黃玉 劉豆 黃文霞 梁耕田

聲帶瘢痕(vocal fold scar)是由于炎癥、外傷等各種原因引起喉腔損傷,使聲帶固有層細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)中膠原纖維、彈性纖維和纖維連接蛋白形態(tài)和含量發(fā)生改變,成纖維細胞增殖活躍,進而導(dǎo)致肉芽組織過度增生并逐漸纖維化的結(jié)果[1,2]。ECM的合成和降解與組織纖維化密切相關(guān),其合成主要依賴于轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)信號通路調(diào)節(jié),降解則依賴于基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)。與此相符,在聲帶損傷的瘢痕修復(fù)過程中,TGF-β1、Smmad7高表達[3,4]。Lim等[5]在大鼠聲帶瘢痕模型研究中發(fā)現(xiàn),IL-1、NF-κB、TNF-α等也高表達。而本科研團隊前期通過CO2激光燒灼術(shù)成功構(gòu)建了犬聲帶瘢痕模型,發(fā)現(xiàn):賴氨酰胺氧化酶(lysyl oxidase,LOX)、基質(zhì)金屬蛋白酶-1(matrix metalloproteinase-1,MMP1)、缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)、熱休克蛋白(heat shock proteins,HSP70)、透明質(zhì)酸(hyaluronic acid,HA)等因子在聲帶瘢痕形成過程的不同時期表現(xiàn)出不同的表達水平,推測以上因子與聲帶創(chuàng)傷修復(fù)及瘢痕形成相關(guān)[6,7]。與聲帶瘢痕形成相關(guān)的基因眾多且較為分散,不能較全面地匯總出重點相關(guān)的基因家族。本研究通過等離子射頻消融術(shù)構(gòu)建犬聲帶瘢痕模型,并采用高通量測序技術(shù)對正常聲帶和瘢痕化聲帶進行轉(zhuǎn)錄組基因檢測分析,篩選出與聲帶瘢痕形成密切相關(guān)的靶基因及所富集的信號通路,為探索聲帶瘢痕發(fā)生機制提供進一步參考。

1 材料與方法

1.1實驗動物 由三峽大學(xué)提供健康中華田園犬4只,均為1歲齡雄性犬,體重均為10 kg左右,全部通過湖北省疾病預(yù)防控制中心質(zhì)量檢測,具備科學(xué)研究條件。研究期間所有犬在同等環(huán)境條件下飼養(yǎng)于武漢大學(xué)附屬同仁醫(yī)院(武漢市第三醫(yī)院)實驗中心犬飼養(yǎng)間,所有操作均通過動物倫理委員會審批(武三醫(yī)實倫SY2022-009)。

1.2實驗試劑及儀器 內(nèi)窺鏡攝像系統(tǒng)(KARL STORZ)、醫(yī)用內(nèi)窺鏡冷光源(KARL STORZ)、等離子動力系統(tǒng)(KARL STORZ)、0°內(nèi)鏡鏡頭(KARL STORZ)、支撐喉鏡、負壓吸引器、光學(xué)顯微鏡(Olympus)、超薄切片機(Leica)、鉆石切片刀(Daitome)、透射電子顯微鏡(HITACHI)、蘇木素染液(Servicebio)、伊紅染液(Servicebio)、環(huán)保型脫蠟透明液(Servicebio)、電鏡固定液(Servicebio)、4%多聚甲醛固定液(Biosharp)、環(huán)氧樹脂812包埋劑(Servicebio)、RNA提取試劑盒(Omega)、PCR擴增試劑盒(Servicebio)。

1.3構(gòu)建犬聲帶瘢痕模型 將4只中華田園犬禁食、禁水8 h,采用速眠新II 0.05 ml/kg+5%戊巴比妥鈉0.25 ml/kg右后上肢肌肉注射麻醉,在支撐喉鏡內(nèi)鏡輔助下充分暴露雙側(cè)聲帶,等離子刀(切割功率7檔,電凝功率3檔)逐層消融左側(cè)聲帶中上1/2段,直至肌層,面積約7 mm2,右側(cè)聲帶作為自身對照側(cè)不予任何處理,蘇醒4 h后予以少許軟食,次日起恢復(fù)正常飲食。所有犬同等條件下飼養(yǎng)。

1.4聲帶大體形態(tài)觀察 在參考本團隊前期成功造模的基礎(chǔ)上[6],將本研究觀察時間點選為術(shù)前、術(shù)后即刻、術(shù)后3周和術(shù)后12周。將所有犬進行肌肉注射麻醉(方法同1.3),于支撐喉鏡內(nèi)鏡輔助下充分暴露雙側(cè)聲帶,觀察形態(tài)學(xué)特征及變化。

1.5組織取材 術(shù)后12周,將所有犬予以安樂死,將喉完整離體分離,充分暴露雙側(cè)聲帶,于術(shù)側(cè)聲帶取多個典型標(biāo)本,部分放入4%多聚甲醛固定液和電鏡固定液(主要成分為2.5%戊二醛)中固定,部分放入EP管中于-80℃新鮮凍存,同法處理對照側(cè)聲帶組織。所有樣本大小相當(dāng)、重量相仿。

1.6HE染色觀察聲帶病理結(jié)構(gòu) 將多聚甲醛固定后的聲帶組織進行石蠟包埋,垂直于聲門區(qū)方向進行橫切制片,厚度為4 μm,然后依次經(jīng)過脫蠟透明液(2次,每次20 min)、梯度酒精、PBS(5 min)脫蠟水化,后滴加蘇木素染色4 min,鹽酸酒精分化3 s、氨水返藍4 s后滴加伊紅染色2 min,最后將切片經(jīng)過梯度酒精和脫蠟透明液(2次,每次10 min)進行脫水透明,中性樹膠封片后,于光學(xué)顯微鏡下觀察雙側(cè)聲帶組織結(jié)構(gòu)及變化。

1.7電鏡下觀察聲帶超微結(jié)構(gòu) 將取出的犬聲帶組織按順序進行多次固定(電鏡固定液室溫避光固定2 h→電鏡固定液4℃繼續(xù)固定2 d→0.1 M磷酸緩沖液漂洗后于1%鋨酸室溫避光后固定2 h),0.1 M磷酸緩沖液漂洗后經(jīng)梯度酒精和丙酮(2次,每次15 min)脫水,然后丙酮∶環(huán)氧樹脂1∶2于37℃滲透包埋過夜,后于60℃聚合48 h制備樹脂塊。垂直于聲門區(qū)方向進行橫切超薄制片,厚度為60 nm,150目方華膜銅網(wǎng)撈片,2%醋酸鈾酒精染色8 min,70%酒精和雙蒸水各清洗3次,2.6%枸櫞酸鉛染色8 min后雙蒸水清洗、風(fēng)干,于透射電鏡下觀察雙側(cè)聲帶超微組織結(jié)構(gòu)及變化。

1.8兩組犬聲帶高通量轉(zhuǎn)錄組基因測序 按照RNA提取試劑盒說明書提取正常聲帶和瘢痕聲帶組織總RNA,瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性,Nanodrop和Qubit分別對提取的RNA進行純度檢測和總量測定。利用Oligo(dT)富集mRNA,并將其打斷成200 bp左右的片段,以其為模板合成雙鏈cDNA,經(jīng)過End Repair Mix進行末端補平和末端加A后,連接測序接頭并進行cDNA消化,留取單鏈cDNA后進行15個循環(huán)的PCR擴增,得到cDNA庫后采用illumina Novaseq6000雙端測序模式進行高通量測序。兩組聲帶測序后進行轉(zhuǎn)錄組基因差異性統(tǒng)計學(xué)分析。

聲帶組織中提取總RNA經(jīng)瓊脂凝膠電泳檢測示28S:18S≥1.5,Nanodrop檢測RNA純度示OD260/280比值均在1.8～2.2范圍內(nèi),Qubit精確定量RNA總量≥500 ng。利用DESeq2軟件對正常聲帶組和瘢痕聲帶組的基因表達情況進行差異性統(tǒng)計學(xué)分析,為提高結(jié)果準(zhǔn)確性和排除個體差異性,于正常聲帶組4只犬中留取的大小相當(dāng)、重量相仿的典型標(biāo)本中隨機選取3個樣本,將測得的基因表達量取平均值記為對照組G1,同法于瘢痕聲帶組典型標(biāo)本中隨機選取3個樣本,將測得的基因表達量取平均值記為實驗組G2,以log2FC值為橫坐標(biāo),log10(PValue)值為縱坐標(biāo)繪制火山圖,滿足|log2FC|≥1且P≤0.05表明基因表達有明顯統(tǒng)計學(xué)差異(其中l(wèi)og2FC≥1的點表示實驗組G2相對于對照組G1表達顯著上調(diào)的基因,≤-1的點表示實驗組G2相對于對照組G1表達顯著下調(diào)的基因,P≤0.05提示基因表達存在顯著差異性)。

2 結(jié)果

2.1不同時期聲帶大體形態(tài) 術(shù)前犬雙側(cè)聲帶均呈白色條帶狀、邊緣光滑整齊,活動對稱,閉合良好(圖1a)。左側(cè)聲帶等離子消融術(shù)后,術(shù)側(cè)聲帶組織損傷暴露至肌層,失去原有形態(tài)特征,對側(cè)聲帶與術(shù)前無明顯差異(圖1b);術(shù)后3周,術(shù)側(cè)聲帶創(chuàng)面已處于修復(fù)狀態(tài),但邊緣不規(guī)則,組織仍有充血腫脹,可見紅色肉芽組織形成,對側(cè)聲帶與術(shù)前無明顯差異(圖1c);術(shù)后12周,術(shù)側(cè)聲帶創(chuàng)面已修復(fù)完成,未見充血腫脹及肉芽組織,但局部攣縮凹陷、邊緣不整齊,瘢痕形成,對側(cè)聲帶與術(shù)前無明顯差異(圖1d)。

圖1 不同時期內(nèi)鏡下聲帶大體形態(tài)學(xué)觀察 a. 術(shù)前犬正常聲帶; b. 等離子術(shù)后即刻聲帶; c. 等離子術(shù)后3周聲帶; d. 等離子術(shù)后12周聲帶

2.2HE染色觀察 正常聲帶組織結(jié)構(gòu)完整、層次分明,外層為復(fù)層鱗狀上皮層,緊接著可見疏松的結(jié)締組織層以及排列有序、走向一致的纖維層和肌層(圖2a)。術(shù)側(cè)聲帶鱗狀上皮層明顯增厚,并可見多量散在纖維束,原有疏松結(jié)締組織層纖維化,原有纖維層增厚、排列紊亂、走向不一,局部成團狀或束狀聚集(圖2b);間質(zhì)增厚、密度不均(圖2c);總體層次混亂,肌層亦可見散在紊亂的纖維束(圖2d)。

圖2 犬聲帶HE染色下病理結(jié)構(gòu)觀察 a. 正常聲帶組織,見其結(jié)構(gòu)完整、層次清晰(40×); b. 瘢痕聲帶組織,見鱗狀上皮增厚,原有纖維層排列紊亂(40×); c. 瘢痕聲帶間質(zhì)增厚、不均(100×); d. 瘢痕聲帶結(jié)構(gòu)混亂,肌層亦可見散在纖維束(100×)

2.3超微結(jié)構(gòu)觀察 正常聲帶組織層次分明,復(fù)層鱗狀上皮層細胞多層有序排列,細胞未見腫脹,相對靜止(圖3a);結(jié)締組織層致密,間質(zhì)密度較均,纖維層呈波浪形有序排列、走向一致(圖3b)。術(shù)側(cè)聲帶組織鱗狀上皮增厚,細胞呈腫脹狀態(tài),細胞間亦可見散在纖維,纖維層排列紊亂(圖3c);間質(zhì)增厚、密度不均,細胞腫脹,細胞間界線不清,細胞核增生、線粒體增多,細胞較為活躍(圖3d)。

圖3 犬聲帶透射電鏡下超微結(jié)構(gòu)觀察 a、b. 正常聲帶組織超微結(jié)構(gòu)(3 000×,6 000×);c、d. 瘢痕聲帶組織超微結(jié)構(gòu)(3 000×,6 000×)

2.4高通量測序轉(zhuǎn)錄組基因分析 兩組基因表達差異的火山圖見圖4,可見,兩組聲帶組織基因表達總體存在較大差異性,實驗組較對照組基因表達呈現(xiàn)顯著上調(diào)、顯著下調(diào)和無顯著差異三種趨勢,其中表達顯著上調(diào)居多(圖4)。再以基因在對照組G1中的表達量為橫坐標(biāo),在實驗組G2中的表達量為縱坐標(biāo)繪制散點圖(圖5),顯著差異基因表達篩選條件同火山圖,同樣表現(xiàn)為實驗組較對照組基因表達呈現(xiàn)顯著上調(diào)居多,趨勢同火山圖所示。

圖4 犬聲帶樣本間基因表達火山圖 左側(cè)紫色的點表示實驗組G2相對于對照組G1表達呈顯著下調(diào)的基因,右側(cè)藍色的點表示實驗組G2相對于對照組G1表達呈顯著上調(diào)的基因,而灰色的點則表示兩組間無顯著差異表達的基因

圖5 犬聲帶樣本間基因表達散點圖 左上側(cè)紅色的點表示實驗組G2相對于對照組G1表達呈顯著上調(diào)的基因,右下側(cè)綠色的點表示實驗組G2相對于對照組G1表達呈顯著下調(diào)的基因,而中間灰色的點則表示兩組間無顯著差異表達的基因

與聲帶瘢痕形成密切相關(guān)的基因家族見表1,包括炎癥相關(guān)的IL家族、趨化因子CCL和CXCL家族、基質(zhì)金屬蛋白酶MMPs家族及其抑制劑TIMPs家族、參與多種細胞生理過程的Wnt家族、熱休克蛋白HSP家族、絲裂原活化蛋白激酶MAPK家族和TGF-β家族等。其中,IL家族的IL16、IL18和IL33,CCL家族的CCL2、CCL8、CCL13、CCL14、CCL19、CCL20、CCL22和CCL23;CXCL家族的CXCL13和CXCL14;MMPs家族的MMP1、MMP2、MMP12、MMP16、MMP19、MMP25和MMP27、TIMP1均顯著上調(diào);Wnt家族的Wnt8a和Wnt通路抑制劑Wif1、DKK1、DKK2顯著上調(diào),但Wnt8b顯著下調(diào);HSP家族相關(guān)的HSP90β1顯著上調(diào),而HSPβ2、HSPβ2和HSPβ6顯著下調(diào);MAPK家族相關(guān)的MAPK4、MAPK12、MAP3K13、MAP3K20、MAP3K7CL和MAPKAPK2顯著下調(diào);TGF-β家族的BMP5和TGFβ2顯著上調(diào)。

表1 犬正常聲帶和瘢痕聲帶間顯著差異性基因

3 討論

聲帶瘢痕是目前嗓音外科的常見并發(fā)癥[8],尚缺乏有效統(tǒng)一的方法從組織學(xué)上逆轉(zhuǎn)聲帶瘢痕,究其原因主要是因為聲帶瘢痕的發(fā)生機制尚不完全明確。聲帶損傷的預(yù)后與損傷程度相關(guān),因透明質(zhì)酸、核心蛋白聚糖等抗瘢痕形成物質(zhì)的存在,上皮層及固有層淺層的損傷多可完全修復(fù)、不留瘢痕,但固有層深層乃至肌層的損傷會導(dǎo)致周邊小血管的廣泛閉合、纖維組織排序紊亂并過度增生,進而發(fā)生纖維化[9,10],導(dǎo)致瘢痕形成。低溫等離子消融術(shù)是一種電化學(xué)微創(chuàng)技術(shù),通過激發(fā)電極與組織之間的電解質(zhì)產(chǎn)生帶有能量的離子蒸汽層,即本質(zhì)上是一種電熱創(chuàng)傷,快速打破細胞分子化學(xué)鍵,達到多層組織快速消融的目的,有定位精準(zhǔn)、用時短等優(yōu)勢[11],可對聲帶固有層深層及肌層造成所需程度的損傷,因此本研究所選用的低溫等離子消融術(shù)具備構(gòu)建聲帶瘢痕模型的能力。

本研究對犬左側(cè)聲帶進行低溫等離子消融術(shù),術(shù)后3周見術(shù)側(cè)聲帶組織充血腫脹,邊緣不齊,可見紅色肉芽組織形成,此時聲帶尚處于修復(fù)期;術(shù)后12周見術(shù)側(cè)聲帶創(chuàng)面局部攣縮凹陷、邊緣不整齊,此時聲帶已完成瘢痕修復(fù)。如前所述,聲帶損傷后,ECM發(fā)生降解與再合成,其膠原纖維、彈性纖維和纖維連接蛋白形態(tài)和含量改變,成纖維細胞增殖活躍,導(dǎo)致肉芽組織過度增生從而瘢痕化。本研究HE染色見術(shù)側(cè)瘢痕聲帶鱗狀上皮層明顯增厚,疏松結(jié)締組織層纖維化,纖維層增厚、排列紊亂,局部成團狀或束狀聚集,肌層亦可見散在纖維束;透射電鏡見間質(zhì)增厚、密度不均,細胞腫脹,細胞間界線不清,細胞核增生、線粒體增多,細胞處于活躍狀態(tài),與聲帶瘢痕化病理過程貼合。

本研究通過高通量測序分析發(fā)現(xiàn)瘢痕聲帶與正常聲帶間基因表達總體上存在較大差異性,瘢痕聲帶較正常聲帶基因表達呈現(xiàn)顯著上調(diào)、顯著下調(diào)和無顯著差異三種趨勢,其中顯著上調(diào)的基因有:IL家族的IL16、IL18和IL33,CCL家族的CCL2、CCL8、CCL13、CCL14、CCL19、CCL20、CCL22和CCL23,CXCL家族的CXCL13和CXCL14,MMPs家族的MMP1、MMP2、MMP12、MMP16、MMP19、MMP25和MMP27,Wnt家族的Wnt8a和Wnt通路抑制劑WIF1、DKK1、DKK2,以及TIMP1、HSP90β1、BMP5和TGFβ2等。MMPs是膠原降解的關(guān)鍵酶,瘢痕形成的早期能降解I、II、III型膠原,其生理狀況下與TIMPs以l∶l比例以非共價連接形成穩(wěn)定復(fù)合物能維持ECM中膠原的動態(tài)平衡,二者動態(tài)平衡打破被認為是皮膚瘢痕形成及肝、腎、下呼吸道纖維化等疾病中的核心事件[12,13]。例如,MMP1表達異常會引起ECM的代謝紊亂,導(dǎo)致結(jié)構(gòu)重塑、瘢痕形成等病理改變[14]。本研究測序發(fā)現(xiàn)包括MMP1在內(nèi)的眾多MMPs家族基因在瘢痕聲帶中高表達,證明MMPs家族基因在聲帶纖維化和瘢痕形成中也發(fā)揮了重要作用。IL33、MMP2和TIMP1常被作為評價肝組織纖維化程度的指標(biāo),其中IL33可通過促進巨噬細胞向M2型轉(zhuǎn)化、誘導(dǎo)包括TGFβ在內(nèi)的多種細胞因子、激活Th2細胞等多種作用誘導(dǎo)并促進纖維化;MMP2激活后可促進基質(zhì)膜降解及血管生成,加速纖維化過程;而TIMP1作為MMP2的抑制劑,在MMP2激活后可被誘導(dǎo)高表達[15]。本研究測序發(fā)現(xiàn)這3種基因在聲帶過度纖維化致使瘢痕形成中也表現(xiàn)為高表達,還發(fā)現(xiàn),CCL家族作為趨化因子,多數(shù)基因呈現(xiàn)高表達參與了ECM的重塑。

綜上所述,本研究通過低溫等離子消融術(shù)成功構(gòu)建了犬聲帶瘢痕模型,并通過高通量測序富集出了與聲帶瘢痕形成密切相關(guān)的多個基因家族,初步篩選出了顯著差異表達的靶基因,為聲帶瘢痕機制的探索和靶點研究的選擇提供了一定的參考價值,但各個靶基因具體的功能定位和靶向調(diào)節(jié)作用以及靶基因及所在信號通路之間是否存在“竄擾”,尚需進一步研究。