苗 青,王瑞海,李玉波,劉麗梅

(中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所,北京 100700)

腦卒中是由于腦血管破裂出血和腦血管堵塞影響腦部供血,從而引起腦組織損傷的急性腦血管疾病,是我國成人致死、致殘的首位病因[1-2]。缺血性腦卒中(ischemic stroke, IS)為腦卒中的主要亞型,近30年來IS的年齡標(biāo)準(zhǔn)化發(fā)病率增加了34.7%,且仍呈現(xiàn)出持續(xù)上升的趨勢[3]。目前,IS的臨床治療多集中在溶栓和神經(jīng)保護(hù)方面,受時間窗較窄、作用靶點(diǎn)單一等問題的影響,治療藥物仍然有限。方劑具有多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的作用特點(diǎn),其與西藥聯(lián)合應(yīng)用在治療IS中突顯獨(dú)特優(yōu)勢,目前備受關(guān)注。

通脈顆粒最早收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑》第四冊[4],之后轉(zhuǎn)為國家藥品標(biāo)準(zhǔn),由丹參、川芎、葛根3味藥以1:1:1的比例配伍組成,具有活血通脈的功效。臨床研究發(fā)現(xiàn),通脈顆粒聯(lián)合尿激酶溶栓治療后,臨床總有效率從69.5%提高到94.59%,神經(jīng)功能缺損評分由(14.86±5.45)分降低到(11.42±4.97)分[5]。這表明通脈顆粒與溶栓藥物合用,可顯著增強(qiáng)患者的溶栓治療效果,有效恢復(fù)腦部神經(jīng)功能,明顯改善患者預(yù)后。目前,關(guān)于通脈顆粒治療IS作用機(jī)制的研究較少,有必要作進(jìn)一步的系統(tǒng)分析。因此,本研究將通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析挖掘通脈顆粒治療IS的潛在作用靶點(diǎn)和通路,并對其進(jìn)行動物實(shí)驗驗證。本研究可為今后指導(dǎo)通脈顆粒臨床用藥和進(jìn)一步開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

1.1 通脈顆粒潛在活性成分及作用靶點(diǎn)篩選

在TCMSP數(shù)據(jù)庫(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)和TCMIP數(shù)據(jù)庫(http://www.tcmip.cn/TCMIP/index.php/Home/Login/login.html)中檢索丹參、川芎、葛根3味中藥的化學(xué)成分,根據(jù)口服生物利用度(oral bioavailability, OB)≥30%和類藥性(drug-likeness, DL)≥0.18,并結(jié)合《中華人民共和國藥典》2020年版[6]及文獻(xiàn)[7-18]補(bǔ)充完善各味中藥的化學(xué)成分,去除重復(fù)后,篩選出通脈顆粒的潛在活性成分。同時,通過TCMSP數(shù)據(jù)庫和TCMIP數(shù)據(jù)庫查詢潛在活性成分的作用靶點(diǎn),應(yīng)用UniProt數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)以物種為“Homo sapiens”將靶點(diǎn)名字規(guī)范化,剔除非人源、不規(guī)范的靶點(diǎn)。

1.2 缺血性腦卒中相關(guān)靶點(diǎn)篩選

以“ischemic stroke”“cerebral ischemia”“stroke”等為關(guān)鍵詞,在GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)、Drugbank數(shù)據(jù)庫(https://go.drugbank.com /drugs)、TTD數(shù)據(jù)庫(https://db.idrblab.net/ttd/)和OMIM數(shù)據(jù)庫(https://www.omim.org/)收集缺血性腦卒中的相關(guān)靶點(diǎn)。其中,GeneCards數(shù)據(jù)庫中選取Score大于中位數(shù)的目標(biāo)靶點(diǎn)作為IS靶點(diǎn)。采用Uniprot數(shù)據(jù)庫對收集的靶點(diǎn)進(jìn)行靶點(diǎn)-人類基因名轉(zhuǎn)換,去除重復(fù)靶點(diǎn)后,構(gòu)建IS疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫。

1.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction, PPI)網(wǎng)絡(luò)建構(gòu)及核心靶點(diǎn)預(yù)測

將通脈顆粒的預(yù)測作用靶點(diǎn)與IS相關(guān)靶點(diǎn)導(dǎo)入VENNY 2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)繪制韋恩圖,得到藥物與疾病的交集靶點(diǎn)。將交集靶點(diǎn)上傳至STRING 11.5(https://string-db.org/),設(shè)置物種為“Homo sapiens”,靶點(diǎn)間最小相互作用閾值設(shè)置為medium confidence(0.400)。將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.8構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)并依據(jù)Degree、Betweenness、Closeness進(jìn)行拓?fù)浞治?以Degree≥2倍中位數(shù)并結(jié)合Betweenness、Closeness均大于等于中位數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)篩選核心靶點(diǎn)。

1.4 通脈顆粒治療IS靶點(diǎn)的富集分析

將上述獲得的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/),設(shè)置物種為“Homo sapiens”,進(jìn)行GO富集分析和KEGG富集分析。富集分析結(jié)果依據(jù)Pvalue<0.05進(jìn)行篩選、排序,并使用微生信軟件(http://www.bioinformatics.com.cn/)進(jìn)行可視化。

2 動物實(shí)驗

2.1 動物

SD雄性大鼠,體質(zhì)量(200±10)g,購于斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司,動物許可證號SCXK(京)2019-0010。實(shí)驗前大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,飼養(yǎng)條件為自然晝夜節(jié)律光照,溫度22～25 ℃,相對濕度40%～50%,自由飲水進(jìn)食。本實(shí)驗已通過中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所實(shí)驗動物倫理委員會審查批準(zhǔn),批件編號:IBTCMCACMS21-2211-01。

2.2 主要試藥與儀器

通脈顆粒(神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司,批號:22021021);陽性對照藥腦心通膠囊(陜西步長制藥有限公司,批號:211169);白細(xì)胞介素(interleukin, IL)-6試劑盒、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor , TNF)-α試劑盒、IL-4試劑盒、IL-10試劑盒(泉州市睿信生物科技有限公司,貨號:20230101-RX302856R、20230101-RX302058R、20230101-RX302858R、20230101-RX302880R);Iba-1抗體(英國Abcam公司,貨號:ab178847)。3K15型高速冷凍離心機(jī)(德國Sigma公司);U-LH100HG型電子顯微鏡(日本奧林巴斯有限公司);FLx800TM型熒光發(fā)光酶標(biāo)儀(美國Bio Tek公司);KZ-Ⅱ勻漿儀(武漢賽維爾生物科技有限公司)。

2.3 造模、分組與給藥

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,采用大腦中動脈栓塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)法復(fù)制IS模型[19]。依據(jù)Longa評分法[20]對各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評分。0分-正常,無神經(jīng)損害的癥狀;1分-不能伸展腦缺血對側(cè)的前肢;2分-向缺血對側(cè)轉(zhuǎn)圈;3分-向缺血對側(cè)傾倒;4分-不能自發(fā)行走,意識喪失。選擇分值在1～3分的30只大鼠,隨機(jī)分為5組:模型組、陽性對照組(腦心通膠囊)、通脈顆粒低劑量組(1.35 g/kg)、通脈顆粒中劑量組(2.7 g/kg)和通脈顆粒高劑量組(5.4 g/kg),另取6只正常大鼠作為假手術(shù)組。各給藥組大鼠給予相應(yīng)的藥物灌胃7 d,假手術(shù)組和模型組大鼠給予等體積蒸餾水灌胃。

2.4 神經(jīng)功能缺損評分

末次給藥后,參照Longa評分法對各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分。

2.5 腦組織病理學(xué)觀察

對各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評分后,分別取腦,4%多聚甲醛固定。將固定好的腦組織進(jìn)行石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色后,進(jìn)行腦組織皮層病理學(xué)觀察。

2.6 免疫熒光染色

將4%多聚甲醛固定的大鼠腦組織包埋,制備4 μm冠狀切片。腦切片經(jīng)室溫下Triton X-100破膜、山羊血清封閉后,滴加一抗,即Iba-1抗體(1:200),4 ℃孵育過夜;次日加入二抗于37 ℃下避光孵育;4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)封片,于熒光顯微鏡下觀察皮層小膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)情況并采集圖像。

2.7 炎癥因子檢測

按照ELISA試劑盒說明書,分別檢測各組大鼠腦組織皮層IL-6、TNF-α、IL-4和IL-10水平。

2.8 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 通脈顆粒治療缺血性腦卒中的靶點(diǎn)預(yù)測結(jié)果

通過檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫和TCMIP數(shù)據(jù)庫進(jìn)行OB、DL篩選,并結(jié)合《中華人民共和國藥典》2020年版及文獻(xiàn)報道,補(bǔ)充丹參、川芎、葛根中不符合篩選標(biāo)準(zhǔn)的其他活性較強(qiáng)的成分,如表1所示,最終獲得87個通脈顆粒的潛在活性成分(丹參64個,川芎12個,葛根11個),360個作用靶點(diǎn)[21]。將GeneCards數(shù)據(jù)庫、Drugbank數(shù)據(jù)庫、TTD數(shù)據(jù)庫和OMIM數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果合并,獲得IS相關(guān)靶點(diǎn)649個。將通脈顆粒的預(yù)測作用靶點(diǎn)與IS相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行映射,如圖1所示,得到115個交集靶點(diǎn)。

圖1 通脈顆粒治療缺血性腦卒中的潛在靶點(diǎn)韋恩圖

表1 通脈顆粒的潛在活性成分

3.2 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析結(jié)果

將通脈顆粒的預(yù)測作用靶點(diǎn)與IS相關(guān)靶點(diǎn)的115個交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 11.5,獲得蛋白質(zhì)間的相互作用關(guān)系。去除無連接節(jié)點(diǎn),共得到關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)115個和575條邊。將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò),根據(jù)拓?fù)浞治鲆訢egree≥116,并結(jié)合Betweenness≥3.92×10-3、Closeness≥0.49,篩選出排列前5的關(guān)鍵靶點(diǎn),分別為IL-6、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶AKT(serine/threonine-protein kinase AKT, AKT)1、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)、β-肌動蛋白(beta-actin, ACTB)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor A, VEGFA),推測這些靶點(diǎn)可能是通脈顆粒作用于IS的關(guān)鍵靶點(diǎn)。并以此推出相對應(yīng)的有效化學(xué)成分,構(gòu)建藥物-潛在活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖,見圖2。

圖2 通脈顆粒治療缺血性腦卒中的藥物-潛在活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

3.3 富集分析結(jié)果

GO富集分析共得到851個條目,其中包含660個生物過程(biological process, BP)、83個細(xì)胞組分(cell component, CC)、108個分子功能(molecular function, MF),分別選取前10條使用微生信軟件進(jìn)行可視化,結(jié)果如圖3所示,BP主要涉及對外來生物刺激反應(yīng)(response to xenobiotic stimulus)、對缺氧反應(yīng)(response to hypoxia)、對脂多糖的反應(yīng)(response to lipopolysaccharide)、血管新生(angiogenesis)、負(fù)調(diào)控凋亡過程(negative regulation of apoptotic process)等生物過程,CC主要涉及質(zhì)膜(plasma membrane)、細(xì)胞外空間(extracellular space)、細(xì)胞表面(cell surface)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔(endoplasmic reticulum lumen)、突觸(synapse)等細(xì)胞組分,MF主要涉及酶結(jié)合(enzyme binding)、蛋白結(jié)合(protein binding)、電壓門控鈣通道活性(voltage-gated calcium channel activity)、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合(transcription factor binding)、細(xì)胞因子活性(cytokine activity)等分子功能。

圖3 GO功能富集分析結(jié)果

KEGG富集分析共得到161條通路,選取前20條使用微生信軟件進(jìn)行可視化,結(jié)果如圖4所示,通脈顆粒作用于缺血性腦卒中的作用機(jī)制可能與Calcium信號通路、Fluid shear stress and atherosclerosis、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase, MAPK)信號通路、磷脂酰肌醇-3-激酶-絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶AKT(phosphatidylinositide 3-kinases-serine/threonine-protein kinase AKT, PI3K-Akt)信號通路、TNF信號通路等有關(guān)。

圖4 KEGG富集分析結(jié)果

3.4 通脈顆粒對IS大鼠神經(jīng)功能評分的影響

如圖5所示,末次給藥后,對各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評分發(fā)現(xiàn),假手術(shù)組大鼠未見神經(jīng)功能損傷;模型組大鼠均表現(xiàn)出嚴(yán)重的神經(jīng)功能損傷癥狀(P<0.05),如左側(cè)肢體無力,行走時身體向左側(cè)偏斜或旋轉(zhuǎn),甚至不能自發(fā)行走,提尾懸空時左前肢屈曲;與模型組比較,各給藥組大鼠活動增多,神經(jīng)功能明顯改善,各組大鼠神經(jīng)功能評分均不同程度降低(P<0.05),特別是通脈顆粒中、高劑量組,表明通脈顆粒可減輕IS大鼠的神經(jīng)功能損傷。

注:與假手術(shù)組比較*P<0.01;與模型組比較#P<0.05,##P<0.01圖5 通脈顆粒對各組大鼠神經(jīng)功能評分的影響

3.5 通脈顆粒對IS大鼠腦組織病理變化的影響

如圖6所示,假手術(shù)組大鼠腦組織皮層細(xì)胞形態(tài)規(guī)則、排列整齊,未見炎性細(xì)胞浸潤和水腫;模型組大鼠可見明顯梗死灶,細(xì)胞排列疏松紊亂,細(xì)胞核固縮深染,細(xì)胞質(zhì)呈空泡化,伴有小膠質(zhì)細(xì)胞增生和炎性細(xì)胞浸潤;與模型組比較,各給藥組大鼠腦組織梗死灶明顯縮小,其中通脈顆粒高劑量組大鼠腦組織細(xì)胞排列相對整齊,細(xì)胞核較清晰,水腫和炎性細(xì)胞浸潤明顯減少。

A.假手術(shù)組;B.模型組;C.陽性對照組;D.低劑量組;E.中劑量組;F.高劑量組圖6 通脈顆粒對缺血性腦卒中大鼠腦組織病理變化的影響(HE ×100)

3.6 通脈顆粒對IS大鼠腦組織小膠質(zhì)細(xì)胞的影響

如圖7所示,假手術(shù)組大鼠皮層小膠質(zhì)細(xì)胞呈靜息狀態(tài),胞體較小、分支較長;模型組大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞大多胞體變大,表面突起變短,呈典型的阿米巴狀,表明小膠質(zhì)細(xì)胞極化程度變高,多數(shù)細(xì)胞趨向于轉(zhuǎn)化為M1型小膠質(zhì)細(xì)胞,不同濃度的通脈顆粒處理后,M1型小膠質(zhì)細(xì)胞減少,阿米巴狀變化出現(xiàn)一定改善,表明通脈顆?？梢种菩∧z質(zhì)細(xì)胞極化。

圖7 通脈顆粒對缺血性腦卒中大鼠腦組織Iba1表達(dá)的影響(×100)

3.7 通脈顆粒對IS大鼠腦組織皮層中炎癥因子的影響

如圖8所示,與假手術(shù)組比較,模型組大鼠腦組織中IL-6和TNF-α表達(dá)顯著升高(P<0.01),IL-4和IL-10表達(dá)顯著降低(P<0.01);與模型組比較,通脈顆粒中、高劑量組大鼠腦組織中IL-6和TNF-α表達(dá)均顯著降低(P<0.05),IL-4、IL-10的表達(dá)均顯著升高(P<0.05)。

注:與假手術(shù)組比較*P<0.01;與模型組比較#P<0.05,##P<0.01;白細(xì)胞介素(IL),腫瘤壞死因子(TNF)圖8 通脈顆粒對各組大鼠腦組織炎癥因子表達(dá)水平的影響

4 討論

通脈顆粒主要適應(yīng)證為缺血性心腦血管疾病,主要針對經(jīng)絡(luò)之氣虛血瘀證而立,已批準(zhǔn)上市并應(yīng)用于臨床20余年。方中丹參為活血化瘀藥之首,專行脈絡(luò)閉塞,為君藥[22];川芎行氣活血,氣行則血行,助君藥活血化瘀,為臣藥[23];葛根升舉清陽,通經(jīng)活絡(luò),配伍丹參能增強(qiáng)祛瘀生新之力,配伍川芎則補(bǔ)而不滯[24]。丹參為血藥,川芎為血中氣藥,葛根為氣藥,三藥合用共奏益氣活血、化瘀通絡(luò)之功,并根據(jù)各自的功效特點(diǎn)分別對應(yīng)不同癥狀或病因,在不同環(huán)節(jié)相輔相成,活血、行氣、升陽,以達(dá)到氣行血和、活血通脈之效[25]。

本研究中采用MCAO法復(fù)制IS大鼠模型,造模后大鼠表現(xiàn)出嚴(yán)重的神經(jīng)功能損傷;給予通脈顆粒干預(yù)后,大鼠神經(jīng)功能損傷減輕,提示通脈顆?？擅黠@改善IS大鼠神經(jīng)功能。為進(jìn)一步系統(tǒng)分析通脈顆粒治療IS的作用機(jī)制,本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析初步篩選出通脈顆粒作用于IS的關(guān)鍵靶點(diǎn)IL-6、AKT1、TNF、ACTB、VEGFA,發(fā)現(xiàn)可能的作用機(jī)制與MAPK、PI3K-Akt、TNF、IL-17等信號通路有關(guān)。臨床研究發(fā)現(xiàn),IS患者預(yù)后不良與炎癥標(biāo)志物水平升高密切相關(guān)[26],故網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果提示通脈顆粒治療IS的作用機(jī)制可能與其抑制炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。

炎癥反應(yīng)是腦缺血后繼發(fā)性腦損傷的關(guān)鍵因素,減輕炎癥損傷是改善IS預(yù)后的關(guān)鍵。腦缺血發(fā)生后,腦內(nèi)的免疫細(xì)胞被迅速激活,刺激中樞神經(jīng)系統(tǒng)并釋放趨化因子,招募外周的中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞向受損的腦組織遷移,合成分泌一系列炎性細(xì)胞因子,加劇炎癥反應(yīng),進(jìn)一步引起神經(jīng)元受損,加重神經(jīng)功能損傷[27-28]。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)固有的免疫細(xì)胞,參與IS的病理生理過程,是抵御腦損傷的第一道防線[29]。腦缺血發(fā)生后,小膠質(zhì)細(xì)胞被迅速活化,分為促炎型M1和抗炎型M2兩種表型。M1型小膠質(zhì)細(xì)胞具有吞噬、殺滅病原體的功能,但同時產(chǎn)生大量TNF-α、IL-6等促炎因子引起炎癥反應(yīng),加重神經(jīng)功能損傷;M2型小膠質(zhì)細(xì)胞主要產(chǎn)生IL-4、IL-10等,抑制炎癥反應(yīng)并促進(jìn)組織修復(fù)[30-32]。由此可見,小膠質(zhì)細(xì)胞對IS具有雙重調(diào)節(jié)作用,以不同的表型調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn),假手術(shù)組小膠質(zhì)細(xì)胞呈胞體小、分支長的狀態(tài),模型組小膠質(zhì)細(xì)胞胞體變大、分支變短,呈阿米巴樣,表明小膠質(zhì)細(xì)胞被激活,并趨向于M1型極化;通脈顆粒干預(yù)后,小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變,阿米巴狀變化有一定改善。同時,本研究對炎癥因子IL-6、TNF-α、IL-4和IL-10的表達(dá)水平進(jìn)行檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)通脈顆?？娠@著降低大鼠腦組織中IL-6、TNF-α的表達(dá)水平,顯著升高IL-4和IL-10的表達(dá)水平,進(jìn)一步驗證了通脈顆?？筛淖冃∧z質(zhì)細(xì)胞的活化狀態(tài),減輕腦組織炎癥反應(yīng),有助于改善神經(jīng)功能損傷;同時,動物實(shí)驗的結(jié)果與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測的通脈顆粒治療IS的關(guān)鍵靶點(diǎn)包括IL-6、TNF-α相一致。

綜上所述,采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對通脈顆粒治療IS的作用機(jī)制進(jìn)行了系統(tǒng)研究,并通過動物實(shí)驗驗證了通脈顆粒可抑制炎癥因子的表達(dá),改善神經(jīng)功能損傷,其作用機(jī)制可能與調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)相關(guān)。研究結(jié)果為今后指導(dǎo)通脈顆粒臨床用藥和進(jìn)一步開發(fā)提供了科學(xué)依據(jù)與實(shí)驗支撐。但本研究仍存在一定的局限性,后續(xù)將對通脈顆粒干預(yù)后小膠質(zhì)細(xì)胞的表型進(jìn)行深入分析,為本研究的預(yù)測結(jié)果提供更加嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗數(shù)據(jù)。