鄭 恬,周 柯,周 磊,楊玉琪,陳 瀟,白 露,劉家云

(空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科,陜西 西安 710032)

環(huán)境污染可導(dǎo)致高達(dá)20%的醫(yī)院獲得性感染[1-2]。越來越多的研究[3-5]表明,醫(yī)院環(huán)境、醫(yī)療設(shè)施是醫(yī)院感染病原體的主要來源和重要傳播媒介。鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacterbaumannii, AB)是全球醫(yī)院感染最常見的機(jī)會(huì)性多重耐藥病原菌之一,對(duì)公共衛(wèi)生及健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅[6-7]。AB在臨床中難以消盡,并存在反復(fù)感染暴發(fā)的風(fēng)險(xiǎn),且目前尚未研發(fā)出有效的新型抗菌藥物[8]。改變AB感染的臨床現(xiàn)狀,需探索科學(xué)的環(huán)境微生物篩查方法,快速準(zhǔn)確地找出源頭,控制耐藥性傳播,避免醫(yī)院感染暴發(fā)。近年來,基質(zhì)輔助激光解析電離飛行質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)在銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌等微生物研究方面的應(yīng)用較為廣泛,但鮮有涉及AB同源性分析相關(guān)應(yīng)用的報(bào)道[9-12]。

本研究使用MALDI-TOF MS技術(shù),對(duì)某院2020年5月—2021年2月神經(jīng)內(nèi)科重癥監(jiān)護(hù)病房(ICU)患者和環(huán)境中分離的46株AB進(jìn)行同源性分析,探討其在醫(yī)院內(nèi)的水平傳播路徑,采用多位點(diǎn)序列分型(multilocus sequece typing, MLST)方法進(jìn)行比對(duì)、驗(yàn)證,評(píng)估MALDI-TOF MS對(duì)AB同源性分析的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 剔除同一患者或環(huán)境多次送檢樣本中的重復(fù)菌株,收集某三甲綜合醫(yī)院2020年5月—2021年2月神經(jīng)內(nèi)科ICU患者痰標(biāo)本和環(huán)境標(biāo)本分離的46株AB,其中,40株分離自患者氣管插管/氣管切開吸痰標(biāo)本,6株分離自環(huán)境標(biāo)本。

1.2 儀器與試劑 VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)、GN革蘭陰性菌鑒定卡片、VITEK-MS質(zhì)譜儀、CHCA基質(zhì)液及配套靶板(法國Bio-merieux公司);Beckman DU800核酸蛋白分析儀(美國Beckman公司);QIAamp DNA純化試劑盒(德國Qiagen公司);凝膠電泳系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司);ABI 2720聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增儀(美國ABI公司);Mueller-Hinton培養(yǎng)基(中國北京奧博星公司);電泳成像系統(tǒng)(中國上海復(fù)日公司)及PCR反應(yīng)試劑(中國上海生工公司)。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)及鑒定 嚴(yán)格按照《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》[13]操作步驟對(duì)患者和環(huán)境標(biāo)本進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)、分離,采用全自動(dòng)細(xì)菌鑒定分析儀VITEK 2 Compact/VITEK-MS對(duì)分離菌株進(jìn)行最終鑒定。

1.3.2 MALDI-TOF MS同源性分析 挑取新鮮單一菌落,采用直涂法[14],涂布至靶板標(biāo)本孔上,精確滴加1 μL CHCA基質(zhì)液覆蓋于靶孔,晾干后靶板上機(jī),運(yùn)行MALDI-TOF MS RUO系統(tǒng)。檢測(cè)完畢后,將目標(biāo)菌株圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入VITEK-MS SARAMIS Premium軟件圖形數(shù)據(jù)庫進(jìn)行聚類分析,繪制聚類樹圖,以同一菌種不同菌株間相似度≥65%為同源菌株的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)聚類樹進(jìn)行質(zhì)譜分型[15],以MS-a、MS-b、MS-c、MS-d、MS-e和MS-f表示不同型別。

1.3.3 MLST同源性分析 經(jīng)細(xì)菌DNA提取、PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物測(cè)序后,于MLST數(shù)據(jù)庫(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi?PROGR-AM=tblastn&PAGE_TYPE=BlastSearch &LI-NK_LOC=blasthome)比對(duì)分析,獲得gltA、gyrB、gdhB、recA、cpn60、gpi和rpoD 7個(gè)等位基因?qū)?yīng)的編號(hào),從而確定每株菌株的序列分型(sequence type, ST)。管家基因引物序列和片段長(zhǎng)度見表1。運(yùn)行BioNumerics 8.0軟件,導(dǎo)入含7個(gè)等位基因編號(hào)陣列的profile文件,經(jīng)功能模塊UPGMA及Categorical分析計(jì)算,分別生成聚類樹和最小生成樹。

表1 AB MLST各管家基因引物序列及片段長(zhǎng)度Table 1 Primer sequences and fragment lengths of house-keeping genes of AB MLST

2 結(jié)果

2.1 MLST序列分型 經(jīng)MLST數(shù)據(jù)庫檢索、比對(duì),46株AB為12個(gè)ST型別:ST195、ST208、ST540、ST369、ST136、ST436、ST1893、ST381、ST469、ST938、ST1821和新型STN1。ST208、ST540、ST369、ST136、ST436與ST195間僅管家基因gpi不同;ST1893與ST195為管家基因recA的差異;ST381、ST469和ST938三個(gè)型別間存在gpi和gyrB 2個(gè)管家基因不同;ST1821、STN1與其他ST型別分別存在6、7個(gè)管家基因的差異。46株AB的ST型別及構(gòu)成比見表2。

表2 46株AB ST型別分布情況Table 2 ST genotype distribution of 46 AB strains

2.2 MLST同源性分析結(jié)果

2.2.1 MLST聚類樹 ST195、ST208、ST540、ST369、ST136、ST436基因高度同源,相似度約為85%;ST1893與ST195相似度為75%～85%;ST381、ST469和ST938相似度約為70%;ST1821、STN1與其他ST型別間相似度均<15%。46株AB聚類分析結(jié)果見圖1。

圖1 46株AB MLST聚類樹Figure 1 Clustering tree of 46 AB strains by MLST

依據(jù)MLST最小生成樹的基因位點(diǎn)差異數(shù)量相同、親緣相近原則,將46株AB的MLST聚類分為MT-A、B、C、D四個(gè)簇群。MT-A簇27株(58.70%),包括9株ST195,3株ST208,4株ST540,8株ST369,ST136、ST436及ST1893各1株;MT-B簇17株(36.96%),包括5株ST381,11株ST469和1株ST938;MT-C、D簇各1株(2.17%),分別為ST1821、STN1。

2.2.2 MLST最小生成樹 由軟件BioNumerics 8.0繪制,見圖2。圓形數(shù)量表示ST個(gè)數(shù),圓形面積大小及其分割份數(shù)表示菌株數(shù)量,圓形連線上的數(shù)字表示相鄰ST型別間的位點(diǎn)變化數(shù)量。結(jié)果顯示,ST195為46株AB所有ST的共同鼻祖,與ST208、ST540、ST369、ST136、ST436和ST1893均只有1個(gè)基因位點(diǎn)差異,親緣關(guān)系較近;與ST381、ST469和ST938均有2個(gè)基因位點(diǎn)差異;而與ST1821和STN1分別存在6和12個(gè)位點(diǎn)差異,且ST1821與STN1兩者之間亦有6個(gè)不同基因位點(diǎn)變化,親緣關(guān)系差。

圖2 46株AB MLST最小生成樹Figure 2 Minimum spanning tree of 46 AB strains by MLST

2.3 MALDI-TOF MS同源性分析結(jié)果 46株醫(yī)院感染AB菌株的質(zhì)譜數(shù)據(jù)經(jīng)VITEK-MS SARAMIS Premium軟件的相似性分型功能聚類分析生成聚類樹圖,見圖3。質(zhì)譜分型顯示,46株AB分成MS-a、b、c、d、e和f六個(gè)質(zhì)譜型別,最多者為MS-a型,共39株(84.78%),MS-c、e型各2株(4.35%),MS-b、d、f型各1株(各2.17%),見表3。

圖3 46株AB MALDI-TOF MS聚類樹Figure 3 Clustering tree of 46 AB strains by MALDI-TOF MS

表3 MALDI-TOF MS與MLST分析AB菌株同源性結(jié)果對(duì)比Table 3 Comparison of AB homology results between MALDI-TOF MS and MLST analyses

2.4 MALDI-TOF MS與MLST分析AB菌株同源性結(jié)果 對(duì)比MALDI-TOF MS鑒定的39株MS-a型中,22株為MT-A簇,包括ST208型3株,ST540型3株(3/4),ST195型8株(8/9),ST369型5株(5/8)及ST136、ST436、ST1893型各1株;16株為MT-B簇,包括ST381型4株(4/5),ST469型11株和ST938型1株;1株為MT-C簇(ST1821)。1株MS-b型為MT-B簇的ST381;2株MS-c型為MT-A簇的ST369;1株MS-d型為MT-A簇的ST195;2株MS-e型分別為MT-A簇的ST540和ST369;1株MS-f型為MT-D簇的STN1。見表3。

3 討論

目前,脈沖場(chǎng)凝膠電泳(pulsed-field gel electrophoresis, PFGE)仍為臨床微生物同源性分析的金標(biāo)準(zhǔn)[16],其精確度高,穩(wěn)定性好,但因操作繁瑣、費(fèi)時(shí),費(fèi)用高昂,難以作為常規(guī)技術(shù)在醫(yī)院普及,普遍被MLST替代[7,12,17]。近年來MALDI-TOF MS作為新技術(shù),具有檢測(cè)快速,成本低廉的優(yōu)勢(shì),逐漸被應(yīng)用于臨床進(jìn)行常規(guī)菌株鑒定及同源性分析[18]。

本研究通過MLST同源性分析發(fā)現(xiàn),2、3、4、5、13、14、18床的患者痰標(biāo)本分離的AB菌株與病房空氣取樣的cy1號(hào)菌株為同一型別ST195,符合空氣傳播引起的醫(yī)院內(nèi)感染;從1、2、4、8、9、13、15、16、17、18床患者中分離的ST208、ST540、ST369、ST136、ST436和ST1893型別的菌株,依從最小生成樹的相同基因位點(diǎn)變化判斷,與ST195同為MT-A簇,之間的同源性>75%。2床患者還分離出ST381菌株,與從其周圍環(huán)境分離的cy2、cy3、cy4、cy5號(hào)(cy2:排痰儀管患者端;cy3:床頭柜;cy4:氣管切開處;cy5:呼吸機(jī)塔吊臺(tái)面)菌株型別一致。7床患者分離出ST469菌株,與從其床頭柜取樣的cy6號(hào)菌株型別一致,且ST381與ST469同為MT-B簇,故推測(cè)2床與7床患者周圍環(huán)境已經(jīng)發(fā)生同源AB的水平傳播。

然而,MALDI-TOF MS與MLST聚類分析結(jié)果對(duì)比顯示,同一ST型可出現(xiàn)在不同的MALDI-TOF MS型別中,如,ST195出現(xiàn)于MS-a和MS-d型(cy1號(hào)空氣采樣)中,若以此MALDI-TOF MS質(zhì)譜分型作為同源性分析結(jié)果,將否定ICU醫(yī)院感染經(jīng)空氣傳播的判斷,與臨床實(shí)際情形相悖。另一方面,同一MALDI-TOF MS型別中又可包含不同ST型,甚至不屬于同一MLST簇群。兩種方法分析的型別呈交叉分布,表明MALDI-TOF MS無法精確區(qū)分相應(yīng)的MLST簇群,難以甄別同源菌株,這可能與MALDI-TOF MS基于微生物蛋白質(zhì)的表達(dá)及其豐度進(jìn)行聚類分析的原理有關(guān)[19]。此外,臨床分離株可受抗菌藥物、感染位置、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)基等環(huán)境因素影響,或因菌體蛋白發(fā)生過表達(dá)或不表達(dá)而產(chǎn)生峰圖變化,導(dǎo)致MALDI-TOF MS聚類分析的誤差擴(kuò)大[20]。本研究中,僅新發(fā)現(xiàn)基因型STN1菌株為MS-f,與MT-D單株對(duì)應(yīng)。

盡管MALDI-TOF MS在其他微生物的同源性分析中具有一定優(yōu)勢(shì),但在AB中的應(yīng)用仍存在局限性,與當(dāng)前主流的、相媲美于PFGE的MLST方法結(jié)果一致性相差甚遠(yuǎn)[21],與相關(guān)研究[22-24]報(bào)道的結(jié)論略有出入,是否與不同儀器型號(hào)、參數(shù)設(shè)置或試驗(yàn)標(biāo)本數(shù)量多寡有關(guān),尚待進(jìn)一步研究。

綜上所述,MALDI-TOF MS作為醫(yī)院感染控制機(jī)構(gòu)對(duì)環(huán)境AB同源性分析方法具有一定的局限性,其分型結(jié)果與MLST結(jié)果不一致,分辨特異性低,目前尚無法取代MLST技術(shù)。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。