劉婷婷,張擎宇,趙香順,石運來,于燕南,王正文,陳少宗△,楊添淞,5,6△

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),哈爾濱 150040;2.濟南醫(yī)院,濟南 250013;3.山東中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院,濟南 250355;4.山東中醫(yī)藥大學(xué)針灸研究院,濟南 250355;5.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院,哈爾濱 150040;6.黑龍江省中醫(yī)藥信息學(xué)重點實驗室,哈爾濱 150040)

腸易激綜合征(irritable bowel syndrome,IBS)是臨床常見慢性胃腸道功能紊亂疾病,發(fā)病病因可能與胃腸道功能異常、精神心理刺激等有關(guān)[1]。臨床癥狀主要表現(xiàn)為腹痛、腹部不適、大便性狀以及排便習(xí)慣改變等腸道癥狀,并伴有心悸、抑郁、焦慮等腸外表現(xiàn)和精神癥狀[2-3]。IBS發(fā)病率呈逐年上升趨勢且病程纏綿難愈[4],病因及發(fā)病機制尚未完全闡明,目前現(xiàn)代醫(yī)學(xué)根據(jù)主要癥狀進行藥物干預(yù)治療,但治療效果不佳[5-6]。近年來,越來越多的臨床研究表明,針灸治療IBS療效顯著[7],并且優(yōu)于常規(guī)藥物[8]。根據(jù)課題組前期經(jīng)驗和結(jié)果,本實驗運用急慢性應(yīng)激聯(lián)合方法制備IBS動物模型,以高架十字迷宮、結(jié)腸痛敏閾值、血清5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)、結(jié)腸5-羥色胺4受體(5-hydroxytryptamine 4 receptor,5-HT4R)蛋白表達為指標(biāo),初步探討電針“天樞”配伍“上巨虛”對IBS大鼠模型行為學(xué)和結(jié)腸功能調(diào)節(jié)的影響是否具有協(xié)同或疊加效應(yīng)。本實驗獲得實驗動物福利倫理審查委員會的批準(zhǔn),批件編號:SDUTCM20200620001。

1 材料

1.1 動物

選用體質(zhì)量(200±20)g的雄性清潔級Wistar大鼠,購于濟南朋悅實驗動物繁育有限公司,動物許可證號:SCXK(魯)20190003。所有大鼠于山東中醫(yī)藥大學(xué)實驗中心飼養(yǎng),保持室內(nèi)安靜,12 h/12 h晝夜節(jié)律循環(huán),水和食物均可自由攝取。

1.2 主要試劑

蛋白預(yù)制膠(貨號:Gel41212),南京艾思易生物科技有限公司;兔抗GAPDH單克隆抗體(貨號:10494-1-AP),美國Proteintech公司;5-HT4R多克隆抗體(貨號:ab60359),英國Abcam公司;山羊抗兔二抗(貨號:SA00001-2),美國Proteintech公司;5-HT 試劑盒(貨號:JYM0326Ra),武漢基因美生物科技有限公司。

1.3 主要器材

華佗牌針灸針,0.25 mm×13 mm型,蘇州醫(yī)療用品廠有限公司;華佗牌電針儀,SDZ-Ⅱ型,蘇州醫(yī)療用品廠有限公司;冷凍型高通量組織研磨器,寧波新芝生物科技股份有限公司;Eppendorf5425型高速離心機,山東奧恒生物科技有限公司;Multiskan FC型全自動酶標(biāo)儀,美國Thermofisher公司;Fusion solos S系列化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng),德國VILBER LOURMAT公司;伯樂PowerPac Basi型電泳儀,美國Bio-Rad公司;XR-XG201型高架十字迷宮,上海欣軟信息科技有限公司;30系列Powerlab實驗數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng),澳大利亞AD Instruments公司。

2 方法

2.1 模型制備

實驗按照隨機原則,將大鼠分為空白組(10只)和造模組(45只),造模組大鼠采用慢性應(yīng)激和急性應(yīng)激聯(lián)合法制備IBS模型。參照文獻方法[9-10],將大鼠暴露于不同的應(yīng)激因素:①斷食24 h、②晝夜顛倒12 h、③斷水24 h、④夾尾5 min、⑤冰水游泳5 min、⑥鼠籠45°傾斜、⑦慢性避水應(yīng)激1 h,連續(xù)干預(yù)造模10 d。

2.2 模型評價及分組

造模10 d結(jié)束后,運用腹壁撤回反射(abdominal withdrawal reflex,AWR)半定量評分對造模組大鼠進行模型評價[11-12]。將自制的球囊經(jīng)導(dǎo)管置入大鼠直腸,深度大約6～7 cm;導(dǎo)管另一端用三通管分別連接血壓計和注射器,待大鼠情緒穩(wěn)定后,進行結(jié)直腸擴張刺激和AWR評分。通過注射器緩慢向氣囊注入空氣,當(dāng)血壓計顯示為40 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)時停止注入空氣,觀察大鼠行為反應(yīng)情況。AWR評分標(biāo)準(zhǔn)[13]:對結(jié)腸擴張刺激無行為反應(yīng),評為0分;給予刺激大鼠有動作停頓后并見短暫的頭部運動行為,評為1分;刺激期間見有腹部肌肉的收縮,評為2分;如有腹部抬起行為,評為3分;身體拱起,并抬起盆腔和陰囊者,評為4分。AWR半定量評分大于等于3分,即判定大鼠造模成功。經(jīng)過AWR評估其造模成功率可達到55%,將確定制備成功的大鼠隨機分為模型組(8只)、天樞組(8只)、天樞配伍上巨虛組(8只)。

2.3 電針干預(yù)

穴位定位參考《實驗針灸學(xué)實驗指導(dǎo)》:“天樞”位于神闕穴(劍突與恥骨聯(lián)合的上2/3與下1/3交點處)旁開 5 mm 處;“上巨虛”位于膝關(guān)節(jié)后外側(cè),腓骨小頭下約10 mm處[14]。

按照針刺穴位需求的體位(仰臥位)將電針組大鼠固定在自制平臺上,選用0.25 mm×13 mm針灸針分別對“天樞”“上巨虛”進行針刺,深度分別為3 mm和5 mm,電針參數(shù)設(shè)置為2 Hz、1 mA,連續(xù)波,1次/d,20 min/次,針刺14 d。空白組大鼠正常喂養(yǎng),不做任何處理,模型組大鼠僅每天與電針組大鼠使用相同方法進行抓取-捆綁,但不給予電針干預(yù)。

2.4 高架十字迷宮(elevated plus maze,EPM)實驗

每只Wistar大鼠需要進行3次行為學(xué)的檢測,即造模前、造模10 d后、14 d電針干預(yù)治療后。實驗開始前,減少抓握帶來的應(yīng)激對實驗結(jié)果產(chǎn)生影響,抓握大鼠實驗人員對大鼠撫摸2～3 min,實驗開始時,一名實驗人員放置好大鼠后迅速遠離,大鼠進入高架十字迷宮的同時,另一名實驗人員觀察視頻,記錄5 min內(nèi)大鼠在高架十字迷宮內(nèi)進入開臂(open arm entry,OE)次數(shù)和開臂時間(open arm time,OT),進入閉臂(close arm entry,CE)次數(shù)和時間(close arm time,CT)。

依據(jù)上述指標(biāo)并參照相關(guān)文獻[15],計算開臂進入次數(shù)百分比[OE%=OE/(OE+CE)×100%]和開臂停留時間百分比[OT%=OT/(OT+CT)×100%],OE%<20%、OT<25%即判定為大鼠焦慮狀態(tài)。

2.5 結(jié)直腸痛敏閾值測定

第3次行為學(xué)實驗檢測后,對各組大鼠進行結(jié)直腸痛敏閾值的檢測。此實驗開始前,所有大鼠禁食不禁水,以此減少大便的形成。待大鼠腹腔注射麻醉后將其取仰臥位,暴露腹直肌,兩根電極絲植入到距腹正中線1.5 cm處;再將自制氣囊經(jīng)大鼠肛門插入6～7 cm處;給氣囊緩慢注氣后,通過置于腹直肌的兩根電極引出肌電信號。運用Powerlab數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng),觀察并記錄兩組大鼠在不同擴張壓力下腹直肌放電活動。

結(jié)直腸痛敏測定[16]:設(shè)定結(jié)直腸擴張時, 腹直肌放電超過基礎(chǔ)放電的10%為有顯著反應(yīng), 放電明顯增加時的結(jié)直腸擴張最小壓力值即為結(jié)直腸痛敏值。

2.6 處死與取材

待大鼠腹外斜肌放電測定后,迅速剪開大鼠胸腔,抽取血液后靜置進行離心,-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩４笫笕⊙谑覝仂o置過程中,0.9%氯化鈉溶液進行灌注,直至大鼠四肢發(fā)白,取出結(jié)腸并沖凈腸容物,-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.7 ELISA檢測血清5-HT含量

測定前使血清樣本置于室溫中復(fù)溶并平衡15～30 min后方可進行實驗,每組選取6個血清樣本,具體步驟嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

2.8 Western blot檢測結(jié)腸組織5-HT4R蛋白表達

采用免疫蛋白印跡法檢測各組樣本的蛋白表達,每組選取4個結(jié)腸組織樣本,將各組蛋白上樣,電泳60 min,轉(zhuǎn)膜70 min,5%奶粉封閉2 h,清洗3次×10 min,孵育5-HT4R(稀釋濃度1∶800)一抗,4 ℃過夜;清洗3次×10 min,孵育二抗(稀釋濃度1∶10 000),室溫2 h,洗凈未結(jié)合二抗。ECL試劑盒顯影,用凝膠成像系統(tǒng)自動曝光顯影。

2.9 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠EPM測試行為變化比較

與空白組比較,模型組大鼠開臂進入次數(shù)百分比(OE%)和開臂停留時間百分比(OT%)明顯降低(OE%<20%,OT%<20%,P<0.01),大鼠活動減少,對新環(huán)境好奇度降低,出現(xiàn)焦慮癥狀。與模型組比較,電針天樞組、天樞+上巨虛組大鼠進入開臂時間和次數(shù)升高(P<0.01),大鼠焦慮行為明顯得到改善。兩電針組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見圖1、圖2。

注:橫向黑框表示大鼠進入閉臂軌跡;縱向紅框表示大鼠進入開臂軌跡圖1 各組大鼠高架十字迷宮軌跡圖

3.2 各組大鼠結(jié)直腸痛敏閾值比較

與空白組比較,模型組大鼠的結(jié)腸疼痛閾值(mmHg)明顯降低(P<0.01);與模型組比較,天樞組、天樞+上巨虛組大鼠結(jié)腸疼痛閾值均明顯升高(P<0.01);兩電針組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見圖3。

3.3 各組大鼠血清5-HT含量以及結(jié)腸5-HT4R蛋白表達比較

與空白組比較,模型組大鼠血清5-HT含量以及結(jié)腸5-HT4R蛋白表達含量分別升高和降低(P<0.05);與模型組比較,天樞組、天樞+上巨虛組大鼠血清5-HT的含量和結(jié)腸5-HT4R蛋白含量均得到恢復(fù)(P<0.05);兩電針組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見圖4、圖5。

注:與空白組比較*P<0.05;與模型組比較#P<0.05;5-羥色胺(5-HT)圖4 各組大鼠血清5-HT含量測定(n=6)

注:與空白組比較*P<0.05;與模型組比較#P<0.05;5-羥色胺4受體(5-HT4R)圖5 各組大鼠結(jié)腸5-HT4R蛋白免疫印跡圖及蛋白含量比較(n=4)

4 討論

根據(jù)臨床癥狀,中醫(yī)學(xué)將IBS歸屬于“泄瀉”“便秘”“郁證”等范疇;《靈樞·邪氣藏府病形》曰“飧泄,大腸痛,巨虛上廉主之”;《針灸大全》云“腹中寒痛,泄瀉不止,里急后重,天樞二穴”。天樞穴(ST25)與上巨虛穴(ST37)分別是大腸募穴和下合穴,是臨床治腸易激綜合征的重要選穴以及臨床治療腸腑疾病的經(jīng)典合募配穴[17-18]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)依據(jù)神經(jīng)節(jié)段分析,腸道平滑肌活動是受交感神經(jīng)(T10～L3)和副交感神經(jīng)(S2～4)的雙重支配[17,19-20],支配天樞穴的神經(jīng)節(jié)段在T9～11,上巨虛穴神經(jīng)支配主要來源于T12～L2神經(jīng)節(jié)段[21],天樞穴和上巨虛穴神經(jīng)支配與胃腸道的神經(jīng)支配在脊髓水平有高度重疊性,因此,針灸“天樞”“上巨虛”可將刺激引起的信號投射到支配相應(yīng)神經(jīng)節(jié)段,實現(xiàn)調(diào)理結(jié)腸功能的作用。

目前越來越多的臨床研究雖顯示針灸對IBS身心同調(diào)的治療效果[22-23],但多種因素同時影響針灸干預(yù)治療IBS臨床療效,在多種影響療效因素中腧穴配伍是關(guān)鍵共性因素之一。課題組前期研究結(jié)果顯示,單獨電針“天樞”對IBS模型大鼠的結(jié)腸功能有積極調(diào)節(jié)作用[24],但關(guān)于電針“天樞”配伍“上巨虛”是否有協(xié)同或疊加效應(yīng)的研究較少。

本實驗通過急慢性應(yīng)激聯(lián)合制備IBS 模型大鼠,利用高架十字迷宮檢測IBS大鼠情緒及行為學(xué),腹直肌肌電測定內(nèi)臟痛敏閾值,ELISA檢測血清中5-HT含量以及Western blot法檢測結(jié)腸組織中5-HT4R蛋白表達,初步探討電針“天樞”配伍“上巨虛”是否有協(xié)同或疊加效應(yīng)。高架十字迷宮是國際公認的用來測試動物焦慮行為的首選裝置[25],用于評估動物行為和心理情緒的實驗方法。其原理是利用動物對新環(huán)境探究的特性以及嗜暗的天性,當(dāng)大鼠處在開臂時,相當(dāng)于人類站在懸崖邊上會產(chǎn)生恐懼心理狀態(tài)[26],同時出于好奇而探究開臂,但又因恐懼心理或者嗜暗本能待在閉臂中,這種相沖突的心理狀態(tài)造成“探究-回避”行為,大鼠進入開臂次數(shù)和開臂時間百分比則反映大鼠焦慮情緒[27]。目前認為IBS病理和生理過程包括腸道分泌、感覺以及動力異常,臨床研究發(fā)現(xiàn),IBS患者腸道功能紊亂與5-HT異常有關(guān)[28]。5-HT,又名血清素,是一種腦腸肽神經(jīng)遞質(zhì),大部分的5-HT產(chǎn)生并貯存于腸嗜鉻細胞 (enterochromaffin cell,EC)中,少部分在中樞神經(jīng)系統(tǒng)合成,EC釋放的5-HT既可通過刺激腸肌間神經(jīng)叢或黏膜下層的不同受體(5-HT3、5-HT4)調(diào)節(jié)胃腸道的蠕動和分泌,影響胃腸動力和增加內(nèi)臟敏感性[29],同時參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)中對精神情志的調(diào)控[30-32]。5-HT4R蛋白通過刺激神經(jīng)末梢使運動神經(jīng)元釋放乙酰膽堿以及其他神經(jīng)遞質(zhì),從而影響結(jié)腸感覺和運動功能[31],形成一系列排便異常、腹部不適等IBS臨床癥狀。

各組大鼠高架十字迷宮實驗結(jié)果顯示:與空白組相比,模型組大鼠OE%和OT%明顯減少,與模型組相比,兩電針組OE%和OT%升高,說明電針可緩解IBS大鼠模型焦慮的情緒心理行為,與臨床和基礎(chǔ)究結(jié)果相一致[32-33]。腹直肌肌電檢測結(jié)腸痛敏閾值的結(jié)果、血清5-HT含量、5-HT4R蛋白表達實驗結(jié)果顯示:與模型組比較,電針“天樞”與“天樞”配伍“上巨虛”均能提升大鼠內(nèi)臟痛敏閾值,減少血清5-HT含量,增加5-HT4R蛋白含量表達,說明電針可調(diào)節(jié)IBS大鼠結(jié)腸功能紊亂癥狀,與同類研究的結(jié)果相一致[34-35]。但以上實驗結(jié)果還顯示,與電針“天樞”相比,電針“天樞”配伍“上巨虛”并未顯示腧穴配伍優(yōu)勢,差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

綜上所述,電針“天樞”與“天樞”配伍“上巨虛”對IBS模型大鼠行為學(xué)以及結(jié)腸功能異常癥狀均有調(diào)節(jié)作用,但電針“天樞”配伍“上巨虛”未表現(xiàn)明顯治療優(yōu)勢,因而就本實驗結(jié)果而言從側(cè)面顯示出電針對IBS模型大鼠精神心理行為以及結(jié)腸功能的調(diào)節(jié)作用與腧穴數(shù)量多少無關(guān)。產(chǎn)生此結(jié)果的原因可能是由于IBS病因病機涉及眾多的病理和生理環(huán)節(jié),而本實驗只是觀察電針“天樞”與“天樞”配伍“上巨虛”對IBS模型大鼠精神心理行為、血清5-HT以及結(jié)腸5-HT4R蛋白含量等指標(biāo)的影響,并未涉及其他的發(fā)病機制中相關(guān)指標(biāo)的研究。除此之外,由于針刺的效應(yīng)機制涉及多個途徑和作用靶點[36],“天樞”配伍“上巨虛”可能通過各自不同的作用靶點產(chǎn)生疊加效應(yīng)。因此,穴位之間的協(xié)同或疊加效應(yīng)不是腧穴之間簡單相加[37],腧穴配伍協(xié)同作用或者腧穴組方規(guī)律有待進一步研究。