晏 慶，郭 蓁，孫賽男，黎 婧，譚機(jī)永，黎 靜

（廣西醫(yī)科大學(xué)生理教研室，廣西 南寧 530021）

在全球范圍內(nèi)心血管疾病（cardio vascular disease， CVD）是一種潛伏期較長(zhǎng)，發(fā)病較隱匿，且痊愈困難的疾病，威脅著人類(lèi)的健康。［1］。隨著我國(guó)社會(huì)逐步走向老齡化，心血管疾病占據(jù)死亡率的首位也變成了當(dāng)今社會(huì)要面臨的嚴(yán)峻問(wèn)題之一［2］。氧化應(yīng)激指細(xì)胞內(nèi)活性氧過(guò)量產(chǎn)生或抗氧化劑耗盡，活性氧通過(guò)對(duì)脂質(zhì)，DNA，蛋白質(zhì)造成損害從而破壞細(xì)胞內(nèi)的還原氧化失衡。多種心血管疾病的發(fā)生與氧化應(yīng)激相關(guān)，例如動(dòng)脈粥樣硬化，充血性心力衰竭，缺血再灌注損傷，慢性缺血性心臟病，心律失常等［3］。過(guò)氧化氫（H2O2）是活性氧中的一員，作為一種信使分子，H2O2在新陳代謝中具有調(diào)節(jié)作用，同時(shí)它也是介導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激的重要分子［4］。使用H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞建立氧化應(yīng)激模型已在實(shí)驗(yàn)中得到廣泛的應(yīng)用。

山茶油在我國(guó)被廣泛用作食用油，也被認(rèn)為是輔助藥物。山茶油具有廣泛的生物活性，如抗炎、抗腫瘤、抗高血壓，抗菌和對(duì)氧化應(yīng)激的保護(hù)作用［5］。然而，關(guān)于山茶油對(duì)心肌細(xì)胞的作用卻少有報(bào)道。本研究采用H9C2 心肌細(xì)胞細(xì)胞系建立體外模型，模擬H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷，觀察不同濃度山茶油對(duì)H2O2誘導(dǎo)的H9C2 心肌細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

H9C2 心肌細(xì)胞（普諾賽有限公司）；3%H2O2（美國(guó)Sigma 公司）；山茶油（陜西金康泰生物科技有限公司）；二甲基亞砜（DMSO）（美國(guó)Sigma 公司）；CCK8 試劑盒（新賽美生物科技有限公司）胎牛血清（美國(guó) Gibco 公司）；DMEM 高糖培養(yǎng)基（以色列 Biological Industries 公司）；胰酶（以色列 Biological Industries 公司）；PBS（索萊寶科技有限公司）；青鏈霉素（以色列 Biological Industries 公司）；細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司）；BeyoClick? EdU-594 細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司）；線(xiàn)粒體膜電位檢測(cè)試劑盒（JC-1）（碧云天生物技術(shù)有限公司）；LDH 檢測(cè)試劑盒、MDA 檢測(cè)試劑盒（索萊寶有限公司）；SOD 檢測(cè)試劑盒（南京建成有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 使用含10%胎牛血清和1%青鏈霉素的DMEM 高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)大鼠H9C2 心肌細(xì)胞，置于5%CO2、37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。定期換液，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)80%時(shí)，使用胰酶消化傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 不同濃度山茶油的制備 將10 μL 山茶油溶解于90 μL DMSO 中，得到10%濃度的山茶油；取10 μL 10%濃度的山茶油溶解于90 μL DMSO 中，得到1%濃度的山茶油；按此方式依次梯度溶解，分別得到10%，1%，0.1%，0.01%濃度的山茶油，本研究選取0.01%，0.1%，1%三個(gè)濃度的山茶油進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 細(xì)胞分組 將H9C2 細(xì)胞以每毫升4 萬(wàn)個(gè)的密度接種于六孔板，培養(yǎng)24 h 后，用1%，0.1%，0.01%三個(gè)濃度的山茶油預(yù)處理細(xì)胞24 h，然后用200 μmol/L H2O2溶液處理細(xì)胞24 h。將細(xì)胞分為：空白對(duì)照組；模型組：H2O2組；實(shí)驗(yàn)組：H2O2+0.01% 山 茶 油 組、H2O2+0.1% 山 茶 油 組、H2O2+1%山茶油組。每組設(shè)置 3 個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞活力 將對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期H9C2 細(xì)胞以每孔4×103個(gè)的密度接種于九十六孔板，正常培養(yǎng)細(xì)胞24 h 后，分別加入0、50、100、200、400 μmol/L 濃度的H2O2溶液，正常組加入完全培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，加入 10 μL CCK-8 溶液，37 ℃下繼續(xù)孵育 2 h 后，在 450 nm 波長(zhǎng)條件下檢測(cè)各孔光密度（OD）值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.3.2 β-半乳糖苷酶衰老染色實(shí)驗(yàn) 吸棄細(xì)胞培養(yǎng)液后加PBS 洗滌1 次，加入1 mL β-半乳糖苷酶染色固定液室溫固定15 min。吸棄固定液后用PBS 洗滌細(xì)胞。每孔加入1 mL β-半乳糖苷酶染色工作液，放入37 ℃無(wú)CO2的恒溫培養(yǎng)箱中孵育過(guò)夜。普通光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞染色情況，衰老細(xì)胞呈綠色，未衰老細(xì)胞不著色。結(jié)果表示為衰老染色陽(yáng)性細(xì)胞在總計(jì)數(shù)細(xì)胞中的百分比。

1.3.3 線(xiàn)粒體膜電位實(shí)驗(yàn) 吸棄細(xì)胞培養(yǎng)基，PBS洗滌一次，每孔加入1 mL 培養(yǎng)基和1 mL JC-1 染色工作液，充分混勻。37 ℃孵育20min。孵育結(jié)束后，用JC-1 染色緩沖液（1×）洗滌2 次。加入2 mL 細(xì)胞培養(yǎng)液，在熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞。 使用Image J 軟件分析線(xiàn)粒體膜電位熒光強(qiáng)度。以紅/綠熒光強(qiáng)度的比值表示細(xì)胞去極化程度，比值高低代表膜電位高低。

1.3.4 EdU 細(xì)胞增殖染色實(shí)驗(yàn) 將EdU 工作液加入細(xì)胞中，孵育2 h 完成EdU 標(biāo)記。使用Click Additive Solution 室溫避光孵育30 min，孵育結(jié)束后洗滌細(xì)胞，使用1× Hoechst 33342 溶液室溫避光孵育10 min。洗滌后在熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞。通過(guò)Image J 軟件計(jì)算細(xì)胞增殖率。

1.3.5 劃痕實(shí)驗(yàn) 吸棄細(xì)胞培養(yǎng)液，用尺子和200 μL 槍頭垂直于六孔板做劃痕，每孔劃三條等間距的豎線(xiàn)，劃完后加PBS 洗滌細(xì)胞去除細(xì)胞碎屑，加入培養(yǎng)基。用普通光學(xué)顯微鏡拍照記錄剛劃痕時(shí)和24 h 后細(xì)胞的遷移情況。同樣通過(guò)Image J 軟件計(jì)算細(xì)胞遷移率。

1.3.6 LDH、MDA、SOD 水平檢測(cè) 收集各組細(xì)胞和上清，按照 LDH、MDA、SOD 檢測(cè)試劑盒說(shuō)明分別檢測(cè)上清中LDH、SOD 水平， 細(xì)胞中MDA水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 23.0 和GraphpadPrism 8.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 H2O2氧化應(yīng)激損傷模型的建立

建立H2O2誘導(dǎo)的H9C2 細(xì)胞損傷模型，模擬氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí)對(duì)心肌細(xì)胞損傷。結(jié)果顯示，相比空白對(duì)照組，隨著H2O2濃度的增加，H9C2 細(xì)胞的存活率 下 降，200 μmol/L H2O2處 理 細(xì) 胞24 h 后，H9C2細(xì)胞活力下降至對(duì)照組的52%左右（P＜0.01），說(shuō)明此濃度既能顯著抑制H9C2 細(xì)胞的活力，又不會(huì)使細(xì)胞大量凋亡，因此后續(xù)的實(shí)驗(yàn)采用200 μmol/L的H2O2處理細(xì)胞24 h 來(lái)建立細(xì)胞損傷模型，見(jiàn)表1。

表1 不同濃度H2O2干預(yù) H9C2 心肌細(xì)胞后細(xì)胞活性比較（n=5，±s）Tab 1 Comparison of cell activity of H9C2 myocardial cells after intervention with different concentrations of H2O2（n=5，±s）

表1 不同濃度H2O2干預(yù) H9C2 心肌細(xì)胞后細(xì)胞活性比較（n=5，±s）Tab 1 Comparison of cell activity of H9C2 myocardial cells after intervention with different concentrations of H2O2（n=5，±s）

注：與0 μmol/L 比較，**P＜0.01。

存活率（%）H2O2濃度（μmol/L）100 83.31±0.47**75.69±0.30**52.80±0.31**12.58±0.50**34 178 0.000 0 50 100 200 400 F P

2.2 山茶油對(duì)H2O2損傷后H9C2細(xì)胞衰老的影響

結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組相比，模型組β-半乳糖苷酶陽(yáng)性率增加，衰老細(xì)胞數(shù)所占百分比增加（P＜0.01）；與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組衰老細(xì)胞數(shù)量減少，衰老細(xì)胞數(shù)所占百分比減小，且隨著山茶油濃度的增加，衰老細(xì)胞數(shù)量依次降低，衰老細(xì)胞陽(yáng)性率降低（P＜0.05），見(jiàn)表2，圖1。

表2 山茶油對(duì)H2O2誘導(dǎo)H9C2 細(xì)胞衰老陽(yáng)性率的影響（n=3，±s）Tab 2 Effect of camellia oil on the positive rate of H2O2-induced aging in H9C2 cells（n=3，±s）

表2 山茶油對(duì)H2O2誘導(dǎo)H9C2 細(xì)胞衰老陽(yáng)性率的影響（n=3，±s）Tab 2 Effect of camellia oil on the positive rate of H2O2-induced aging in H9C2 cells（n=3，±s）

注：與空白對(duì)照組比較，**P＜0.01；與H2O2 組比較，#P＜0.05；##P＜0.01。

衰老陽(yáng)性率（%）9.28±0.69 74.23±3.52**66.18±2.63#51.43±3.91##25.81±2.54##270.0 0.000組別空白對(duì)照組H2O2組H2O2+0.01%山茶油組H2O2+0.1%山茶油組H2O2+1%山茶油組F P

圖1 不同濃度山茶油干預(yù)模型后H9C2 細(xì)胞β-半乳糖苷酶衰老染色實(shí)驗(yàn)（×100）Fig 1 Senescence-associated-β-galactosidase （SA-β-gal） staining of H9C2 cells after different concentrations of camellia oil intervention（×100）

2.3 山茶油對(duì)H2O2 損傷后H9C2 細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位的影響

結(jié)果顯示：相比空白對(duì)照組，模型組細(xì)胞紅/綠熒光強(qiáng)度比值顯著降低（P＜0.01）；與模型組相比，H2O2+1%山茶油組細(xì)胞紅/綠 熒光強(qiáng)度比值升高（P＜0.01）；H2O2+0.1%山茶油組、H2O2+0.01%山茶油組組間細(xì)胞紅/綠 熒光強(qiáng)度沒(méi)有明顯區(qū)別（P＞0.05），見(jiàn)圖2。

圖2 不同濃度山茶油干預(yù)模型后H9C2 細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位實(shí)驗(yàn)（×100）Fig 2 Mitochondrial membrane potential assay （JC-1） of H9C2 cells after different concentrations of camellia oil intervention（×100）

2.4 山茶油對(duì)H2O2損傷后H9C2細(xì)胞增殖的影響

結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組相比，模型組的細(xì)胞增殖率明顯降低（P＜0.01）；相比模型組，實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞增殖率增加，隨著山茶油濃度的增加，增殖率依次增加（P＜0.01 或P＜0.05），見(jiàn)表3，圖3。

表3 山茶油對(duì)H2O2誘導(dǎo)H9C2 細(xì)胞增殖率的影響（n=3，±s）Tab 3 Effect of camellia oil on H2O2 induced H9C2 cell proliferation rate（n=3，±s）

表3 山茶油對(duì)H2O2誘導(dǎo)H9C2 細(xì)胞增殖率的影響（n=3，±s）Tab 3 Effect of camellia oil on H2O2 induced H9C2 cell proliferation rate（n=3，±s）

注：與空白對(duì)照組比較，**P＜0.01；與H2O2 組比較，#P＜0.05；##P＜0.01。

組別空白對(duì)照組H2O2組H2O2+0.01%山茶油組H2O2+0.1%山茶油組H2O2+1%山茶油組增殖率（%）30.97±2.60 18.45±0.97**22.80±1.36#24.99±0.72##27.31±0.86##30.87 0.000 F P

2.5 山茶油對(duì)H2O2損傷后H9C2細(xì)胞遷移的影響

結(jié)果顯示：相比空白對(duì)照組，模型組細(xì)胞遷移率降低，愈合能力減弱（P＜0.01）；與模型組相比，H2O2+0.01% 山茶油組間遷移率無(wú)明顯差別，H2O2+0.1%山茶油組和H2O2+1%山茶油組細(xì)胞遷移率增加，細(xì)胞愈合能力增強(qiáng)（P＜0.01 或P＜0.05）。見(jiàn)表4，圖4。

表4 山茶油對(duì)H2O2誘導(dǎo)H9C2 細(xì)胞遷移率的影響（n=3，±s）Tab 4 Effect of camellia oil on H2O2-induced H9C2 cell migration rate（n=3，±s）

表4 山茶油對(duì)H2O2誘導(dǎo)H9C2 細(xì)胞遷移率的影響（n=3，±s）Tab 4 Effect of camellia oil on H2O2-induced H9C2 cell migration rate（n=3，±s）

注：與空白對(duì)照組比較，**P＜0.01；與H2O2 組比較，#P＜0.05；##P＜0.01。

組別空白對(duì)照組H2O2組H2O2+0.01%山茶油組H2O2+0.1%山茶油組H2O2+1%山茶油組遷移率（%）47.96±10.06 14.97±3.36**16.42±1.48 28.72±2.21#40.02±2.71##24.64 0.000 F P

2.6 山茶油對(duì)H2O2 損傷后的H9C2 中LDH、MDA、SOD 的影響

圖3 不同濃度山茶油干預(yù)模型后H9C2 細(xì)胞EdU 增殖染色實(shí)驗(yàn)（×100）Fig 3 EdU staining of H9C2 cells after different concentrations of camellia oil intervention（×100）

與空白對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞SOD 活性降低（P＜0.01），LDH 活性和MDA 含量增加（P＜0.01）；與模型組相比，H2O2+0.01%山茶油組間心肌細(xì)胞MDA 含 量、SOD 活 性 無(wú) 明 顯 差 別，LDH 活 性 增 加（P＜0.01）。H2O2+0.1%山茶油組和H2O2+1%山茶油組細(xì)胞SOD 活性增加，LDH 活性和MDA 含量下降（P＜0.05）。見(jiàn)表5。

圖4 不同濃度山茶油干預(yù)模型后H9C2 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)（×40）Fig 4 Scratch test of H9C2 cells after different concentrations of camellia oil intervention（×40）

表5 山茶油對(duì)H2O2誘導(dǎo)H9C2 細(xì)胞中LDH、MDA、SOD 的影響（n=3，±s）Tab 5 Effect of camellia oil on LDH， MDA， and SOD in H9C2 cells induced by H2O2（n=3，±s）

表5 山茶油對(duì)H2O2誘導(dǎo)H9C2 細(xì)胞中LDH、MDA、SOD 的影響（n=3，±s）Tab 5 Effect of camellia oil on LDH， MDA， and SOD in H9C2 cells induced by H2O2（n=3，±s）

注：與空白對(duì)照組比較，**P＜0.01；與H2O2組比較，#P＜0.05；##P＜0.01。

組別空白對(duì)照組H2O2組H2O2+0.01%山茶油組H2O2+0.1%山茶油組H2O2+1%山茶油組LDH（U/mL）45.99±1.48 MDA（nmol/104 cell）0.003 3±0.000 1 SOD(U/mL)35.25±0.24 29.58±1.09**30.25±0.49 31.47±0.46#32.37±0.49##37.68 0.000 F P 98.39±2.50**85.88±3.08#73.96±3.74##67.54±3.76##126.92 0.000 0.005 5±0.000 2**0.004 9±0.000 2 0.004 7±0.000 2#0.003 9±0.000 2##35.97 0.000

3 討論

心血管疾病包括，心律失常，冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病，高血壓，心肌病，外周血管疾病和先天性心臟缺陷等疾?。?，7］。心血管疾病是我國(guó)居民死亡的主要原因，占我國(guó)人口死亡的40%，是當(dāng)之無(wú)愧的人類(lèi)健康的“第一殺手”［8］。隨著我國(guó)老年人口所占比例逐漸增加，心血管疾病的發(fā)病率也日漸增加，必須重視其預(yù)防治療［9］。

包括心血管疾病在內(nèi)的許多慢性疾病，如糖尿病、腎臟、骨骼肌疾病被證實(shí)與氧化應(yīng)激直接相關(guān)［10］。氧化應(yīng)激是指體內(nèi)氧化與抗氧化機(jī)制的失衡，活性氧是具有化學(xué)反應(yīng)性的一類(lèi)含氧化學(xué)物質(zhì)的統(tǒng)稱(chēng)，包括過(guò)羥基自由基超氧化物，氧化物等非自由基分子?；钚匝跛綄?duì)的細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)至關(guān)重要，低到中等水平的活性氧激活應(yīng)激反應(yīng)性生存途徑，維持細(xì)胞分化和增殖。然而，高水平的活性氧會(huì)造成細(xì)胞成分的損傷，例如DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)［11］。多種心血管疾病已被證明與活性氧的過(guò)量產(chǎn)生有關(guān)［12］，H2O2作為活性氧的一員可調(diào)節(jié)從細(xì)胞分化到細(xì)胞凋亡的各種生物過(guò)程，同時(shí)過(guò)量的H2O2也被廣泛認(rèn)為具有細(xì)胞毒性作用，其在體內(nèi)通過(guò)過(guò)氧化氫酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶等酶消除［13，14］。

山茶油是從成熟的油茶種子中獲得的純天然食用油，因?yàn)槠溆退釢舛群芨?，與橄欖油非常相似，通常被稱(chēng)為“亞洲橄欖油”。山茶油不僅是一種常見(jiàn)的食用油，而且也具有很大的的藥用價(jià)值。傳統(tǒng)上，山茶油長(zhǎng)期以來(lái)一直用于治療人們的胃腸道，肺和腎臟疾病。先前的研究表明，山茶油比普通食用油更能有效預(yù)防高血壓、高脂血癥和高血糖［15-18］。山茶油主要成分包括油酸、亞油酸、棕櫚酸、角鯊烯、維生素E 以及類(lèi)黃酮，具有抗氧化作用在內(nèi)的廣泛的藥理作用。由此猜想山茶油可以減輕氧化應(yīng)激造成的心血管損傷，從而有效的預(yù)防心血管疾病。

在體外利用H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞建立氧化應(yīng)激損傷模型已逐漸成熟，本研究通過(guò)利用H2O2在體外建立細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型，用氧化應(yīng)激損傷模型來(lái)探索山茶油對(duì)細(xì)胞氧化應(yīng)激具有保護(hù)作用。首先分別用不同濃度的H2O2溶液對(duì)H9C2 心肌細(xì)胞進(jìn)行損傷造模，通過(guò)CCK8 實(shí)驗(yàn)來(lái)選取最佳H2O2損傷造模濃度，從而建立氧化應(yīng)激模型。用不同濃度的山茶油預(yù)處理細(xì)胞后，加入200 mol/L H2O2刺激細(xì)胞，分別通過(guò)β-半乳糖衰老染色實(shí)驗(yàn)，線(xiàn)粒體膜電位實(shí)驗(yàn)，EdU 細(xì)胞增殖染色實(shí)驗(yàn)及劃痕實(shí)驗(yàn)來(lái)探索不同濃度山茶油對(duì)細(xì)胞氧化應(yīng)激后衰老、線(xiàn)粒體膜電位、細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移及氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響。本研究結(jié)果顯示在H2O2處理?xiàng)l件下，山茶油可以抑制心肌細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位下降和心肌細(xì)胞衰老；增加心肌細(xì)胞增殖率和遷移率。LDH、MDA 可反映心肌細(xì)胞氧化損傷程度，SOD 可反應(yīng)心肌抗氧化程度。山茶油可降低H2O2處理?xiàng)l件下心肌細(xì)胞LDH和MDA 活性 ，增高 SOD 活性。說(shuō)明山茶油能對(duì)H2O2誘導(dǎo)的H9C2 心肌細(xì)胞損傷起保護(hù)作用。

綜上所述，本研究證實(shí)了山茶油對(duì)H2O2誘導(dǎo)大鼠H9C2 心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷具有保護(hù)作用，提示山茶油可能具有抗氧化應(yīng)激損傷的能力，且山茶油的抗氧化力隨著山茶油濃度的增加而增強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為山茶油后續(xù)的抗氧化藥理作用及臨床研究提供幫助。本研究?jī)H局限于體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，還需要進(jìn)一步在動(dòng)物模型中驗(yàn)證，為山茶油對(duì)機(jī)體氧化損傷的保護(hù)作用提供更多依據(jù)。

作者貢獻(xiàn)度說(shuō)明：

晏慶：實(shí)驗(yàn)實(shí)施，數(shù)據(jù)處理和論文撰寫(xiě)；郭蓁、孫賽男、黎婧：文獻(xiàn)檢索和數(shù)據(jù)分析；黎靜、譚機(jī)永：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)及論文修改指正。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。