)定其鈣結(jié)合能力。

1.3.6 脫酰胺花生肽及其鈣螯合物的表征

1.3.6.1 粒徑及ζ電位分析

將經(jīng)過(guò)樹(shù)脂富集的脫酰胺花生肽及其鈣螯合物的凍干粉溶解于去離子水中,在25 ℃條件下利用Nano ZS90納米粒度及zeta電位分析儀測(cè)定其ζ電位和粒徑。

1.3.6.2 熒光光譜分析

將經(jīng)過(guò)樹(shù)脂富集的脫酰胺花生肽溶于去離子水中使其質(zhì)量濃度達(dá)到0.2 mg/mL,再加入一定體積的1 mol/L CaCl2溶液,使反應(yīng)體系中的Ca2+濃度達(dá)到0、5、10、15、20、25 μmol/L,根據(jù)1.3.4確定的花生肽與鈣螯合的最適條件進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后立即進(jìn)行熒光光譜掃描,激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)置為280 nm,發(fā)射波長(zhǎng)設(shè)置為為290～500 nm,發(fā)射光與激發(fā)光縫寬均設(shè)為10 nm[17]。

1.3.6.3 圓二色譜分析

將經(jīng)過(guò)樹(shù)脂富集的脫酰胺花生肽及其鈣螯合物的凍干粉溶解于去離子水中,使其質(zhì)量濃度達(dá)到0.1 mg/mL,于190～260 nm 的波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行圓二色光譜掃描,掃描速率為 100 nm/min,掃描間隔為 0.5 nm,以去離子水作為空白,每個(gè)樣品重復(fù)掃描3次。

1.3.6.4 傅里葉紅外光譜分析

取1 mg將經(jīng)過(guò)樹(shù)脂富集的脫酰胺花生肽及其鈣螯合物凍干粉與100 mg KBr混合均勻,壓片后進(jìn)行紅外光譜分析,掃描范圍為4 000～400 cm-1,儀器分辨率為4 cm-1,掃描次數(shù)為64。

1.3.7 水解度及蛋白質(zhì)回收率的測(cè)定

采茚三酮法測(cè)定花生蛋白的水解度(DH),其水解度計(jì)算公式為[18]:

式中:h為水解液中每克蛋白被裂解的肽鍵數(shù);htot為每克花生蛋白質(zhì)中的總肽鍵數(shù)/mmol/g,其值為7.13 mmol/g[19]。

通過(guò)凱氏定氮法測(cè)定反應(yīng)體系中花生蛋白的蛋白質(zhì)含量(m1)及水解結(jié)束后離心上清液中的蛋白質(zhì)含量(m2),通過(guò)公式計(jì)算蛋白質(zhì)回收率(Pr):

1.3.8 鈣結(jié)合能力測(cè)定

采用EDTA配位滴定法測(cè)定鈣離子含量[20]。將10 mg花生肽鈣螯合物溶解于去離子水中,定容至25 mL,加入1 mL掩蔽劑三乙醇胺并滴用KOH調(diào)節(jié)pH至12.0,加入3滴鈣紅指示劑,搖勻后用EDTA標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定,直至指示劑由紫紅色變藍(lán)色。記錄消耗體積,按公式計(jì)算花生肽的鈣結(jié)合能力:

式中:C為EDTA標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度/mol/L;V為滴定螯合物所消耗的EDTA標(biāo)準(zhǔn)溶液體積/L;V0為滴定空白所消耗的EDTA標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積/L;M為鈣的摩爾質(zhì)量/g/mol;m為肽鈣螯合物的質(zhì)量/g。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均至少有3個(gè)重復(fù),結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。采用SPSS 16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,組間差異采用方差分析(ANOVA)中的Tukey HSD 測(cè)試,當(dāng)P<0.05 時(shí)認(rèn)為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 花生蛋白酶解工藝的優(yōu)化

2.1.1 蛋白酶種類的影響

由圖1可知,蛋白酶種類對(duì)花生蛋白的水解度和氮回收率以及水解產(chǎn)物的鈣結(jié)合能力有重要影響,其中Alcalase 2.4 L的效果最好,木瓜蛋白酶次之,酸性蛋白酶效果最差。同時(shí),Alcalase 2.4 L堿性蛋白酶對(duì)花生蛋白的水解度也遠(yuǎn)高于最適pH值為3.0的蛋白酶M(16.7%)[15],這是由于花生蛋白在堿性條件下可溶,因此能夠與堿性蛋白酶充分接觸而使得水解更為充分。這一超高的蛋白質(zhì)回收率和水解度對(duì)于花生蛋白的綜合利用具有重要意義,Ge等[21]也采用這一策略顯著提高了玉米蛋白粉水解物的蛋白質(zhì)回收率。同時(shí),由圖1還可以看出,花生蛋白水解物的鈣結(jié)合能力與花生蛋白的水解度之間呈正相關(guān),表明花生多肽可能主要通過(guò)其羧基與鈣離子結(jié)合[7]。

注:1為花生蛋白;2為Alcalase 2.4 L堿性蛋白酶;3為Neutrase 0.8 L中性蛋白酶;4為酸性蛋白酶;5為FlavourzymeTM蛋白酶;6為Protamex復(fù)合蛋白酶;7為木瓜蛋白酶。同一系列數(shù)據(jù)帶不同字母表示差異顯著,下同。圖1 蛋白酶種類對(duì)花生蛋白水解度、蛋白質(zhì)回收率及水解物鈣結(jié)合能力的影響

2.1.2 雙酶復(fù)合水解的影響

由于Alcalase 2.4 L對(duì)花生蛋白的水解能力及所得水解產(chǎn)物的鈣結(jié)合能力均最強(qiáng)(圖1),本實(shí)驗(yàn)將Alcalase 2.4 L與另外幾種蛋白酶,包括木瓜蛋白酶、Protamex復(fù)合蛋白酶以及Corolase?LAP外切蛋白酶、ProteAXH肽酶進(jìn)行復(fù)配,以期進(jìn)一步提高花生蛋白的水解效果。由圖2可知,雙酶復(fù)合水解可以顯著提高花生蛋白的水解效果以及水解物的鈣結(jié)合能力,其中與ProteAXH肽酶復(fù)配時(shí)效果最好,花生蛋白的水解度、蛋白質(zhì)回收率及水解產(chǎn)物的鈣結(jié)合能力分別達(dá)到了32.19%、87.89%和84.09 mg/g,與Alcalase 2.4 L單酶水解時(shí)分別增加了70.95%、6.84%和26.98%。目前已知的對(duì)花生蛋白水解能力最強(qiáng)的是來(lái)自于黑曲霉HN 3.042(AspergillusnigerHN 3.042)的蛋白酶提取物,其水解度高達(dá)43.4%,但是蛋白質(zhì)回收率為86.6%[22],與本實(shí)驗(yàn)相當(dāng);另外,本實(shí)驗(yàn)利用雙酶水解法得到的花生肽的鈣結(jié)合能力與用蛋白酶M水解得到的花生蛋白水解物的結(jié)果接近(82.5 mg/g)[23]。

注:1為 Alcalase 2.4 L;2為Alcalase 2.4 L+ProteAXH;3為Alcalase 2.4 L+Corolase? LAP;4為Alcalase 2.4 L+Protamex;5為Alcalase 2.4 L+木瓜蛋白酶。圖2 Alcalase 2.4 L與其他蛋白酶復(fù)配對(duì)花生蛋白水解度、蛋白質(zhì)回收率及水解物鈣結(jié)合能力的影響

2.2 脫酰胺對(duì)花生肽鈣結(jié)合能力的影響

脫酰胺可以將Asn和Gln轉(zhuǎn)化為Asp和Glu從而釋放出更多的羧基,進(jìn)而增強(qiáng)多肽的鈣結(jié)合能力。Yuan等[9]和Bao等[10]采用酶法實(shí)現(xiàn)了花生蛋白鈣螯合肽的脫酰胺,本實(shí)驗(yàn)則采用酸法進(jìn)行處理。由圖3可知,用Alcalase 2.4 L單酶水解得到的花生肽脫酰胺后的鈣結(jié)合能力達(dá)到了95.57 mg/g,相比未處理之前提高了44.32%;而Alcalase 2.4 L和ProteAHX肽酶雙酶水解產(chǎn)物經(jīng)脫酰胺后的鈣結(jié)合能力更是達(dá)到了132.04 mg/g,與對(duì)照相比提高了57.10%,表明脫酰胺是提高花生肽鈣結(jié)合能力的有效手段。這與袁興宇等[23]的結(jié)果一致,即用谷氨酰胺酶對(duì)花生蛋白的蛋白酶M水解物進(jìn)行脫酰胺處理后,水解物的鈣結(jié)合能力由82.5 mg/g顯著提高至135.26 mg/g,同時(shí)在大豆蛋白肽中也觀察到了類似的效果[24,25]。這可能與花生蛋白中含酰胺的氨基酸含量較高有關(guān),有研究表明,花生蛋白經(jīng)硫酸脫酰胺化處理之后其在酸性條件下的溶解性提高了近5倍[26]。

注:1為Alcalase 2.4 L;2為Alcalase 2.4 L+脫酰胺;3為Alcalase 2.4 L+ProteAXH;4為Alcalase2.4 L+ProteAXH+脫酰胺。圖3 酸法脫酰胺處理對(duì)花生肽鈣結(jié)合能力的影響

2.3 脫酰胺花生肽鈣螯合工藝的優(yōu)化

本研究采用單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)脫酰胺花生肽的鈣螯合工藝進(jìn)行了優(yōu)化。由圖4可知,在pH 3.0時(shí)多肽的鈣螯合能力最弱,為109.79 mg/g,在pH 4.0時(shí)顯著增至116.40 mg/g,但與pH 5.0～7.0時(shí)相比無(wú)顯著差異,在pH 8.0時(shí)則進(jìn)一步顯著增加至131.43 mg/g。這可能是由于花生肽的pKa值在pH 3.0左右,在此pH值下,部分羧基處于未解離狀態(tài),因此不能與鈣離子結(jié)合或只能以配位鍵的形式與鈣結(jié)合;當(dāng)pH大于3.0時(shí),多肽中的羧基處于解離狀態(tài),因此能夠充分參與鈣離子的結(jié)合;當(dāng)pH值進(jìn)一步提高時(shí),鈣離子的溶解性有所降低,化學(xué)反應(yīng)平衡向著肽鈣螯合物的方向偏移,導(dǎo)致多肽的鈣結(jié)合能力進(jìn)一步提升。這與豬骨膠原肽[16]和核桃肽[26]與鈣的結(jié)合行為類似,即堿性環(huán)境有利于螯合物的形成。

圖4 不同因素對(duì)脫酰胺花生肽鈣結(jié)合能力的影響

脫酰胺花生肽與鈣離子結(jié)合的最適溫度為50 ℃,隨著溫度的進(jìn)一步升高或降低,多肽的鈣結(jié)合能力均有所降低,這一溫度與豬骨膠原蛋白肽與鈣的結(jié)合行為相同[17]。這是由于溫度升高加速了分子的遷移,從而使得多肽與鈣離子的結(jié)合速度加快;但是當(dāng)溫度進(jìn)一步升高時(shí),多肽的結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化導(dǎo)致結(jié)合能力降低,同時(shí)溫度過(guò)高也會(huì)加速螯合物的解離,進(jìn)而導(dǎo)致多肽的結(jié)合能力下降。

脫酰胺花生肽與鈣離子結(jié)合的最適時(shí)間為80 min,當(dāng)反應(yīng)時(shí)間進(jìn)一步延長(zhǎng)時(shí)結(jié)合能力略有下降,這與豬骨膠原肽與鈣的結(jié)合行為類似,但后者的最適結(jié)合時(shí)間為40 min[17],表明花生肽與鈣離子的結(jié)合過(guò)程是一個(gè)相對(duì)比較緩慢的過(guò)程。從圖4可知,隨著肽鈣質(zhì)量比的增大,鈣結(jié)合能力呈先增大后減小的趨勢(shì),在2∶1時(shí)達(dá)到最大值,表明在此比例下兩者達(dá)到了平衡。

脫酰胺花生肽與鈣離子結(jié)合的最適條件為在pH 8.0和50 ℃下按照2∶1的質(zhì)量比反應(yīng)80 min,此時(shí)脫酰胺花生肽的鈣結(jié)合能力達(dá)到了132.04 mg/g,與袁興宇等[23]用谷氨酰胺酶對(duì)花生蛋白的蛋白酶M水解物進(jìn)行脫酰胺處理后的水解物的鈣結(jié)合能力接近(135.26 mg/g)。

2.4 脫酰胺花生肽的富集

Yuan等[9]通過(guò)超濾法對(duì)花生蛋白的蛋白酶M單酶水解物進(jìn)行精制,得到了鈣結(jié)合能力為(124.70±0.80)mg/g的級(jí)分。為了進(jìn)一步提高花生肽的鈣結(jié)合能力,本實(shí)驗(yàn)采用大孔樹(shù)脂吸附的方式對(duì)其富集。在這種方法中,既可以通過(guò)吸附目標(biāo)多肽然后再洗脫收集的方式得到高活性組分,也可以通過(guò)吸附除去低活性多肽的方式得到高活性組分,其中后者更加簡(jiǎn)單可行,因此本實(shí)驗(yàn)采用第2種策略對(duì)花生肽進(jìn)行了富集,共選用了5種不同極性的大孔吸附樹(shù)脂,包括非極性的D101和XAD-2、弱極性的AB-8、中極性的DM301和強(qiáng)極性的ADS-7,以及2種離子交換樹(shù)脂,包括強(qiáng)堿性陰離子交換樹(shù)脂IRA900CI和弱酸性強(qiáng)離子交換樹(shù)脂IRC76RCF,進(jìn)行了測(cè)試。

2.4.1 樹(shù)脂的篩選

從圖5中可以看出,大孔樹(shù)脂種類對(duì)吸附液中剩余多肽的鈣結(jié)合能力有重要影響,總體而言,經(jīng)中等極性和強(qiáng)極性樹(shù)脂吸附后剩余多肽的鈣結(jié)合能力最強(qiáng)、多肽的損失率也最低,其中DM301吸附后剩余多肽的鈣結(jié)合能力最高,達(dá)到157.49 mg/g,多肽損失率20.00%;經(jīng)弱極性樹(shù)脂AB-8吸附時(shí)多肽的損失率最大,剩余多肽的鈣結(jié)合能力最弱。離子交換樹(shù)脂類型對(duì)剩余多肽的鈣結(jié)合能力也有重要影響,其中經(jīng)陰離子交換樹(shù)脂吸附后剩余多肽的鈣結(jié)合能力要顯著高于陽(yáng)離子交換樹(shù)脂,但是仍略低于DM301的吸附液。結(jié)果表明,疏水性較強(qiáng)且攜帶正電荷的多肽似乎更加有利于其結(jié)合鈣離子,采用極性樹(shù)脂或陰離子交換樹(shù)脂是除去水解液中低鈣結(jié)合能力組分的有效手段。

注:1為對(duì)照組;2為D101;3為XAD-2;4為ADS-7;5為AB-8;6為DM301;7為IRA900C1;8為IRC76RCF。 圖5 樹(shù)脂種類對(duì)脫酰胺花生肽鈣結(jié)合能力及多肽損失率的影響

目前關(guān)于鈣螯合肽構(gòu)效關(guān)系的研究較少,現(xiàn)有文獻(xiàn)表明多肽的分子質(zhì)量及其攜帶基團(tuán)如羧基、磷酸基等的數(shù)量對(duì)其鈣結(jié)合能力有一定的影響[28],但是關(guān)于多肽極性及荷電特性的影響鮮見(jiàn)報(bào)道。由于DM301對(duì)水解液中低鈣結(jié)合能力組分的吸附能力最強(qiáng)、造成的多肽損失率較小,因此對(duì)其吸附條件進(jìn)行了進(jìn)一步優(yōu)化。

2.4.2 花生鈣螯合肽富集條件優(yōu)化

圖6為pH值、溫度、時(shí)間及質(zhì)量比對(duì)脫酰胺花生肽鈣結(jié)合能力的影響,當(dāng)pH值為2.0時(shí)鈣結(jié)合能力最強(qiáng);當(dāng)吸附溫度為30 ℃時(shí)吸附液中多肽的鈣結(jié)合能力最強(qiáng),這與極性樹(shù)脂的吸附特性較為一致;當(dāng)吸附時(shí)間為12 h時(shí)樹(shù)脂的吸附達(dá)到完全,進(jìn)一步延長(zhǎng)吸附時(shí)間不能繼續(xù)提高多肽的鈣結(jié)合能力;當(dāng)樹(shù)脂與多肽的質(zhì)量比為10∶1時(shí),水解液的鈣結(jié)合能力趨于穩(wěn)定,為162.08 mg/g。

圖6 不同因素對(duì)DM301大孔吸附樹(shù)脂富集脫酰胺花生肽鈣結(jié)合能力的影響

因此,圖6表明,利用DM301富集脫酰胺花生肽的最佳條件為pH2.0、溫度30 ℃、吸附時(shí)間12 h、樹(shù)脂與多肽質(zhì)量比10∶1,在此條件下,吸附液中多肽的鈣結(jié)合能力達(dá)到了164.34 mg/g,與未富集前的132.04 mg/g相比增加了24.46%。該結(jié)合能力顯著高于Yuan等[9]通過(guò)超濾富集得到的花生肽的(124.70 ± 0.80)mg/g,多肽的回收率也較高,表明本研究的雙酶水解結(jié)合酸法脫酰胺及DM301樹(shù)脂富集是從花生蛋白高效制備高活性鈣螯合肽的有效方法。同時(shí),本研究所得的多肽的鈣結(jié)合能力也遠(yuǎn)高于葵花籽蛋白肽的83.50 mg/g[15]、大豆蛋白肽的53.03 mg/g[29]以及乳清蛋白肽的67.81 mg/g[30],表明花生肽是一種活力非常強(qiáng)的鈣螯合劑。

2.5 脫酰胺花生肽及其鈣螯合物的表征

2.5.1 熒光光譜分析

圖7為不同濃度的CaCl2(5～25 μmol/L)分別與 0.2 mg/mL 的脫酰胺花生肽溶液混合后的熒光光譜圖。可以看出,隨著 CaCl2濃度的增加,355 nm處的發(fā)射峰強(qiáng)度減弱,這是因?yàn)殁}離子的引入使花生肽的內(nèi)源熒光發(fā)生淬滅。熒光強(qiáng)度降低是多肽螯合鈣離子時(shí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化的一個(gè)典型特征[31],在乳清蛋白[32]及鴨蛋白肽[33]與鈣離子結(jié)合時(shí)也觀察到了類似的現(xiàn)象,證實(shí)了花生肽與鈣離子與發(fā)生了螯合作用。

圖7 脫酰胺花生肽及其鈣螯合物的熒光光譜圖

2.5.2 圓二色譜分析

由圖8及表2可知,脫酰胺花生肽的α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為13.6%、15.4%、21.5%和49.5%;與Ca2+螯合后,其α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角的含量無(wú)明顯變化,但是β-折疊的質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加至32.3%,而無(wú)規(guī)則卷曲質(zhì)量分?jǐn)?shù)降至29.4%,表明花生肽由原先的無(wú)序結(jié)構(gòu)向更加有序、致密的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變。這一現(xiàn)象與Zhang等[34]的觀察一致,即鱈魚(yú)多肽與Ca2+螯合后其松散的二級(jí)結(jié)構(gòu)變得規(guī)則、有序且緊密,進(jìn)一步證實(shí)了花生肽與鈣離子形成了螯合物。

圖8 脫酰胺花生肽及其鈣螯合物的圓二色光譜圖

表2 脫酰胺花生肽及其鈣螯合物的二級(jí)結(jié)構(gòu)質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%

2.5.3 傅里葉紅外光譜分析

圖9 脫酰胺花生肽及其鈣螯合物的傅里葉紅外光譜圖

2.5.4 粒徑、電勢(shì)分析

如圖10所示,與鈣離子螯合后,花生肽的ζ電位從-38.1 mV 變?yōu)?10.5 mV,表明Ca2+與花生蛋白肽中帶負(fù)電荷的羧基發(fā)生了螯合,這與圖9的結(jié)果一致,這一現(xiàn)象和大豆蛋白肽與鈣離子結(jié)合后電勢(shì)的變化趨勢(shì)一致[29];另外,與鈣離子結(jié)合后,花生肽的粒徑由244 nm急劇增加至831 nm,這可能是由于鈣離子屏蔽了多肽鏈上的負(fù)電荷,降低了多肽鏈之間的靜電斥力,并通過(guò)形成鹽橋促進(jìn)了多肽的聚集所致[36]。Fang等[27]研究核桃多肽與鈣離子的結(jié)合行為時(shí),也發(fā)現(xiàn)了添加鈣離子會(huì)促進(jìn)核桃多肽發(fā)生凝聚現(xiàn)象從而導(dǎo)致粒徑增大。

圖10 脫酰胺花生肽及其鈣螯合物的粒徑與ζ電位

3 結(jié)論

采用Alcalase 2.4 L堿性蛋白酶和ProteAXH肽酶復(fù)合水解結(jié)合酸法脫酰胺和DM301大孔樹(shù)脂吸附得到了鈣結(jié)合能力達(dá)到164.34 mg/g的花生肽,該工藝的多肽總回收率達(dá)到72%。紅外光譜分析表明,花生蛋白肽主要通過(guò)其羧基與鈣離子發(fā)生結(jié)合作用。本實(shí)驗(yàn)所得花生蛋白肽的鈣結(jié)合能力較高,同時(shí)制備工藝較為簡(jiǎn)單、蛋白質(zhì)回收率高,因此具有較好的工業(yè)化生產(chǎn)價(jià)值,這對(duì)于提升花生蛋白的綜合利用具有重要意義。在后續(xù)的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用中,還需要對(duì)生產(chǎn)工藝進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化如適當(dāng)提高酶解溫度或加酶量以縮短酶解反應(yīng)時(shí)間,并對(duì)被吸附多肽的洗脫工藝和功能性質(zhì)進(jìn)行系統(tǒng)研究,有利于花生多肽綜合利用和降低生產(chǎn)成本。