王 瑩,張 明,王紅月,李湘奇

(1山東第一醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院·山東 泰安 271000;2泰安市中心醫(yī)院·山東 泰安 271000)

乳腺癌的發(fā)病率逐年攀升,目前已經(jīng)躍居女性惡性腫瘤的首位[1]。乳腺癌如能早期診斷, 早期治療,可提高病人的生存獲益,并有效改善病人的生存質(zhì)量。乳腺的癌前病變,是乳腺浸潤性癌癌變過程中的一個階段,是乳腺組織從量變到質(zhì)變的過程,在轉(zhuǎn)化成乳腺癌之前,經(jīng)過干預(yù)可逆轉(zhuǎn)乳腺癌的進(jìn)程。復(fù)方中藥疏肝健脾顆粒是本院科研處方,又名乳康飲,具有疏肝理氣、益氣健脾、化瘀散結(jié)的功效,已廣泛應(yīng)用于乳腺癌的臨床輔助治療[2]。前期研究發(fā)現(xiàn),其含藥血清作用于乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞,對Hippo信號通路蛋白YAP、TAZ的表達(dá)有抑制作用,對YAP、TAZ的磷酸化有促進(jìn)作用,并阻礙了YAP蛋白在細(xì)胞核內(nèi)的聚集,通過下調(diào)其下游與細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)靶基因的表達(dá),誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡[3];但對乳腺癌癌前病變是否有抑制作用,有待于進(jìn)一步研究。本研究選用雌孕激素與二甲基苯蒽(DMBA)聯(lián)合誘發(fā)大鼠乳腺組織的癌前病變,同時給予不同劑量的疏肝健脾顆粒進(jìn)行干預(yù),免疫組化法檢測乳腺癌前病變組織Fas、FasL蛋白表達(dá),初步探討疏肝健脾顆粒對模型大鼠乳腺組織癌前病變的作用。

1 材料

1.1 實驗動物 雌性SD大鼠90只,SPF級, 6～8 周齡,健康未育,體質(zhì)量180～220 g,動物許可證號：SYXK(魯)2012-0005,購于濟(jì)南朋悅實驗動物繁育有限公司。常規(guī)飼養(yǎng)1 周以適應(yīng)環(huán)境。飼養(yǎng)條件：室內(nèi)溫度18～26 ℃,相對濕度42%～70%,通風(fēng)換氣良好。

1.2 實驗藥物 疏肝健脾顆粒劑由黃芪、茯苓、柴胡、青皮、薏苡仁、莪術(shù)組成,由北京康仁堂藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的單味藥顆?；旌隙?購自山東第一醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院中藥房,按照處方比例,溶于100 mL生理鹽水,然后根據(jù)實驗要求配成1.8 g/mL生藥備用。枸櫞酸他莫昔芬片(三苯氧胺)：江蘇揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司,國藥準(zhǔn)字H32021472,實驗時按10 mg∶50 mL溶于生理鹽水。

1.3 試劑及儀器 Fas/CD95/Apo-1(RAB-0022)兔抗人多克隆抗體、Fas-L(RAB-0199)兔抗人多克隆抗體、S-P免疫組化試劑盒：福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司;鏈霉卵白素-過氧化物酶試劑盒(SP-9001)、DAB顯色濃縮型試劑盒：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;DMBA(9,10-二甲基-1,2苯并蒽)：Sigma公司,產(chǎn)品號：D8480-100,按比例溶于植物油,DMBA終濃度為10 g/L備用;苯甲酸雌二醇：上海通用藥業(yè)股份有限公司,國藥準(zhǔn)字H31021114;黃體酮注射液：天津金耀氨基酸有限公司,國藥準(zhǔn)字H12020533;脫毛膏：廣州賽因化妝品有限公司,TP0120648。CM1900型冰凍切片機(jī)、EG1150C包埋機(jī)：德國LEICA公司; 日本三豐數(shù)顯500-171游標(biāo)卡尺;BH-2 OLYMPUS照像顯微鏡;HPIAS-1000彩色病理圖文分析系統(tǒng)：同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)開發(fā);JA5003X型電子精密天平：上海方瑞儀器有限公司。

2 方法

2.1 動物分組、造模、給藥 SD大鼠90只按照抽簽法隨機(jī)分為6 組,每組15只,正常對照組：生理鹽水一次性灌胃1 mL,第2 天開始,30 d為1個周期(肌肉注射生理鹽水0.5 mL/只,連續(xù)25 d,觀察5 d,共2個周期。其余75只大鼠參照文獻(xiàn)[4]方法稍加修改進(jìn)行造模,將DMBA 10 mg一次性灌胃后,第2天起,5 d為1個周期(第1～3 天,苯甲酸雌二醇0.5 mg/kg后肢肌肉注射,1次/天;第4 天,黃體酮4 mg/kg后肢肌肉注射)連續(xù)12個周期;DMBA灌胃24 h后隨機(jī)分為5組,每組15只。①模型組：造模的同時腹腔注射生理鹽水1 mL/100g;②疏肝健脾低劑量組(簡稱低劑量組)：疏肝健脾顆粒18 g/(kg·d)灌胃;③疏肝健脾中劑量組(簡稱中劑量組)：疏肝健脾顆粒45 g/(kg·d)灌胃;④疏肝健脾高劑量組(簡稱高劑量組)： 疏肝健脾顆粒90 g/(kg·d)灌胃;⑤三苯氧胺組：三苯氧胺0.5 mL/100 g灌胃。實驗藥物灌胃劑量按《抗癌藥物研究與實驗技術(shù)》[5]換算人鼠等效灌胃劑量,以上各組大鼠造模及給藥60 d,均常規(guī)飼養(yǎng)。

大鼠在DMBA灌胃5 d后,每組均有部分出現(xiàn)程度不等的腹瀉、死亡情況,第6周后逐漸趨于平穩(wěn),至實驗結(jié)束時各組剩余動物數(shù)量,正常對照組15只、模型組13只、疏肝健脾低劑量組12只、疏肝健脾中劑量組12只、疏肝健脾高劑量組10只、三苯氧胺組11只。

2.2 觀察指標(biāo)及檢測方法

2.2.1 癌前病變?nèi)橄俳M織病理學(xué)觀察 末次給藥后,禁食不禁水12 h,以脫毛劑去除大鼠胸部鼠毛,3%水合氯醛經(jīng)腹腔注射麻醉,取大鼠胸腹部第3、4對完整乳腺組織,10%福爾馬林固定后石蠟包埋,切片厚度4 μm,HE染色,光學(xué)顯微鏡下觀察。HE染色根據(jù)2012年版WHO乳腺腫瘤組織學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)[5-6]分為：正常乳腺、普通乳腺增生、癌前病變、浸潤癌。

2.2.2 癌前病變?nèi)橄俳M織Fas、Fas-L蛋白表達(dá)的免疫組化檢測 免疫組化S-P法檢測,步驟按說明書進(jìn)行。用邁新公司提供的Fas/Fas-L陽性組織片作為陽性對照,用PBS代替一抗為陰性對照。Fas、FasL陽性強(qiáng)度判斷采用半定量法,參照文獻(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)[7],蛋白陽性染色均為胞漿、胞膜出現(xiàn)棕黃棕褐色均勻顆粒。切片組織中(-)為陽性細(xì)胞≤5%,(+)為陽性細(xì)胞6%～25%,(++)為陽性細(xì)胞達(dá)26%～50%,(+++)為陽性細(xì)胞>50%。

2.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0 版統(tǒng)計軟件分析,計數(shù)資料用χ2檢驗,P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 疏肝健脾顆粒對模型大鼠乳腺組織病理變化的影響 模型組大鼠乳腺癌癌前病變發(fā)生率為69.2%,疏肝健脾顆粒各劑量組及三苯氧胺組的癌前病變發(fā)生率均低于模型組(P<0.01),疏肝健脾顆粒高劑量組和三苯氧胺組亦低于疏肝健脾顆粒低劑量組(P<0.05),與疏肝健脾顆粒中劑量組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。部分大鼠乳腺組織發(fā)生浸潤癌,主要在模型組和疏肝健脾中、低劑量組,疏肝健脾高劑量組和三苯氧胺組大鼠乳腺組織未見浸潤癌發(fā)生。結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠乳腺組織病理變化比較[個(%)]

3.2 疏肝健脾顆粒對模型大鼠乳腺組織Fas、FasL表達(dá)的影響 正常對照組大鼠乳腺組織Fas蛋白呈高表達(dá),模型組Fas蛋白表達(dá)減弱,疏肝健脾顆粒各劑量和三苯氧胺組Fas表達(dá)均較模型組增強(qiáng)(P<0.01),低劑量組作用較弱,與三苯氧胺比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。模型組大鼠乳腺組織FasL蛋白表達(dá)較正常組升高,疏肝健脾顆粒各劑量和三苯氧胺組均能夠降低FasL蛋白的表達(dá),與模型組比較,差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01),與三苯氧胺組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見圖1～圖2,表2。

圖1 各組大鼠乳腺組織Fas蛋白表達(dá)的免疫組化檢測結(jié)果(×400)

圖2 各組大鼠乳腺組織FasL蛋白表達(dá)的免疫組化檢測結(jié)果(×400)

表2 各組大鼠乳腺組織Fas、FasL表達(dá)的比較(個)

4 討論

關(guān)于乳腺癌的癌前病變的界定,至今尚無統(tǒng)一的認(rèn)識。普遍認(rèn)為癌前期病變是指形成于惡性腫瘤之前,形態(tài)學(xué)出現(xiàn)不典型增生,或原位癌階段,而組織尚不具備特征性的惡性改變或某些較容易發(fā)展成為癌的病變。乳腺癌癌前病變是介于乳腺增生向乳腺癌發(fā)展的過渡中間環(huán)節(jié),病理變化有其特殊性,但乳腺癌癌前病變經(jīng)過治療尚可以阻斷和逆轉(zhuǎn)其進(jìn)一步的發(fā)展。目前尚無特異性的方法和藥物治療乳腺癌癌前病變,手術(shù)治療亦無明確的針對性,中醫(yī)藥治療能夠獲得一定的療效,因此積極尋求中醫(yī)藥干預(yù)治療乳腺癌癌前病變的藥物和方劑,對于乳腺癌的二級預(yù)防,降低乳腺癌的發(fā)生率,具有重要意義。

本病在中醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)中無明確的概念,但在《瘍科心得集》中有 “有乳中結(jié)核.形如丸卵,不疼痛,不發(fā)寒熱,皮色不變,其核隨喜怒而消長,從名乳癖”的描述,可與之對應(yīng)。另一病癥“乳巖”與“乳癖”亦有密切的關(guān)聯(lián),所以可歸屬于“乳癖”與“乳巖”的過渡階段,即經(jīng)過“量變”到“質(zhì)變”的過程[8]。中醫(yī)理論認(rèn)為,乳癖病機(jī)多為肝失疏泄,乘脾克胃,氣血運(yùn)行不暢,郁久化熱,灼津為痰,或沖任失調(diào)使氣血瘀滯,痰濕內(nèi)生,聚結(jié)于乳絡(luò)而成?！夺t(yī)宗金鑒》曰：“乳中結(jié)核梅李形……癥由肝脾郁結(jié)成”。乳癖發(fā)展為乳巖更多與情志因素有關(guān),與肝脾關(guān)系密切?！锻庾C醫(yī)案匯編》云：“少陽行經(jīng)之地,氣血皆薄,加以情懷失暢,氣血痹郁,故難治,日久恐成巖證”。這些論述提示其病因病機(jī)為情志失調(diào),肝氣郁結(jié),乘克脾土,致使肝郁脾滯,脾失健運(yùn),聚濕成痰,痰瘀互結(jié)加速乳癖向乳巖轉(zhuǎn)變。因此,乳腺癌癌前病變的治療宜從肝脾論治,疏肝健脾為基本治則,輔以化痰散瘀,可庶免乳巖之變。

疏肝健脾顆粒方中柴胡、青皮疏肝理氣,黃芪、茯苓益氣健脾,莪術(shù)、薏苡仁化痰散瘀。全方及拆方研究對三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞、人乳腺癌MDA-MB-435S細(xì)胞有明顯的增殖抑制效應(yīng),而且能夠誘導(dǎo)凋亡;含藥血清能夠顯著抑制MDA-MB-231細(xì)胞的遷移和侵襲能力[9-10]。動物移植瘤模型研究表明乳康飲對裸鼠乳腺原位移植瘤的生長和淋巴轉(zhuǎn)移有顯著的抑制作用,其作用機(jī)制為抑制乳腺癌組織VEGF-C/D、VEGFR-3 mRNA水平的表達(dá)和Ang-2 蛋白及mRNA水平表達(dá),干擾 Ang-2/Tie2 信號通路,阻斷VEGF-C、D/VEGFR-3信號通路的傳導(dǎo),阻礙乳腺癌組織的淋巴管生成,從而控制淋巴轉(zhuǎn)移[11-12];而且只對PI3K/AKT通路中 PI3K、AKT 的表達(dá)起抑制作用,在促進(jìn)上游 PTEN、SHIP 表達(dá)的同時,調(diào)控PI3K/AKT通路信號傳導(dǎo),抑乳腺癌的發(fā)生發(fā)展[13]。以上研究均集中在乳腺癌的研究,對于乳腺增生以及癌前病變尚未涉及。

本研究結(jié)果表明,疏肝健脾顆粒能夠阻斷DMBA誘導(dǎo)的大鼠乳腺癌癌前病變過程,表現(xiàn)為隨著疏肝健脾顆粒劑量的增加,癌前病變和導(dǎo)管內(nèi)癌的發(fā)生率逐漸降低,且與雌激素受體拮抗劑三苯氧胺作用相近。

Fas/FasL信號通路在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。Fas是死亡受體,表達(dá)于細(xì)胞表面,是細(xì)胞凋亡的主要信號通路因子,其天然配體FasL是腫瘤壞死因子家族中的Ⅱ 型跨膜蛋白,在激活的T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞以及免疫赦免組織均有表達(dá),生理條件下FasL與Fas結(jié)合后,可導(dǎo)致表達(dá)Fas的細(xì)胞凋亡[14]。許多惡性腫瘤組織中,包括乳腺癌組織均存在Fas表達(dá)的下調(diào),相反FasL表達(dá)上調(diào),因此由于腫瘤細(xì)胞表面Fas蛋白表達(dá)的缺失,導(dǎo)致了細(xì)胞凋亡受阻成為惡性腫瘤發(fā)生和發(fā)展的根源[15]。劉曉紅等[16]通過研究發(fā)現(xiàn)Fas的表達(dá)情況,在不同的乳腺組織中有一定規(guī)律,正常乳腺組織中高于乳腺腺瘤和乳腺不典型增生,而乳腺癌組織中的表達(dá)最低; FasL的表達(dá)規(guī)律卻相反,正常的乳腺組織中最低甚至不表達(dá),乳腺腺瘤和乳腺不典型增生中有部分表達(dá),而乳腺癌組織表達(dá)最高,因此推測乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展等過程與細(xì)胞凋亡異常有密切關(guān)系。乳腺增生到乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程,最大可能的是以乳腺不典型增生為界限的細(xì)胞凋亡過程,增生至不典型增生的乳腺組織Fas的表達(dá)逐漸減少,而FasL的表達(dá)逐漸增加,細(xì)胞凋亡相對比較活躍,機(jī)體啟動了細(xì)胞的凋亡機(jī)制,淘汰或清除過度增生的細(xì)胞和具有惡變傾向的細(xì)胞,從而盡可能地抑制乳腺組織過度增生而遏制其惡變的發(fā)生。

本文免疫組化結(jié)果顯示,Fas蛋白表達(dá)在正常對照組大鼠乳腺組織中較高,在模型組表達(dá)較低,疏肝健脾顆粒有提升Fas表達(dá)的作用,與三苯氧胺組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);FasL蛋白表達(dá)與Fas相反,在模型組乳腺組織有較高表達(dá),疏肝健脾顆粒各劑量組均能夠降低FasL蛋白的表達(dá),與三苯氧胺組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05);且隨著疏肝健脾顆粒劑量的增加,對Fas、FasL的作用增強(qiáng)。由此推知,疏肝健脾顆粒通過干預(yù)乳腺組織Fas、FasL的表達(dá),在大鼠乳腺癌癌前病變過程中,Fas/FasL通路啟動了細(xì)胞凋亡機(jī)制,促進(jìn)了乳腺組織細(xì)胞的凋亡,從有效地阻止乳腺組織的過度增生及癌變過程。