目的：建立基于膠體金免疫層析技術的鮮濕粉類食品中米酵菌酸的快速檢測方法。方法：通過選購市售常見的米酵菌酸膠體金免疫層析產品，優(yōu)化快檢產品的提取溶劑、提取液體積、復溶液pH等前處理步驟，并考察優(yōu)化后方法的交叉反應率和準確性。結果：結果表明，最優(yōu)提取條件為3 mL乙酸乙酯提取，磷酸鹽復溶液pH=7，溫育溫度20 ℃～40 ℃，微孔加樣量100 μL，檢測卡反應時間6 min。優(yōu)化后的方法檢出限達到3 μg/kg，與GB 5009.189—2023第二法的定量限一致。同時，該方法應用于真實樣品的檢測準確性高，與參比方法結果具有一致性。結論：該方法快速、靈敏、易操作、準確性高，適合于大批量樣品的快速篩查，能夠滿足企業(yè)內控、基層監(jiān)管、大型活動保障等需求。

關鍵詞

米酵菌酸 濕粉 快速檢測

█ Optimization of Rapid Detection Method for Bongkrekic Acid in Fresh Wet Rice Noodles and Vermicelli

LIU Yaohui， Zhang Yongtang，CAI Ruochun，LUO Zhihao， LIU Haihong*/Guangdong Institute of Food Inspection

Abstract

Objective：A rapid detection method for bongkrekic acid in fresh wet rice noodles and vermicelli based on immunochromatography technology was established.Methods：The mainstream pretreatment procedure such as extraction solvent， extraction volume， pH of the complex solution of rapid detection method for Bongkrekic Acid in Fresh Wet Rice Noodles and Vermicelli was optimized by choosing common procymidone colloidal gold immune chromatography products available in the market to determine the performance index of the method. The cross reaction rate and accuracy of the method were investigated. Results：The results showed that the optimum extraction conditions were 3 mL of ethyl acetate， phosphate complex solution pH=7， incubate at 20 ℃～40 ℃， add 100 μL of sample to the micropores， and test the reaction time of the detection card for 6 minutes.The detection limit of the method were 3 μg/kg，which was consistent with the quantitative limit of the second method in GB 5009.189—2023.Conclusion：This method is rapid， sensitive and accurate， which is suitable for detecting bongkrekic acid in large quantities of samples， it can meet the needs of enterprise internal control， grassroots supervision， and large-scale event support.

Key words

Bongkrekic Acid， wet rice noodle， rapid detection

0 引言

濕粉類食品是一種以大米或食用淀粉為主要原料制成的食品[1]，常見的有河粉、腸粉、米線、粿條、米粉等，深受我國廣東、廣西、湖南、云南等地區(qū)消費者的喜愛。然而，近年來全國報道多起鮮濕粉類食品中米酵菌酸中毒事件，引起了公眾對米酵菌酸毒素檢測的高度關注和監(jiān)管重視[2-6]。米酵菌酸具有無味，耐熱性極強的特性，普通加熱烹飪方式很難將其去除。米酵菌酸毒性極強，是一種強呼吸毒素，主要攻擊人體的肝、腦、腎等臟器，一旦中毒嚴重會因呼吸衰竭而死亡[7-10]，因此加強對鮮濕米粉食品中米酵菌酸的監(jiān)控檢測尤為重要。

目前，針對米酵菌酸的分析檢測方法主要包括液相色譜法[11，12]、液相色譜串聯(lián)質譜法[13-15]、熒光層析法[16]等方法，現(xiàn)行國家標準中米酵菌酸的檢測方法為液相色譜和液相色譜-質譜聯(lián)用法。儀器方法只適用于專業(yè)實驗室檢測，且檢測成本高、檢測耗時耗力，不適用于批量樣品快篩、重大活動保障、應急檢驗等。膠體金免疫層析技術是近些年快速發(fā)展起來的一種檢測方法，具有簡單快速、成本低等優(yōu)點，已廣泛應用于食品中農獸藥殘留[17，19]、真菌毒素[20，21]、重金屬[22，23]檢測等領域。

為提高檢驗效率和充分利用檢測資源，可利用膠體金免疫層析法對大批量樣品進行快檢篩查，出現(xiàn)陽性樣本再用儀器法進行確證，充分發(fā)揮膠體金免疫層析的優(yōu)點。目前暫無食品安全國家標準明確規(guī)定濕米粉中米酵菌酸的殘留量，市售米酵菌酸的快檢產品標示檢出限存在差異，無法與現(xiàn)行食品安全國家標準GB 5009.189—2023《食品安全國家標準 食品中米酵菌酸的測定》第二法的定量限相匹配，造成在實際應用過程中受限制。因此，亟需根據(jù)市售米酵菌酸的快檢產品性質，優(yōu)化快檢產品的各項前處理條件，建立一種方法檢出限與新國家標準定量限相匹配的快速檢測方法，為監(jiān)管部門簡便、快捷、準確測定米酵菌酸提供技術支撐，提高監(jiān)管靶向性和效率。

本研究通過優(yōu)化市售常見米酵菌酸快檢產品的前處理步驟，針對濕米粉、濕河粉、濕涼皮3種典型濕粉類食品基質建立操作簡單、快速準確的前處理方法和檢測條件，并考查優(yōu)化后方法的特異性、準確性和適用性，從而為濕米粉生產企業(yè)、餐飲單位、監(jiān)管部門開展米酵菌酸快速篩查工作提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

濕米粉、濕河粉、濕涼皮：農貿市場購買；米酵菌酸快速檢測卡、金標微孔：深圳易瑞生物科技有限公司。

米酵菌酸標準溶液： C28H38O7，CAS號：11076-19-0，溶劑為乙腈，500 μg/mL，購于中國Pribolab公司。

乙腈、甲醇（色譜純， Honeywell公司）；乙酸乙酯、氨水、甲酸（分析純， 廣州化學試劑廠）；XBridge C18色譜柱（4.6×100 mm， 2.5 μm，Waters公司）；混合型強陰離子交換柱；0.22 μm微孔濾膜（上海安譜公司）；實驗室用水為Milli-Q超純水。

1.2 儀器與設備

超高效液相色譜-質譜聯(lián)用儀（美國Waters），Millipore Milli-Q 超純水處理系統(tǒng)（美國Millipore），EOAA-HM-01多位渦旋振蕩器（上海安譜），DM0412離心機（北京大龍），DCY08-1空氣濃縮儀（江蘇金昌），Meilen電子天平（德國梅特勒）。

1.3 試驗方法

本方法采用競爭抑制免疫層析原理。樣品中的米酵菌酸經(jīng)提取后與膠體金標記的特異性抗體結合，抑制抗體和試紙條中檢測線（T線）上抗原的結合，從而導致檢測線顏色深淺的變化。通過目視法觀察檢測線（T線）與控制線（C線）顏色，對樣品中的米酵菌酸進行定性判定。

由于現(xiàn)階段暫無食品安全國家標準規(guī)定鮮濕米粉中米酵菌酸的最大殘留限量，本方法擬以GB 5009.189—2023第二法的定量限3 μg/kg作為方法的最低檢出限。因此，所有加標樣品的米酵菌酸添加濃度為3 μg/kg。

1.3.1 優(yōu)化提取劑

稱取1 g濕米粉、濕河粉、涼皮加標樣品各2份，分別用乙酸乙酯、甲醇、乙腈、甲醇-氨水溶液（80 mL甲醇，加入1 mL氨水，加水定容至100 mL）、乙腈-氨水溶液（80 mL乙腈，加入1 mL氨水，加水定容至100 mL）5 種溶劑各 3 mL 進行提取，根據(jù)檢出限和膠體金檢測卡扣顯色效果，選擇最佳提取溶劑。

1.3.2 提取劑體積的優(yōu)化

稱取濕米粉、濕河粉、涼皮加標樣品各1 g，分別用乙酸乙酯溶液 3 mL、4 mL、5 mL和6 mL進行提取，根據(jù)檢測限和膠體金檢測卡扣顯色結果，選擇提取劑的最佳提取體積。

1.3.3 復溶液pH的優(yōu)化

稱取一定質量的磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、氯化鉀，配制成pH為3、5、7、9的0.5 mol/L磷酸鹽復溶液，稱取濕米粉、濕河粉、涼皮加標樣品各1 g，加入3 mL乙酸乙酯提取，提取完成后，取2 mL上清液氮吹，加入100 μL不同pH的磷酸鹽復溶液，根據(jù)檢測限和膠體金檢測卡扣顯色結果，選擇復溶液的最佳pH。

1.3.4 溫育溫度的優(yōu)化

稱取濕米粉、濕河粉、涼皮加標樣品各1 g，加入3 mL乙酸乙酯提取，提取完成后，取2 mL上清液氮吹，加入100 μL pH=7的磷酸鹽復溶液復溶，取100 μL待測液于微孔中，多次抽吸混合均勻后，分別在10℃、20℃、 30℃、40℃溫育條件下溫育3 min，根據(jù)檢測限和膠體金檢測卡扣顯色結果，選擇最佳溫育溫度。

1.3.5 微孔中加樣量的優(yōu)化

稱取濕米粉、濕河粉、涼皮加標樣品各1 g，加入3 mL乙酸乙酯提取，提取完成后，取2 mL上清液氮吹，加入100 μL pH=7的磷酸鹽復溶液復溶，分別取50 μL、100 μL、200 μL 待測液于微孔中，多次抽吸混合均勻后，根據(jù)檢測限和膠體金檢測卡扣顯色結果，選擇最佳加樣量。

1.3.6 檢測卡反應時間的優(yōu)化

稱取濕米粉、濕河粉、涼皮加標樣品各1 g，加入3 mL乙酸乙酯提取，提取完成后，取2 mL上清液氮吹，加入100 μL pH=7的磷酸鹽復溶液復溶，取100 μL待測液于微孔中，多次抽吸混合均勻后，滴入膠體金卡扣的加樣孔中，待溶液開始層析時計時，分別于2 min、4 min、6 min、8 min、10 min拍照記錄檢測卡顯色結果，根據(jù)膠體金檢測卡扣顯色結果，選擇最佳反應時間。

1.3.7 交叉試驗

本方法選用的檢測卡為米酵菌酸膠體金檢測卡，以空白濕米粉分別加入不同濃度水平的玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素、赭曲霉毒素A、T-2毒素的標準溶液，記錄檢測結果。

1.3.8 快檢方法與參比方法一致性分析

采用本研究建立的米酵菌酸快檢方法和標準參比方法GB 5009.189—2023第二法，同時對廣東省風險監(jiān)測的30批次濕粉類樣品進行檢測，對比兩種方法的測定結果。

1.3.9 方法與其他快檢產品的適用性

應用優(yōu)化的米酵菌酸快檢產品的前處理步驟，考察其對市售2家常見廠家膠體金快檢產品的適用性。

2 結果與分析

2.1 提取劑的優(yōu)化結果

稱取濕米粉、濕河粉、涼皮加標樣品各1 g，分別加入乙酸乙酯、甲醇、乙腈、甲醇-氨水溶液、乙腈-氨水溶液5 種提取溶劑進行試驗，觀察檢測卡的顯色情況。結果表明，5種提取溶劑對于3種基質的提取效果相近，顯色效果清晰，加標濃度為3 μg/kg時，均呈現(xiàn)陽性結果。根據(jù)統(tǒng)計的氮吹時間，5種提取溶劑的氮吹時間差別較大，其中乙酸乙酯氮吹時間最短，僅需大約15 min，甲醇、乙腈次之，甲醇-氨水溶液、乙腈-氨水溶液的氮吹時間大于或等于30 min，提取劑中水的存在，導致氮吹時間較長，會影響單個樣品的檢測時間，滿足不了快速檢測中的快。綜上所述，本試驗采用乙酸乙酯作為提取溶劑。

2.2 提取劑體積的優(yōu)化結果

濕米粉、濕河粉、涼皮加標樣品，分別加入 3 mL、4 mL、5 mL和6 mL的乙酸乙酯進行試驗，觀察檢測卡的顯色情況。結果表明，3種基質在加入不同體積的提取液時，膠體金顯示結果存在不一致。當加入3 mL提取液時，濕米粉、濕河粉、涼皮加標樣品的測定結果均為陽性。當加入4 mL和5 mL提取液時，濕米粉加標樣品的測定結果為陰性。當加入6 mL提取液時，米粉、濕河粉、涼皮樣品加標樣品的測定結果均為陰性。綜上所述，為滿足濕米粉、濕河粉、涼皮樣品檢出限3 μg/kg的需求，確定最佳提取體積為3 mL。

2.3 復溶液pH的優(yōu)化結果

濕米粉、濕河粉、涼皮加標樣品，加入pH為3、5、7、9的復溶液，觀察檢測卡的顯色。結果表明，當復溶液pH=3和5時，濕米粉、濕河粉、涼皮加標樣品的顯色結果均為陰性。當復溶液pH=7時，濕米粉、濕河粉、涼皮加標樣品的顯色結果均為陽性，且檢測卡C線和T線顯色清晰。當復溶液pH=9時，濕米粉、涼皮加標樣品的顯色結果為陽性，濕河粉顯色結果為陰性。綜上所述，選擇配制pH=7.0的復溶液。

2.4 溫育溫度的優(yōu)化結果

濕米粉、濕河粉、涼皮加標樣品，設置溫育溫度為10 ℃、20 ℃、30 ℃、40 ℃，觀察檢測卡顯色情況。結果表明，低溫下（溫育溫度10 ℃）時，濕米粉加標樣品的顯色結果為陰性。當溫育溫度升高至20 ℃、30 ℃、40 ℃時，濕米粉、濕河粉、涼皮加標樣品的檢測卡顯色結果為陽性，且試紙條C線和T線顯色清晰可判讀。綜合 C線與 T 線顯色可識別度、檢測卡準確性及操作環(huán)境舒適度，米酵菌酸膠體金快速檢測產品建議試驗操作環(huán)境溫度為 20 ℃～40 ℃。

2.5 微孔中加樣量的優(yōu)化

濕米粉、濕河粉、涼皮加標樣品，設置微孔中50 μL、100 μL、200 μL不同加樣量，觀察檢測卡顯色。結果表明，當微孔中加樣量為50 μL時，涼皮加標樣品的檢測卡出現(xiàn)無效結果，即微孔中樣品體積太小，導致無法充分層析。當加樣量為100 μL時，濕米粉、濕河粉、涼皮加標樣品的檢測卡層析充分，C線和T線顏色區(qū)分明顯，有利于結果判讀。當加樣量為200 μL時，層析充分，呈現(xiàn)陽性，加樣孔中仍有待測液，加樣量稍過量；考慮加樣量過少會導致層析不充分，從而影響檢測卡的靈敏度，故選擇微孔中加樣量為100 μL。

2.6 檢測卡反應時間的優(yōu)化結果

濕米粉、濕河粉、涼皮加標樣品，設置檢測卡在2 min、4 min、6 min、8 min、10 min反應時間，觀察顯色。結果表明，當待測液反應時間為2 min時，檢測卡的C線和T線剛顯色，顯色非常淺，不易肉眼判讀。4 min時，檢測卡能較好顯色，6 min～8 min時，試紙卡的C線和T線顯色清晰且穩(wěn)定，具有良好識別度。10 min時，檢測卡的C線顯色過深。綜上所述，選擇檢測卡反應時間為6 min。

2.7 方法的交叉反應結果

以空白濕米粉，分別加入4種真菌毒素作為干擾物質，其添加水平在100 μg/kg和1000 μg/kg時，進行交叉反應試驗，結果如表1所示。結果表明，米酵菌酸膠體金檢測卡結果判定全部為陰性，說明上述4種真菌毒素類化合物在濃度水平1000 μg/kg時與米酵菌酸無交叉反應，方法特異性好。

2.8 快檢結果與參與方法結果一致性分析

選取30 批次風險監(jiān)測濕粉類食品，同時按照參比方法將GB 5009.189—2023第二法和本研究所建立的快檢方法對樣品進行測試，比對數(shù)據(jù)見表 2。米酵菌酸檢測卡檢出1批次濕米粉陽性，該樣品的參比方法檢測結果為116 μg/kg，其余29批次樣品的快檢結果為陰性，參比方法測定結果為未檢出。綜上，膠體金試紙條檢測結果與參比方法檢測結果符合率為 100%，說明建立的快檢方法與參比方法的結果具有一致性。

2.9 方法對其他快檢產品的適用性

采用建立快檢方法中的前處理條件，使用品牌A和品牌B快檢產品的微孔和檢測卡進行加標樣品濕米粉、濕河粉、濕涼皮的測試，每個樣品平行測定3次，結果見表3。由表3可知，2個品牌的加標樣品檢測結果均為陽性，說明新建立的快檢方法中的前處理條件與其他快檢產品相匹配，具有一定通用性，能推廣至其他快檢產品的研發(fā)應用上。

3 結論

本研究選用濕米粉、河粉、涼皮等代表性濕粉類食品作為研究對象，針對濕粉類食品中風險較高的米酵菌酸毒素建立了一種快速檢測方法。通過條件優(yōu)化，確定了快速檢測方法的提取溶劑、復溶液pH值、加樣量、層析反應時間等前處理條件。本方法的檢出限可達3 μg/kg，與GB 5009.189—2023第二法的定量限一致，方法靈敏度高，具有良好特異性，且與參比方法結果具有一致性。本方法易操作，用時少、準確性高、檢出限低，適合于大批量樣品的快速篩查，能夠滿足企業(yè)自查、基層監(jiān)管、大型活動保障等需求。█

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