宋冠慧,樊丹平,李 艷,劉 紅,潘靜華,王少君,孫 健,樊新榮△

(1. 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心,北京 100700;2. 陜西中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院,陜西咸陽 712046)

良性前列腺增生(benign prostatic hyperplasia,BPH)是引起中老年男性排尿障礙的常見泌尿男科疾病,據(jù)統(tǒng)計(jì),BPH在中老年男性中發(fā)病率較高,極大地降低了患者的生活質(zhì)量[1]。隨著老齡化人口日益增多,罹患BPH的人數(shù)也在逐年增加,研究表明,40歲時(shí)30%～40%的男性患有BPH,而在80歲以上的男性中,BPH的發(fā)病率可增至70%～80%[2]。中醫(yī)認(rèn)為BPH屬于“癃閉” “淋證”等范疇,其基本病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí),中老年男性因腎氣逐漸衰弱,導(dǎo)致腎陽亦虛,陽虛對(duì)血液的推動(dòng)作用減弱,進(jìn)一步出現(xiàn)瘀血內(nèi)生,引起脈絡(luò)瘀阻,故前列腺逐漸增生肥大。BPH在臨床以尿頻、尿失禁、進(jìn)行性排尿困難為特征性表現(xiàn),組織學(xué)方面主要表現(xiàn)為前列腺間質(zhì)和腺體成分增生;解剖學(xué)方面主要表現(xiàn)為前列腺增大;尿動(dòng)力學(xué)方面主要表現(xiàn)為膀胱出口梗阻和下尿路癥狀(lower urinary tract symptoms,LUTS)[3-4]。然而BPH的發(fā)病機(jī)制目前尚未完全明確。目前,雄性激素被認(rèn)為與BPH的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),其他因素如雌雄激素之間的平衡失調(diào)、組織缺氧、局部代謝紊亂、局部炎癥等也與BPH發(fā)病有關(guān)[5]。近期研究表明,核因子E2相關(guān)因子(nuclear factor erythroid2-related factor,Nrf)2介導(dǎo)的氧化應(yīng)激是BPH發(fā)生發(fā)展相關(guān)連鎖反應(yīng)的機(jī)制之一[6]。

克癃膠囊是根據(jù)BPH的病因病機(jī),在金匱腎氣丸基礎(chǔ)上增加黃芪、大豆異黃酮、南瓜子油等組成的化裁方。前期臨床研究發(fā)現(xiàn)克癃膠囊能降低前列腺指數(shù),明顯抑制BPH[7];基礎(chǔ)研究結(jié)果顯示克癃膠囊能夠降低BPH腎虛血瘀證模型大鼠的前列腺濕重和前列腺指數(shù),改善前列腺組織的病理性增生?？笋z囊還能降低BPH腎虛血瘀證模型大鼠血清酸性磷酸酶,調(diào)節(jié)卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone,FSH)、黃體生成素(luteinizing hormone,LH)水平,抑制前列腺組織中由MKI-67基因編碼的核蛋白(Ki-67)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)蛋白及VEGF mRNA的表達(dá)[8-9]。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步從Nrf2信號(hào)通路探討克癃膠囊對(duì)BPH的作用機(jī)制,為克癃膠囊治療BPH提供更多實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究實(shí)驗(yàn)方案已通過中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查,批件編號(hào):ERCCACMS21-2302-03。

1 材料

1.1 動(dòng)物

6～8周齡雄性SD大鼠,體質(zhì)量(200±10)g,購自中國(guó)食品藥品檢定研究院,動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(京)2022-0002。所有大鼠飼養(yǎng)于中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所動(dòng)物房,采用標(biāo)準(zhǔn)飼料分籠飼養(yǎng),動(dòng)物房溫度20～25 ℃,濕度40%～60%,每日定時(shí)添加飼料及飲用水。

1.2 藥物及試劑

克癃膠囊主要由熟地黃、山茱萸、茯苓、牡丹皮等藥物組成。以上藥物采用水提的方法制備后,在真空干燥箱中70 ℃減壓干燥成干浸膏。非那雄胺(貨號(hào):J20150143),規(guī)格5 mg,杭州默沙東制藥有限公司。98%丙酸睪酮(貨號(hào):T818615-5 g)、無菌橄欖油藥用級(jí)(貨號(hào):O815211-500 mL),上海麥克林生化科技股份有限公司;蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin staining,HE)高清恒染套裝(貨號(hào):BLGQ02-06),北京九州柏林生物科技有限公司;睪酮(testosterone,T)ELISA試劑盒(貨號(hào):EK6842)、二氫睪酮(dihydrotestosterone,DHT)ELISA試劑盒(貨號(hào):EK10707)、雌二醇(estradiol,E2)ELISA試劑盒(貨號(hào):EK10510),上海薩博科技生物有限公司;RNA提取試劑(貨號(hào):11141ES10)、逆轉(zhuǎn)錄試劑(貨號(hào):11141ES60),上海翌圣生物科技有限公司;Trizol試劑(貨號(hào):15596018),美國(guó)Invitrogen公司。

1.3 主要儀器

KD-BM型生物組織包埋機(jī),浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司;Finesse ME+型全自動(dòng)石蠟切片機(jī),美國(guó)Thermo公司;Model-3120059型漂片儀,美國(guó)Thermo公司;Model-20061型烤片機(jī),美國(guó)Thermo公司;HSP-BE型恒溫恒濕培養(yǎng)箱,湖南力辰儀器科技有限公司;Synergy H1型酶標(biāo)儀,美國(guó)Bio Tek公司; NanoDrop One型超微量紫外分光光度計(jì),美國(guó)Thermo公司;DM6000B型顯微鏡,美國(guó)Lecia公司;Archimed R4型熒光定量PCR儀,鯤鵬基因(北京)科技有限公司。

2 方法

2.1 BPH模型制備

60只雄性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后,按體質(zhì)量隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組和BPH造模組。參照前期方法,BPH造模組大鼠采用戊巴比妥鈉(45 mg/kg)麻醉后,經(jīng)陰囊切除雙側(cè)睪丸[7-10]。術(shù)后第8天,造模組大鼠經(jīng)背部皮下多個(gè)注射部位交替注射5 mg/kg丙酸睪酮(規(guī)格25 g/L,按1:4溶于無菌橄欖油),給藥體積為1 mL/kg,連續(xù)注射28 d制備BPH模型。

假手術(shù)組大鼠手術(shù)方法同造模組,但僅暴露睪丸不予摘除。所有進(jìn)行手術(shù)操作的大鼠,連續(xù)3 d肌注青霉素(80萬單位/日),以預(yù)防傷口感染。造模組大鼠皮下注射丙酸睪酮時(shí),假手術(shù)組大鼠僅注射無菌橄欖油,給藥體積為1 mL/kg。所有大鼠均連續(xù)注射28 d。

2.2 分組與給藥

術(shù)后第7 天,將造模組大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為模型組、陽性對(duì)照(非那雄胺)組、克癃高劑量組、克癃中劑量組和克癃低劑量組,每組各8只大鼠。陽性對(duì)照組及克癃高、中、低劑量組大鼠予相應(yīng)非那雄胺(0.45 mg/kg)和克癃膠囊(14.4 g/kg,7.2 g/kg,3.6 g/kg)灌胃給藥。正常組、假手術(shù)組及模型組大鼠灌胃等體積的純凈水,均連續(xù)灌胃28 d。給藥結(jié)束后,腹主動(dòng)脈取血并分離血清,取前列腺組織于-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 HE染色

取各組大鼠部分前列腺組織,于4%多聚甲醛溶液中固定,隨后進(jìn)行石蠟包埋、切片、脫蠟和蘇木素、伊紅染色,光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠前列腺組織形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)的變化。

2.4 ELISA檢測(cè)

嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作,測(cè)定各組大鼠血清樣本中T、E2、DHT的表達(dá)水平。

2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

取出凍存的前列腺組織,Trizol法提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA后,進(jìn)行PCR擴(kuò)增。采用2-△△Ct法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。引物Nrf2、NQO1、TNF-α、IL-1β、IL-6和GAPDH由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,見表1。

表1 引物序列表

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 克癃膠囊對(duì)BPH模型大鼠前列腺組織病理的影響

HE染色結(jié)果可見,與正常對(duì)照組和假手術(shù)組比較,模型組大鼠腺上皮呈立方狀或高柱狀,腺腔明顯擴(kuò)張,腔內(nèi)分泌物明顯增加;陽性對(duì)照組和克癃高劑量組大鼠腺上皮多呈立方狀,高柱狀腺上皮的數(shù)量減少,前列腺腺腔擴(kuò)張明顯改善,見圖1。

圖1 克癃膠囊對(duì)前列腺增生(BPH)模型大鼠前列腺組織病理變化的影響(HE×50)

3.2 克癃膠囊對(duì)BPH模型大鼠血清中T、E2和DHT水平的影響

ELISA結(jié)果顯示,正常組與假手術(shù)組大鼠比較血清中T、E2和DHT的表達(dá)差異均未見統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與假手術(shù)組比較,模型組大鼠血清中T和DHT表達(dá)明顯升高(P<0.05),E2表達(dá)明顯降低(P<0.01);與模型組比較,克癃高、中劑量組大鼠血清T和DHT表達(dá)均顯著降低(P<0.05),E2表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05),克癃低劑量組大鼠血清T,DHT和E2表達(dá)水平差異均未見統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見圖2。

注:與假手術(shù)組比較#P<0.05,##P<0.01;與模型組比較*P<0.05,*P<0.01;睪酮(T),雌二醇(E2),二氫睪酮(DHT)圖2 克癃膠囊對(duì)前列腺增生(BPH)模型大鼠血清中T、E2和DHT含量的影響(n=8)

3.3 克癃膠囊對(duì)BPH模型大鼠前列腺組織中Nrf2和NQO1 mRNA水平的影響

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示,正常組與假手術(shù)組比較大鼠前列腺組織中Nrf2和NQO1 的mRNA水平差異未見統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與假手術(shù)組比較,模型組大鼠前列腺組織中Nrf2和NQO1的mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.01);與模型組比較,克癃膠囊高、中劑量組大鼠前列腺組織NQO1 mRNA水平顯著升高(P<0.01),克癃膠囊高、中、低劑量組大鼠前列腺組織中Nrf2 mRNA水平均顯著升高(P<0.05),見圖3。

注:與假手術(shù)組比較##P<0.01;與模型組比較*P<0.05,*P<0.01;核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2),醌氧化還原酶(NQO1)圖3 克癃膠囊對(duì)前列腺增生(BPH)模型大鼠前列腺組織中Nrf2和NQO1mRNA表達(dá)水平的影響(n=8)

3.4 克癃膠囊對(duì)BPH模型大鼠前列腺組織中TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA水平的影響

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示,正常組與假手術(shù)組大鼠比較前列腺組織中TNF-α、IL-1β和IL-6 的mRNA表達(dá)水平差異均未見統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與假手術(shù)組比較,模型組大鼠前列腺組織中TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.01);與模型組比較,克癃高、中、低劑量組大鼠前列腺組織中TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA水平均顯著降低(P<0.05),見圖4。

注:與假手術(shù)組比較##P<0.01;與模型組比較*P<0.05,**P<0.01;腫瘤壞死因子(TNF),白細(xì)胞介素(IL)圖4 克癃膠囊對(duì)前列腺增生(BPH)模型大鼠前列腺組織中TNF-α、IL-1β和IL-6mRNA水平的影響(n=8)

4 討論

BPH以尿頻、尿失禁、進(jìn)行性排尿困難為特征性表現(xiàn)。隨著我國(guó)人口老齡化趨勢(shì)的加重,BPH及相關(guān)的LUTS已經(jīng)嚴(yán)重影響了老年男性的身心健康和生活質(zhì)量。

目前學(xué)者普遍認(rèn)為雄性激素與BPH的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),其他因素如間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化、組織缺氧、細(xì)胞增殖/凋亡失衡、局部代謝紊亂等也與BPH相關(guān)[5]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為BPH主要的病機(jī)為腎虛血瘀,所以益腎陽和通瘀血是其根本治療原則?？笋z囊是根據(jù)BPH的病因病機(jī),基于“陽化氣,陰成形”“氣虛乃陽虛之漸,陽虛乃氣虛之甚”及“截?cái)嗯まD(zhuǎn)”理論,在金匱腎氣丸基礎(chǔ)上增加了黃芪、大豆異黃酮、南瓜子油等組成的化裁方[7]。前期臨床研究已經(jīng)證實(shí),克癃膠囊可以降低BPH患者的前列腺癥狀評(píng)分,使BPH患者增大的前列腺體積減小,增加患者的最大尿流率,減少患者的剩余尿量[7]。在本實(shí)驗(yàn)研究中,克癃膠囊高劑量可明顯改善BPH模型大鼠前列腺組織中前列腺腺腔擴(kuò)張,減少高柱狀腺上皮的數(shù)量。激素水平方面,克癃膠囊可以抑制BPH模型大鼠血清中T和DHT的表達(dá),升高E2的表達(dá)水平。

作為抗氧化應(yīng)激和外源性損傷重要的細(xì)胞防御機(jī)制之一[11],Nrf2/抗氧化反應(yīng)元件(antioxidative-responsive elements,ARE)通路能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞抗氧化酶基因的轉(zhuǎn)錄,維持氧化還原平衡[12]。在正常生理狀態(tài)下,Nrf2與其阻遏物KELCH樣ECH關(guān)聯(lián)蛋白(Kelch Like ECH associated protein,KEAP)1重組蛋白結(jié)合,致使Nrf2泛素化,與活性氧形成動(dòng)態(tài)平衡。而在氧化應(yīng)激期間,Nrf2與KEAP1解離,游離的和新合成的Nrf2轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞核,激活下游ARE依賴性基因的表達(dá),包括超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、還原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)、血紅素氧合酶(hemeoxygenase,HO)-1和醌氧化還原酶[nad (ph) quinone oxidoreductase,NQO]1等[12]。除了抵抗氧化應(yīng)激反應(yīng),Nrf2的激活還可抑制機(jī)體的炎癥反應(yīng)。Eri H等發(fā)現(xiàn)Nrf2通路的激活通過抑制小鼠炎癥模型中促炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-6基因轉(zhuǎn)錄的誘導(dǎo),減輕了炎癥表型。Nrf2的激活也可防止脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)的促炎細(xì)胞因子(包括IL-6和IL-1β)的轉(zhuǎn)錄上調(diào)[13]。研究表明,Nrf2介導(dǎo)的氧化應(yīng)激是BPH發(fā)生發(fā)展相關(guān)連鎖反應(yīng)的機(jī)制之一[6]。有研究發(fā)現(xiàn),氧化應(yīng)激介導(dǎo)和誘發(fā)的脂質(zhì)過氧化及細(xì)胞增殖會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞突變和增殖分化,這會(huì)導(dǎo)致前列腺細(xì)胞的異常增殖與重塑,最終引起B(yǎng)PH的發(fā)生發(fā)展[14]。Pace等[14]發(fā)現(xiàn)BPH患者體內(nèi)的抗氧化酶活性顯著降低,氧化應(yīng)激和DNA損傷水平明顯升高,提示氧化損傷會(huì)導(dǎo)致BPH的發(fā)生發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn),BPH模型大鼠前列腺組織中Nrf2和NQO1的mRNA表達(dá)水平顯著降低,說明BPH模型大鼠的抗氧化應(yīng)激能力受到抑制,而克癃膠囊能夠使BPH模型大鼠前列腺組織中Nrf2和NQO1的mRNA表達(dá)水平上調(diào),這可能是克癃膠囊治療BPH另外一個(gè)潛在機(jī)制。

同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn):大多數(shù)BPH患者的前列腺組織中均有一定程度的炎細(xì)胞浸潤(rùn),說明前列腺慢性炎癥參與了BPH的發(fā)展,有相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)慢性炎癥引起前列腺局部組織代償性細(xì)胞增殖,進(jìn)而打破細(xì)胞增殖和凋亡之間的平衡[15-16]。前列腺增生組織內(nèi)的炎癥也可以促進(jìn)血管新生,從而促使前列腺增生。在一項(xiàng)納入8 224名BPH患者的臨床研究中,經(jīng)組織活檢,研究者發(fā)現(xiàn)超過70 %的BPH患者合并增生組織的慢性炎癥,且這些患者的國(guó)際前列腺癥狀評(píng)分(international prostate syptom score,IPSS)和前列腺體積顯著高于或大于非炎癥組BPH患者[17]。另一項(xiàng)納入4 109名BPH患者的研究發(fā)現(xiàn),前列腺組織的慢性炎癥與較高基線的IPSS評(píng)分及較大的前列腺體積相關(guān),相較于前列腺組織無炎癥的BPH患者,存在慢性炎癥的BPH患者被證明有更大的前列腺體積,更嚴(yán)重的LUTS以及更高的急性尿潴留風(fēng)險(xiǎn)[18]。一項(xiàng)BPH的臨床研究發(fā)現(xiàn):非甾體類消炎藥可以緩解BPH患者的臨床癥狀,這提示開發(fā)具有抗炎作用的新型藥物可能是治療BPH的新方向[19]。以上研究表明前列腺慢性炎癥與BPH發(fā)展存在較強(qiáng)的正相關(guān)性,但慢性炎癥參與BPH發(fā)展的機(jī)制尚未明確。在本研究中,BPH模型大鼠前列腺組織中炎癥因子TNF-α,IL-1β和IL-6 mRNA水平明顯升高,這可能是慢性炎癥參與BPH發(fā)展的機(jī)制之一,克癃膠囊則可以降低BPH模型大鼠前列腺組織中炎癥因子TNF-α,IL-1β和IL-6的mRNA水平,達(dá)到抑制炎癥的作用。

綜上所述,克癃膠囊作為一種中藥復(fù)方制劑,可以通過促進(jìn)抗氧化應(yīng)激因子的表達(dá),并抑制炎癥因子的表達(dá),最終達(dá)到治療BPH的效果,驗(yàn)證了克癃膠囊治療BPH的療效和可能的作用機(jī)制,為克癃膠囊治療BPH提供了進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。