李金龍 葉水文 孫君 陳亞南 向東

(1.邢臺(tái)市人民醫(yī)院， 河北 邢臺(tái) 054000； 2.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院； 3.淄博市第一醫(yī)院； 4.上海市血液中心)

P 血型系統(tǒng)為人類血型系統(tǒng)中第3 個(gè)被鑒定的類型[1]。由于多種因素，P 血型系統(tǒng)的命名在經(jīng)歷了多次修訂。 2011年國(guó)際輸血協(xié)會(huì)(ISBT)規(guī)范為P1Pk系統(tǒng)(包含P1、Pk及NOR 抗原)和Globside 系統(tǒng)(P 抗原)[2]。 罕見(jiàn)的p 表型個(gè)體由于A4GALT基因的突變而導(dǎo)致A4GALT 酶功能喪失，進(jìn)而無(wú)法有效催化P1、Pk和P 抗原的合成。 這一表型的個(gè)體天生產(chǎn)生抗-PP1Pk(早期稱為抗-Tja)，該抗體是引發(fā)該類女性個(gè)體反復(fù)流產(chǎn)的主要原因[1，3]。 鴿子的蛋清中含有可中和抗-P1 的P1 物質(zhì)[4]。 在本研究中，我們利用鴿子蛋清及人血漿中和抗-PP1Pk，旨在深入探討抗-PP1Pk的血清學(xué)特性，為治療p 表型孕婦習(xí)慣性流產(chǎn)尋找可能的治療途徑?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源

使用的抗-PP1Pk為AB 型人源性抗體，由上海市血液中心于2012 年2 月28 日采集。 獻(xiàn)血者1 ～6 號(hào)血漿:隨機(jī)抽取2023 年8 月9 日于上海市中心血站進(jìn)行無(wú)償獻(xiàn)血者檢測(cè)剩余血漿。 新鮮AB 血清(補(bǔ)體源): 2021 年9 月收集的當(dāng)天20 人份AB 型無(wú)償獻(xiàn)血者的檢測(cè)剩余血清混合。 相關(guān)血漿/清均置于－80℃保存。 補(bǔ)體滅活A(yù)B 血清:將新鮮AB 血清解凍后，56℃水浴30 min 滅活補(bǔ)體。

1.2 試劑與儀器

指示細(xì)胞使用3%抗體篩選細(xì)胞Ⅰ(O＋、P2、MN)、Ⅱ(O＋、P1、MM)(批號(hào):20237033)；抗-P1 試劑(IgM)(批號(hào):20112018)；抗-C3d 試劑(批號(hào):20225201)；巰基乙醇(2-Me)試劑(批號(hào):20217703)，均為上海血液生物醫(yī)藥有限公司產(chǎn)品；低離子柱凝集卡(BIO-RAD，批號(hào):50531.75.13)；ABO 正反定型及Rh 血型檢測(cè)卡:(潤(rùn)普，批號(hào):10230107)；離心機(jī)(久保田，KA-2200 型)。

1.3 方法

1.3.1 鴿子蛋清稀釋液的配制[5]并確定稀釋比例

分離鴿子蛋中的蛋清與蛋黃，使用PH7.3 的1×PBS 稀釋蛋清將蛋清倍比稀釋(10 至1 280 倍)。 將鴿子蛋清稀釋液與抗-P1 試劑以1 ∶9的比例混合(5 μL 倍比稀釋的蛋清稀釋液＋45 μL 抗-P1 試劑)，同時(shí)增加陽(yáng)性對(duì)照(50 μL 抗-P1試劑)和陰性對(duì)照(5 μL 蛋清稀釋液＋45 μL 生理鹽水)。 另外，我們進(jìn)行了特異性驗(yàn)證(5 μL 蛋清稀釋液和45 μL 抗-M試劑)以確認(rèn)鴿子蛋清是否能夠特異性地中和抗-P1。 鴿子蛋清在室溫中和30 min 后加入抗體篩選細(xì)胞Ⅱ，分別觀察試管法和抗人球蛋白卡(立即離心以及4℃反應(yīng)15 min 后離心)中的結(jié)果。 因?yàn)檫M(jìn)行了預(yù)試驗(yàn)，在對(duì)照孔中我們均使用50 倍稀釋的鴿子蛋清。

1.3.2 不同反應(yīng)體系對(duì)抗-PP1Pk效價(jià)的影響

分別使用生理鹽水、新鮮AB 血清、補(bǔ)體滅活A(yù)B 血清倍比稀釋抗-PP1Pk(1 至64 倍)。 取50 μL 倍比稀釋抗-PP1Pk＋50 μL 抗體篩選細(xì)胞Ⅱ(P1)，立即離心以及4℃、37℃反應(yīng)15 min 后離心，觀察其在試管法與柱凝集卡上的結(jié)果。

1.3.3 鴿子蛋清中和抗-PP1Pk的效果驗(yàn)證

使用確定稀釋倍數(shù)的鴿子蛋清稀釋液與生理鹽水倍比稀釋的抗-PP1Pk血清以1:9 的比例混合，室溫反應(yīng)30 min。取50 μL 混合液＋50 μL 抗體篩選細(xì)胞Ⅱ(P1)，對(duì)照組為立即離心以及4℃、37℃反應(yīng)15 min 后離心，觀察其在試管法與柱凝集卡上的結(jié)果。

1.3.4 不同獻(xiàn)血者血漿對(duì)抗-PP1Pk的中和作用

使用生理鹽水將抗-PP1Pk進(jìn)行1 ～64 倍倍比稀釋并與獻(xiàn)血者血漿以1 ∶1的比例混合，室溫中和30 min。 取100 μL混合液＋50 μL 抗體篩選細(xì)胞Ⅰ(P2)混勻后轉(zhuǎn)100 μL 于柱凝集卡，立即離心觀察結(jié)果。

1.3.5 抗-PP1Pk在不同介質(zhì)中的激活補(bǔ)體情況

使用對(duì)抗-PP1Pk中和能力最強(qiáng)的獻(xiàn)血者血漿對(duì)抗-PP1Pk進(jìn)行倍比稀釋(1 到32 倍)，取50 μL 混合液＋25 μL抗體篩選細(xì)胞Ⅰ(P2)，至4℃反應(yīng)30min。 加入25 μL 新鮮AB 血漿，混勻后37℃水浴30 min。 分別40 μL 至空白柱凝集卡(ABO 鑒定卡的后5 孔)，以及加入50 μL 抗-C3d 的空白柱凝集卡，離心觀察結(jié)果。 對(duì)照組使用生理鹽水代替患者血漿進(jìn)行倍比稀釋，余條件不變。

2 結(jié)果

2.1 鴿子蛋清稀釋倍數(shù)及效果確認(rèn)

鴿子蛋清稀釋液可以在鹽水、柱凝集(直接離心)、柱凝集(4℃，15 min)3 種情況下完全中和抗-P1 的稀釋倍數(shù)分別為160、160 和80。 為確保在隨后的試驗(yàn)中能夠完全中和抗體，我們最終決定采用鴿子蛋清稀釋液的稀釋倍數(shù)設(shè)定為50(表1)。

2.2 抗-PP1Pk血清學(xué)性質(zhì)

所采用的抗-PP1Pk在鹽水和柱凝集中的效價(jià)分別為4和8。 通過(guò)在不同溫度和介質(zhì)條件下進(jìn)行試驗(yàn)，我們觀察到抗-PP1Pk表現(xiàn)一定的冷抗體性質(zhì)。 具體而言，在4℃條件下，其效價(jià)從4 增至8(鹽水)，以及8 增至16(柱凝集)。 然而，在37℃條件下，相對(duì)于室溫其效價(jià)保持不變。 值得注意的是，在使用2-Me 破壞IgM 型抗體后，無(wú)論是在何種溫度條件下，抗-PP1Pk的效價(jià)均呈現(xiàn)出2 管以上的降低，見(jiàn)表2，圖1。

圖1 鴿子蛋清對(duì)抗-PP1Pk 的中和作用Figure 1 Neutralization effect of pigeon egg white on anti-PP1Pk

表2 抗-PP1Pk血清學(xué)性質(zhì)及對(duì)鴿子蛋清中和反應(yīng)的效果Table2 Serological properties of anti-PP1Pk and its effect on neutralization reaction in pigeon egg white

2.3 鴿子蛋清對(duì)抗-PP1Pk的中和作用

使用50 倍稀釋的鴿子蛋清中和后，抗-PP1Pk在鹽水和柱凝集介質(zhì)中的效價(jià)均小幅降低(不超過(guò)1 管)。 然而，對(duì)經(jīng)過(guò)2-Me 處理的抗-PP1Pk血清使用鴿子蛋清進(jìn)行中和，未顯示出明顯效果，見(jiàn)表2，圖1。

2.4 不同體系對(duì)抗-PP1Pk效價(jià)的影響

在進(jìn)行倍比稀釋時(shí)，將常規(guī)AB 血清代替生理鹽水，無(wú)論在不同溫度條件下或不同介質(zhì)中，均會(huì)讓抗-PP1Pk的效價(jià)降低2 管左右。 相對(duì)于補(bǔ)體滅活A(yù)B 血清，使用新鮮AB血清會(huì)增加抗-PP1Pk的反應(yīng)效價(jià)，其結(jié)果與使用生理鹽水稀釋時(shí)類似，見(jiàn)表3。 可能由于試驗(yàn)所用補(bǔ)體活性較低亦或是反應(yīng)時(shí)長(zhǎng)較短的原因，試驗(yàn)中未出現(xiàn)明顯溶血現(xiàn)象。

表3 抗-PP1Pk在不同介質(zhì)中的血清學(xué)性質(zhì)Table 3 Serological properties of anti-PP1Pk in different media

2.5 不同獻(xiàn)血者血漿對(duì)抗-PP1Pk的中和作用

不同獻(xiàn)血者的血漿對(duì)抗-PP1Pk的中和效果各不相同。 有趣的是并不是P1 表型獻(xiàn)血者的血漿更容易吸收抗-PP1Pk，見(jiàn)表4，圖2。

圖2 不同患者血漿對(duì)抗-PP1Pk 的中和作用Figure 2 Neutralizing effect of plasma from different blood donors on anti-PP1Pk

表4 不同獻(xiàn)血者血漿對(duì)抗-PP1Pk的中和作用Table 4 Neutralizing effect of plasma from different blood donors on anti-PP1Pk

2.6 抗-PP1Pk 在不同介質(zhì)中的激活補(bǔ)體情況

如表5、圖3 所示，使用獻(xiàn)血者血漿對(duì)抗-PP1Pk進(jìn)行倍比稀釋后，相對(duì)于鹽水介質(zhì)，其效價(jià)明顯降低(2 管左右)。其中鹽水2 稀釋管和4 倍稀釋管出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的溶血現(xiàn)象，而血漿中和組均未出現(xiàn)明顯溶血。

圖3 人血漿對(duì)抗-PP1Pk 致敏補(bǔ)體能力的中和作用Figure 3 Neutralization of the complement sensitizing capacity of anti-PP1Pk by human plasma

表5 抗-PP1Pk在不同介質(zhì)中的激活補(bǔ)體情況Table 5 Activation of complement by anti-PP1Pk in different media

3 討論

本研究通過(guò)使用鴿子蛋清中和法、2-巰基乙醇試劑破壞IgM 抗體、人血漿中和、添加補(bǔ)體成分等方法對(duì)抗-PP1Pk進(jìn)行探究，發(fā)現(xiàn)抗-PP1Pk具有以下血清學(xué)特點(diǎn):1)同時(shí)存在IgM 型和IgG 型，且4℃反應(yīng)性均較37℃更強(qiáng)；2)抗-PP1Pk是由抗-P1、抗-P、抗-Pk等抗體組成的混合型抗體，本研究結(jié)果，鴿蛋清中和其中抗P1 后，總體反應(yīng)活性明顯下降；3)人血漿對(duì)抗-PP1Pk有較強(qiáng)的中和作用，可以減輕抗-PP1Pk激活補(bǔ)體的能力。

抗-PP1Pk為p 表型人群的天然抗體和習(xí)慣性流產(chǎn)密切相關(guān)[1]。 然而，由于p 血型人群的極其罕見(jiàn)，目前對(duì)抗-PP1Pk相關(guān)特性的研究相對(duì)較少。 本研究通過(guò)對(duì)p 表型先證者血清的深入研究，發(fā)現(xiàn)了抗-PP1Pk的一系列特性。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在鹽水法以及2-Me 處理后的柱凝集法中，抗-PP1Pk能凝集相應(yīng)紅細(xì)胞，證明該抗體既包含IgM 型，也包含IgG 型。 此現(xiàn)象在眾多其他文獻(xiàn)中也得到了印證[6-8]。 此外，該抗體表現(xiàn)出冷抗體性質(zhì)，即使在低溫(4℃)條件下，IgG 型抗體的效價(jià)也呈明顯增加。 類似的現(xiàn)象在一些獨(dú)立研究中也有所提及[9]。 P 抗原是1 種糖苷脂[1]，這種現(xiàn)象可能與P 抗原的空間結(jié)構(gòu)有關(guān)。

1975 年的1 項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)P2 型的鴿子飼養(yǎng)者血清中的抗-P1 陽(yáng)性人群約34%遠(yuǎn)高于對(duì)照組的6%。 進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)鴿子的細(xì)胞、血清、糞便中存在與人P1 抗原相似的抗原性物質(zhì)[10]。 除了鴿子外，在包蟲、絳蟲、吸蟲體內(nèi)[3]以及斑鳩蛋清[11]中也發(fā)現(xiàn)了P1 物質(zhì)。 鴿子蛋清中含有的P1 物質(zhì)對(duì)抗-P1 有很強(qiáng)的中和作用[11]。 然而，本試驗(yàn)表明，在鹽水中，鴿子蛋清能夠部分中和抗-PP1Pk(效價(jià)降低1 管左右)，但對(duì)IgG 型的抗-PP1Pk作用不明顯。 這可能與鴿子蛋清只能中和抗-P1 有關(guān)，同時(shí)也從另1 個(gè)角度證明抗-PP1Pk是由抗-P1、抗-P 以及抗-PK等多種抗體組成的混合型抗體[3]。

新鮮血清中含有補(bǔ)體，抗-PP1Pk具有很強(qiáng)的激活補(bǔ)體的能力[1，12]。 被激活的C3b 半衰期僅60 μs 左右，只有在短時(shí)間內(nèi)激活足夠的C3b 才能引發(fā)溶血反應(yīng)[3]。 即使補(bǔ)體含量不足以引發(fā)溶血，黏附在紅細(xì)胞表面的C3 裂解產(chǎn)物C3d也會(huì)使紅細(xì)胞更容易凝集，此外卡中的抗-C3d 也會(huì)與紅細(xì)胞上黏附的C3d 結(jié)合從而出現(xiàn)凝集現(xiàn)象。 因此使用新鮮血清倍比稀釋的抗-PP1Pk效價(jià)要明顯高于普通血漿。

人血清中包含多種抗體可能會(huì)中和柱凝集卡中的試劑，在多數(shù)柱凝集介質(zhì)中血清體系可導(dǎo)致反應(yīng)結(jié)果偏低甚至出現(xiàn)假陰性。 然而，實(shí)驗(yàn)證實(shí)抗-PP1Pk在柱凝集介質(zhì)以外，在鹽水中也受到人血清的抑制作用。 此外，我們發(fā)現(xiàn)人血清對(duì)抗-PP1Pk的中和作用要強(qiáng)于鴿子蛋清。 后續(xù)的試驗(yàn)中我們使用P2 表型作為指示細(xì)胞同樣顯示出了人血漿的中和作用，這一現(xiàn)象應(yīng)該是由于人血漿中含有P 抗原物質(zhì)，也會(huì)與抗-PP1Pk中的抗-P 相互中和，導(dǎo)致反應(yīng)減弱。

1927 年，Landsteiner 等[13]利用人血免疫兔子的實(shí)驗(yàn)手段，首次發(fā)現(xiàn)了P 血型系統(tǒng)，該系統(tǒng)涵蓋了P＋型和P－型血型。 隨后于1951 年，Levine 等[14]在1 名女性胃癌患者身上觀察到1 種特殊的抗體，該抗體能夠使除她妹妹以外的所有人的紅細(xì)胞發(fā)生凝集反應(yīng)，Levine 等[14]將其命名為抗-Tja，其中“T”代表腫瘤(Tumor)，而“J”取自患者名字“Jay”，并將這一新的血型系統(tǒng)被稱為Jay 血型系統(tǒng)。 1955 年Sanger[15]發(fā)現(xiàn)多個(gè)獨(dú)立的存在抗-Tja的受試者均為P－型，通過(guò)多方驗(yàn)證最終將Jay 血型將其并入P 系統(tǒng)之中稱為p 型。目前，ISBT 將P 血型系統(tǒng)分為P1Pk系統(tǒng)以及GLOB 系統(tǒng)。其中，P1Pk系統(tǒng)涵蓋了P1、Pk以及NOR 3 個(gè)抗原。 而GLOB系統(tǒng)僅包含P 抗原[2]。 P 血型主要包含P1、P2、Pk()以及p 等血型。

P1 型人群占比約75%，非洲和南美洲人群的比例高于白種人和亞洲人[1]。 P2 型僅僅意味著P1 抗原陰性，不存在單獨(dú)的P2 抗原。 P1 抗原是由A4GALT基因編碼的A4GALT 酶催化而來(lái)，由于A4GALT基因突變P2 型人群該基因的轉(zhuǎn)錄水平僅為P1 型人群的1/30。 P2 人群中常存在冷性抗-P1，但一般情況下這種抗體并不引發(fā)溶血反應(yīng)[3]。P1 抗原的表達(dá)強(qiáng)度在個(gè)體間存在顯著差異，并且這種差異可以通過(guò)遺傳[3]，因此在抗體鑒定時(shí)P1 陽(yáng)性的指示細(xì)胞不一定出現(xiàn)凝集，鑒定抗-P1 時(shí)最好采用陰性排除法。 P1 抗原的發(fā)育表現(xiàn)出明顯的階段特異性，在胎兒時(shí)期表達(dá)強(qiáng)烈，隨著胎齡的增加，其表達(dá)水平逐漸下降。 出生時(shí)，P1 抗原陰性，直至7 歲以上時(shí)才會(huì)完全形成[1]。

Pk是1 種高頻抗原，同樣由A4GALT 酶催化而來(lái)。 P 抗原是由B3GALNT1 基因編碼的B3GALNT1 酶催化Pk抗原形成[1]。 由于所編碼的基因不同Pk與P 屬于不同的血型系統(tǒng)。 在P1 和P2 紅細(xì)胞上Pk表達(dá)很弱，但P 抗原表達(dá)很強(qiáng)[1]。 當(dāng)B3GALNT1 基因突變時(shí)Pk抗原無(wú)法轉(zhuǎn)化為P 抗原，從而出現(xiàn)了Pk強(qiáng)表達(dá)而P 不表達(dá)的情況，即Pk型。 Pk型人群天然產(chǎn)生抗-P[1]。 1 項(xiàng)研究顯示， Pk型人群的單個(gè)核細(xì)胞由于Pk抗原的強(qiáng)烈表達(dá)增強(qiáng)了對(duì)HIV 的免疫，相比之下，由于p 型人群不表達(dá)Pk，他們的單個(gè)核細(xì)胞對(duì)HIV 的易感性增加了10～1 000 倍[16]。

除p 型和Pk型細(xì)胞外，其他紅細(xì)胞，包括胎兒紅細(xì)胞均強(qiáng)表達(dá)P 抗原[17]，這種強(qiáng)表達(dá)在胎肝、胎心以及胎盤上也可以觀察到[18]。 這一特點(diǎn)為抗-P 或抗-PP1Pk引發(fā)嚴(yán)重新生兒溶血病(HDN)的基礎(chǔ)。 值得注意的是，P 抗原是細(xì)小病毒B19 的受體，P 抗原陰性人群可能天然對(duì)B19 具有免疫力[19]。 抗-P 包括IgM 及IgG，這些抗體可能導(dǎo)致嚴(yán)重的血管內(nèi)溶血[20]。 此外，陣發(fā)性冷性血紅蛋白尿(PCH)伴有自身抗-P[21]，這種抗體可以和P1、P2 細(xì)胞反應(yīng)，而不與Pk細(xì)胞反應(yīng)[1]。

p 血型多見(jiàn)于A4GALT基因突變，導(dǎo)致無(wú)法產(chǎn)生A4GALT 酶，從而無(wú)法催化產(chǎn)生P1，Pk以及包括P 抗原在內(nèi)的所有下游抗原。 p 血型在人群中非常罕見(jiàn)，在歐洲每百萬(wàn)人中僅有5.8 例，中國(guó)香港地區(qū)在超過(guò)100 萬(wàn)人的篩選中僅發(fā)現(xiàn)了1 例p 血型[1]，上海地區(qū)2 500 名獻(xiàn)血者中未篩選出1 例p 血型[22]。 p 血型人群天然存在抗-PP1Pk，類似于抗-A、抗-B，這些抗體同樣可以引發(fā)嚴(yán)重的溶血反應(yīng)[14]，并且是導(dǎo)致小p 血型婦女習(xí)慣性流產(chǎn)的首要因素[1]。 胎盤組織表達(dá)P1、P 和Pk抗原[23]，胚胎和滋養(yǎng)層細(xì)胞早在5 周開(kāi)始表達(dá)P 抗原， P1 抗原在第19 周出現(xiàn)。 P1 一旦出現(xiàn)，就會(huì)抑制P 和Pk抗原的表達(dá)[24]。 p 血型孕婦的流產(chǎn)往往發(fā)生在妊娠的前3 個(gè)月，然后，若能度過(guò)這個(gè)時(shí)間的，胚胎通常能夠繼續(xù)發(fā)育并產(chǎn)下健康的嬰兒，在妊娠早期去除母親體內(nèi)抗體尤為重要[25]。 有報(bào)道認(rèn)為IgG 性質(zhì)的抗-PP1Pk可能是引起新生兒溶血的罪魁禍?zhǔn)譡26]，其他研究指出IgG3 型的抗-PP1Pk與流產(chǎn)存在強(qiáng)烈相關(guān)性[27]。 也有研究認(rèn)為抗-PP1Pk引起流產(chǎn)主要是因?yàn)槠渲械目?Pk攻擊胎盤[28-29]。 1 項(xiàng)系統(tǒng)綜述對(duì)16 例p 血型孕婦的情況進(jìn)行總結(jié)，結(jié)果顯示患者抗體效價(jià)和HDN 的發(fā)生沒(méi)有明顯的相關(guān)性，IgG 和IgM 型抗體都可能對(duì)胎兒生存造成威脅[30]。 通過(guò)對(duì)母體抗體進(jìn)行中和，可以顯著改善妊娠期胎兒的溶血情況[25，31]。

我們通過(guò)對(duì)罕見(jiàn)的抗-PP1Pk進(jìn)行一系列實(shí)驗(yàn)。 發(fā)現(xiàn)抗-PP1Pk是1 種IgM 和IgG 并存、冷性、可以激活補(bǔ)體的由抗-P1 在內(nèi)多種抗體組成的混合抗體。 使用人血漿可以在體外一定程度上中和抗-PP1Pk，并抑制其補(bǔ)體激活能力，有望為p 表型習(xí)慣性流產(chǎn)患者的治療提供可能性方案。