摘要：【目的】對(duì)木薯花青素還原酶基因（MeANR）進(jìn)行克隆及表達(dá)分析，為解析木薯葉片花青素生物合成的分子機(jī)制、葉色改良及新品種培育提供理論依據(jù)?！痉椒ā恳?種葉片顏色的木薯華南9號(hào)（SC9，綠葉）、花葉木薯（黃綠葉）和紫葉木薯（紫葉）為材料，測(cè)定其花青素含量和原花青素含量，并對(duì)MeANR基因進(jìn)行克隆及生物信息學(xué)分析，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)MeANR基因在不同組織及激素處理下的表達(dá)模式，通過(guò)轉(zhuǎn)基因酵母脅迫試驗(yàn)驗(yàn)證MeANR基因在不同激素處理下的表達(dá)情況。【結(jié)果】SC9、花葉木薯和紫葉木薯葉片中的花青素含量和原花青素含量均存在顯著差異（Plt;0.05），其中紫葉木薯葉片的花青素含量最高，達(dá)444.59 ng/g，分別為SC9和花葉木薯的24.48和28.32倍。從3種葉片顏色的木薯葉片中分別克隆到1個(gè)MeANR基因，其編碼區(qū)（CDS）序列為1041 bp，序列完全一致，但與Phy‐

tozome數(shù)據(jù)庫(kù)中公布的ANR基因序列（登錄號(hào)：Manes.16G016400）存在7個(gè)堿基差異。MeANR蛋白由346個(gè)氨基酸組成，屬于穩(wěn)定的非分泌型親水性蛋白，二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由無(wú)規(guī)則卷曲（42.77%）和α-螺旋（37.28%）構(gòu)成，延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角占比較小，亞細(xì)胞定位于葉綠體。MeANR基因在芽中的相對(duì)表達(dá)量最高，其次是葉片和花，在莖中的相對(duì)表達(dá)量最低。MeANR基因在不同激素處理下呈不同的表達(dá)模式，水楊酸（SA）處理后隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，MeANR基因的相對(duì)表達(dá)量呈先下降后上升再下降的變化趨勢(shì)，處理后24 h MeANR基因的相對(duì)表達(dá)量比處理0 h顯著下降68%，而在脫落酸（ABA）和茉莉酸甲酯（MeJA）處理后MeANR基因的相對(duì)表達(dá)量總體上呈上升趨勢(shì)，但ABA處理后24 h達(dá)峰值，MeJA處理后9 h達(dá)峰值。在SA處理下轉(zhuǎn)MeANR基因酵母菌的存活率低于對(duì)照（轉(zhuǎn)pDR196空載體的酵母菌），而在ABA和MeJA處理下轉(zhuǎn)MeANR基因酵母菌的生長(zhǎng)情況優(yōu)于對(duì)照?！窘Y(jié)論】木薯葉片顏色深度與花青素含量存在正相關(guān)性。MeANR是木薯葉片花青素積累的負(fù)調(diào)控基因，具有明顯的組織表達(dá)特異性，其表達(dá)受SA抑制，受ABA和MeJA 誘導(dǎo)。

關(guān)鍵詞：木薯；葉片；花青素還原酶（ANR）；基因克?。槐磉_(dá)模式

中圖分類(lèi)號(hào)：S533.035.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2024）11-3210-11

Cloning and expression analysis of MeANR gene in cassava" （Manihot esculenta Crantz）leaves with different colors

ANFei-fei1，2，LUOXiu-qin1，CHENSong-bi1，XUEJing-jing2，CAIJie1*

（1Tropical Crops Genetic Resources Institute/Key Laboratory of Ministry ofAgriculture and RuralAffairs for Germplasm Resources Conservation and Utilization of Cassava，ChineseAcademy of TropicalAgricultural Sciences，Haikou，

Hainan" 571101，China；2Sanya Research Institute，ChineseAcademy of TropicalAgricultural Sciences，Sanya，Hainan" 572025，China）

Abstract：【Objective】The purpose of the study was to clone and analyze the expression of anthocyanidin reductase gene（MeANR）in cassava，in order to provide theoretical basis for understanding the molecular mechanism of anthocya-nin biosythesis in cassava leaves，improving leave color，and cultivating new varieties.【Method】Cassava with 3 leaf co-lors：Huanan No.9（SC9，green leaves），mosaic leaf cassava（yellow and green leaves）and purple leaf cassava（purple leaves）were used as materials，the anthocyanin content and proanthocyanidin content were measured.MeANR gene was cloned and analyzed using bioinformatics. Real-time fluorescence quantitative PCR was used to detect the expression pat‐tern of MeANR gene in different tissues and hormone treatments. Transgenic yeast stress experiments were conducted to verify the expression of MeANR under different hormone treatments.【Result】There were significant difference（Plt;0.05）between anthocyanin content and proanthocyanid content in leaves of SC9，mosaic leaf cassava and purple leaf cassava.Among them，the anthocyanin content in leaves of purple leaf cassava was the highest，reaching 444.59 ng/g，which was as 24.48 and 28.32 times as that of SC9 and mosaic leaf cassava respectively. AMeANR gene was cloned from cassava leaves with 3 different leaf colors respectively，with a coding region（CDS）of 1041 bp，the sequences were consistent，with 7bp inconsistent with the published sequences in Phytozome database（accession number：Manes.16G016400）. The MeANR protein consisted of 346 amino acids and was a stable non-secreted hydrophilic protein. Its secondary structure was mainly composed of random coils（42.77%）and α-helices（37.28%），with a small proportion of extended chains and β-turns.Subcellular localization was in the chloroplast. The expression level of MeANR gene was the highest in buds，followed by leaves and flowers，and lowest in stems.MeANR geneexhibited different expression patterns under different hormone treatments. After salicylic acid（SA）treatment，the relative expression level of MeANR showed a trend of first decreasing，then increasing，and then decreasing with the prolongation of treatment time. The relative expression level of MeANR gene at 24 h significantly decreased by 68% compared to 0 h. However，after abscisic acid（ABA）and methyl jasmonate （MeJA）treatments，the relative expression level of MeANR gene showed an upward trend，but reached its peak at 24 h of ABAtreatment and 9 h of MeJAtreatment. The survival rate of MeANR transgenic yeast strain under SAtreatment was

lower than that of control（yeast strain transformed with pDR196 empty vector），the growth of MeANR transgenic yeast strain treated with ABAand MeJAwas better than the control.【Conclusion】There is a positive correlation between the cassava leaf color and anthocyanin content.MeANR is a negative regulatory gene for anthocyanin accumulation in cassava

leaves，with obvious tissue expression specificity，and is inhibited by SA，induced byABAand MeJA.

Key words：cassava；leaves；anthocyanin reductase（ANR）；gene cloning；expression pattern

Foundation items：National Key Research and Development Program of China（2023YFD1200204）；Science and Technology Innovation Team of National Tropical Agricultural Science Center of Chinese Academy of Tropical Agricul‐tural Sciences（CATASCXTD202301）；Central Public-interest Scientific Institution Basal Research Fund of Chinese Aca-demy of TropicalAgricultural Sciences（1630032022007）

0 引言

【研究意義】木薯（Manihot esculenta Crantz）是世界熱帶地區(qū)約10億人賴(lài)以生存的糧食，在推進(jìn)“一帶一路”農(nóng)業(yè)合作，維護(hù)世界糧食安全中發(fā)揮著重要作用（曹升等，2021）。在我國(guó)木薯主要種植于廣西、廣東、海南、云南、貴州等?。▍^(qū)），是生產(chǎn)淀粉、燃料乙醇等化工產(chǎn)品及動(dòng)物飼料的主要原材料。木薯葉片含有豐富的抗氧化物質(zhì)，如類(lèi)胡蘿卜素、類(lèi)黃酮等（Latif and Müller，2015；王琴飛等，2018；張振文等，2018），是醫(yī)藥和健康食品重要原料?；ㄇ嗨剡€原酶（Anthocyanidin reductase，ANR）是花青素合成下游的一種關(guān)鍵酶，將有色的花青素還原合成表沒(méi)食子兒茶素、表兒茶素等，進(jìn)一步聚合形成無(wú)色的原花青素（Gargouri et al.，2009），對(duì)花青素含量有一定的負(fù)調(diào)控作用（Han et al.，2012；楊波等，2021），其表達(dá)對(duì)植物呈色也有重要影響。因此，探究木薯葉片顏色差異，并對(duì)MeANR基因進(jìn)行克隆及表達(dá)分析，對(duì)探究木薯葉色形成的分子機(jī)制及新品種培育具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】花青素是一類(lèi)廣泛存在于植物中的黃酮類(lèi)化合物，在植物根、莖、葉、花、皮、果實(shí)中均可檢測(cè)到（Matsui et al.，2016；郭松等，2024）?；ㄇ嗨乜煞譃樘祗每?、矢車(chē)菊色素、芍藥色素、飛燕草色素、牽牛色素和錦葵色素（Kong et al.，2003；Luo et al.，2023），其生物合成途徑是類(lèi)黃酮合成途徑的一個(gè)分支，同時(shí)受多個(gè)結(jié)構(gòu)基因調(diào)控，如查爾酮合成酶（CHS）、查爾酮異構(gòu)酶（CHI）、黃烷酮三羥化酶（F3H）、花青素合成酶（ANS）、ANR等（Jaakola，2013）。除此之外，花青素的合成還受到MYB、bHLH、bZIP和WD40四大類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子的影響（Zhang et al.，2024），其中MYB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子形成的復(fù)合體WD40-bHLH-MYB是花青素合成的主要調(diào)控因子之一（Dela et al.，2003）?；ㄇ嗨氐纳锖铣墒苤参餇I(yíng)養(yǎng)水平、生長(zhǎng)發(fā)育及環(huán)境因子（光、溫度等）的協(xié)同調(diào)控，在植物遭受脅迫時(shí)，植物體內(nèi)類(lèi)黃酮尤其是花青素和原花青素在植物體內(nèi)大量積累，進(jìn)而減緩逆境對(duì)植物的傷害，提高植物的逆境適應(yīng)性（申玉曉，2019；劉愷媛等，2021）。ANR基因作為花青素合成鮮見(jiàn)報(bào)道。木薯葉片通常為綠色，在綠色木薯葉片中含有極少量的花青素，而紫色木薯葉片中花青素含量是綠色木薯葉片的30倍以上，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示MeANR基因在紫色木薯葉片中表達(dá)較低，可能是木薯葉片花青素生物合成的一個(gè)負(fù)調(diào)控基因（Luo et al.，2023），但其具體的調(diào)控作用機(jī)制尚未明晰。Rabbi等（2022）通過(guò)對(duì)國(guó)際熱帶農(nóng)業(yè)研究所（IITA）保存的5130份木薯材料進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS），結(jié)果發(fā)現(xiàn)MYB6 （Manes.01G115400）既可能控制葉柄顏色，也可能控制木薯葉片綠色?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前鮮見(jiàn)關(guān)于木薯不同顏色形成機(jī)制及其相關(guān)基因克隆、表達(dá)分析的研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以3種顏色的木薯葉片為材料，對(duì)其花青素和原花青素含量進(jìn)行測(cè)定，克隆MeANR基因，分析其編碼蛋白結(jié)構(gòu)和跨膜結(jié)構(gòu)等特征，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)MeANR基因在不同組織和激素處理下的表達(dá)模式，為進(jìn)一步探究其在木薯葉色改良中的功能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

綠葉木薯華南9號(hào)（SC9）、花葉木薯及紫葉木薯于2023年3月種植在中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所國(guó)家木薯種質(zhì)資源圃（海南儋州）19°30′33.13″N，109°30′19.34″E），種植后3個(gè)月，取健康成熟葉片置于液氮中，-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｓ糜趤喖?xì)胞定位的本生煙由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所實(shí)驗(yàn)室保存。主要試劑：茉莉酸甲酯（MeJA）、水楊酸（SA）、脫落酸（ABA）均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；釀酒酵母高效感受態(tài)制備試劑盒（ZC135）購(gòu)自北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司；植物花青素含量檢測(cè)試劑盒（G0126F）購(gòu)自蘇州格銳思生物科技有限公司；植物原花青素含量檢測(cè)試劑盒（BC1355）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；Thermo Scientific RevertAid RT試劑盒（K1691）購(gòu)自英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司；瓊脂糖凝膠電泳DNA回收試劑盒（CW2302M）購(gòu)自江蘇康為世紀(jì)生物科技股份有限公司；Nimble Cloning試劑盒（NC001）購(gòu)自海南你行生物科技有限公司。主要儀器設(shè)備：Azure C600多功能熒光成像系統(tǒng)（Azure Biosystems公司）、NanoPhotometer NP80超微量分光光度計(jì)（Implen公司）、qTOWER384 G熒光定量PCR系統(tǒng)（德國(guó)耶拿分析儀器股份公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理及采集 將SC9莖段扦插于裝滿(mǎn)基質(zhì)（沙土∶營(yíng)養(yǎng)土∶蛭石=4∶1∶1）的花盆中培養(yǎng)，萌發(fā)后生長(zhǎng)40 d的盆栽苗用于后續(xù)激素處理。選取長(zhǎng)勢(shì)良好的木薯進(jìn)行3種激素（100μmol/L的MeJA、2mmol/L的SA及100μmol/L的ABA溶液）處理，各取5 mL均勻噴灑至葉片表面，并立即用塑料袋套住。在處理后0、6、9、12和24 h取木薯葉片置于液氮速凍，每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)重復(fù)，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 葉片花青素和原花青素含量測(cè)定 木薯葉片中花青素的提取參照植物花青素含量檢測(cè)試劑盒分光法。原花青素含量測(cè)定參照植物原花青素含量檢測(cè)試劑盒，根據(jù)樣本質(zhì)量計(jì)算各樣品的花青素含量和原花青素含量，每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.2.3 總RNA提取及MtANR基因克隆 采用植物總RNA提取試劑盒（DP441）提取SC9、花葉木薯及紫葉木薯葉片總RNA，以及SC9嫩葉、成熟葉、葉柄、莖、脆性胚性愈傷組織（FEC）、花、芽、須根和塊根總RNA。利用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA 的質(zhì)量和完整性，使用NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)測(cè)定濃度。cDNA第一鏈合成參照Thermo Scientific RevertAid RT試劑盒（K1691）說(shuō)明進(jìn)行。以3種木薯葉片cDNA為模板，利用特異擴(kuò)增引物（表1）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系50.0μL：2×Rapid Taq Master Mix 25.0μL，500 ng/μL cDNA模板2.0 μL，10μmol/L上、下游引物各0.5μL，ddH2O補(bǔ)足至

50.0μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用0.8%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，利用DNA回收試劑盒回收目的片段，連接至Blunt 載體上，將菌液PCR鑒定為陽(yáng)性的菌落送至廣州艾基生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.2.4 生物信息學(xué)分析 使用ProtParam在線工具（https：//web.expasy.org/protparam/）預(yù)測(cè)蛋白的基本理化性質(zhì)；運(yùn)用SignalP-5.0在線工具（https：//services.信號(hào)肽；利用TMHMM-2.0在線工具（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）預(yù)測(cè)蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)；分別采用SOPMA在線工具（https：//npsa.lyon.inserm.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_sopma.html）和SWISS-MODEL在線工具（https：//

swissmodel.expasy.org/interactive）對(duì)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.2.5 MeANR蛋白亞細(xì)胞定位 利用Primer 5.0 設(shè)計(jì)帶有接頭的MeANR基因全長(zhǎng)擴(kuò)增引物（表1），以SC9葉片cDNA為模板，擴(kuò)增MeANR基因片段，并采用Nimble Cloning試劑盒（NC001）構(gòu)建pNC-Green-35S：：GFP-MeANR表達(dá)載體，具體操作參照Yan等（2020）的方法。參照An等（2022）的方法瞬時(shí)轉(zhuǎn)化煙草，3 d后使用激光共聚焦顯微鏡觀察MeANR蛋白的定位情況。

1.2.6 MeANR基因表達(dá)模式檢測(cè) 利用Primer 5.0 設(shè)計(jì)MeANR基因的定量引物（表1），通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)MeANR基因在3種顏色葉片、SC9不同組織及3種激素處理后的表達(dá)情況。以MeActin 為內(nèi)參基因，其引物序列見(jiàn)表1。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。反應(yīng)體系10.0μL：qPCR SYBR Green Master Mix 5.0μL，10μmol/L上、下游引物各0.5μL，200 ng/μL cDNA模板1.0μL，ddH2O補(bǔ)足至10.0μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 10 s，55 ℃ 10 s，72 ℃ 20 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。以SC9葉片為對(duì)照，按

2-ΔΔCt法計(jì)算MeANR基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.7 轉(zhuǎn)MeANR基因脅迫試驗(yàn) 采用同源重組方法將MeANR基因連接至酵母表達(dá)載體pDR196 中，所用引物（pDR196-MeANR）如表1所示。構(gòu)建好的重組載體命名為pDR196-MeANR，參照釀酒酵母高效感受態(tài)細(xì)胞制備試劑盒說(shuō)明將其轉(zhuǎn)化酵母菌株W303，30 ℃ 220 r/min搖動(dòng)培養(yǎng)過(guò)夜，調(diào)至OD600 nm為1.0，加入100μmol/L MeJA、2 mmol/L SA及100μmol/L ABA處理24 h后，依次稀釋10倍、100 倍和1000倍，點(diǎn)接至SD/-Ura固體培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)3d。以正常培養(yǎng)作為對(duì)照，比較轉(zhuǎn)pDR196-MeANR重組載體和pDR196空載體的酵母菌株生長(zhǎng)情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2013和DPS v7.05對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析，采用Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同葉片顏色的木薯中花青素和原花青素含量比較

由圖1可知，SC9的成熟葉片為綠色，花葉木薯的成熟葉片為黃綠相間，紫葉木薯的成熟葉片為紫色。由表2可知，SC9、花葉木薯和紫葉木薯葉片的花青素含量和原花青素含量均存在顯著差異（Plt;0.05，下同），其中紫葉木薯葉片的花青素含量最高，達(dá)444.59 ng/g，分別為SC9和花葉木薯的24.48和28.32 倍，表明木薯葉片顏色深度與花青素含量存在正相關(guān)性。

2.2 MeANR基因克隆結(jié)果

分別以SC9、花葉木薯和紫葉木薯葉片cDNA為模板，擴(kuò)增獲得約1000 bp片段，如圖2所示。經(jīng)測(cè)序比對(duì)發(fā)現(xiàn)，SC9、花葉木薯和紫葉木薯葉片中MeANR 基因編碼區(qū)（CDS）序列一致，長(zhǎng)度均為1041 bp，但均有7個(gè)堿基與Phytozome數(shù)據(jù)庫(kù)中公布的ANR基因序列（登錄號(hào)：Manes.16G016400）不一致，分別為第51位G變?yōu)镃，第174位C變?yōu)門(mén)，第181位C變?yōu)門(mén)，第192位C變?yōu)镚，第204位G變?yōu)門(mén)，第447位T 變?yōu)镚，第574位T變?yōu)镚（圖3）。

2.3 MeANR蛋白生物信息學(xué)分析結(jié)果

MeANR蛋白由346個(gè)氨基酸組成，分子量為37836.38 Da，理論等電點(diǎn)6.16，半衰期30 h，不穩(wěn)定指數(shù)34.86，屬于穩(wěn)定蛋白，其中異亮氨酸含量最高，達(dá)10.4%，帶負(fù)電殘基的總數(shù)為38個(gè)，帶正電殘基的總數(shù)為36個(gè)，親/疏水性指數(shù)為-0.125，說(shuō)明MeANR 為親水性蛋白。SignalP-5.0預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，MeANR 蛋白N末端無(wú)信號(hào)肽（圖4-A）；TMHMM-2.0預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，MeANR蛋白無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)（圖4-B），說(shuō)明MeANR屬于非分泌蛋白或非跨膜蛋白，可能以游離態(tài)形式存在。

由圖5可知，MeANR蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中，無(wú)規(guī)則卷曲和α-螺旋占比較大，分別為42.77%和37.28%，而延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角占14.17%和5.78%，三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果基本一致。

2.4 MeANR蛋白亞細(xì)胞定位結(jié)果

利用根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)瞬時(shí)轉(zhuǎn)化法，將pNC-Green-35S：：GFP-MeANR表達(dá)載體注射到煙草葉片中，恒溫培養(yǎng)室培養(yǎng)3 d后，利用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察，結(jié)果如圖6所示。綠色熒光蛋白（GFP）集中在本氏煙葉片表皮細(xì)胞的葉綠體上，表明MeANR 蛋白主要分布于葉綠體中，推測(cè)MeANR蛋白為葉綠體蛋白。

2.5 MeANR基因的表達(dá)模式分析結(jié)果

2.5.1 不同顏色葉片中MeANR基因表達(dá)差異分析

由圖7可知，MeANR基因在花葉木薯葉片中的相對(duì)表達(dá)量最高，顯著高于在紫葉木薯和SC9葉片中的相對(duì)表達(dá)量，在紫葉木薯葉片中的相對(duì)表達(dá)量最低。結(jié)合表2可知，木薯葉片顏色越深，原花青素含量和花青素含量越高，而MeANR基因的表達(dá)水平越低。

2.5.2 MeANR基因組織表達(dá)特性分析

由圖8可知，MeANR基因在SC9木薯9個(gè)不同組織均有表達(dá)，在芽、嫩葉、成熟葉和花中相對(duì)表達(dá)量較高，其中MeANR基因在芽、嫩葉和花中的相對(duì)表達(dá)量分別為塊根的32.25、20.27和12.58倍，而在莖中的相對(duì)表達(dá)量最低。綜上所述，MeANR基因的表達(dá)具有明顯的組織特異性。

2.5.3 MeANR基因在不同激素處理下表達(dá)情況

不同激素處理下MeANR基因的相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)結(jié)果如圖9所示。MeANR基因的表達(dá)受SA抑制，而ABA和MeJA誘導(dǎo)其表達(dá)。SA處理后24 h抑制效果最明顯，MeANR基因的相對(duì)表達(dá)量比脅迫處理0h顯著下降68%；隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，MeANR 基因的相對(duì)表達(dá)量呈先下降后上升再下降的變化趨勢(shì)（圖9-A）。在ABA和MeJA處理下，MeANR基因的相對(duì)表達(dá)量總體上呈上升趨勢(shì)，但出現(xiàn)峰值的時(shí)間不一致，ABA處理后24 h達(dá)峰值，MeJA處理后9 h達(dá)峰值，分別是脅迫處理0 h的131.66和90.17倍（圖9-B和9-C）。

2.6 轉(zhuǎn)基因酵母菌誘導(dǎo)試驗(yàn)結(jié)果

轉(zhuǎn)MeANR基因酵母菌在不同激素處理下的生長(zhǎng)情況如圖10所示。轉(zhuǎn)MeANR基因酵母菌在SA 處理下酵母菌存活率低于對(duì)照（轉(zhuǎn)pDR196空載體的酵母菌）（圖10-A），而在ABA和MeJA處理下轉(zhuǎn)MeANR基因酵母菌的生長(zhǎng)情況優(yōu)于對(duì)照（圖10-B和圖10-C），表明MeANR基因在酵母菌中的表達(dá)受SA 抑制，受ABA和MeJA誘導(dǎo)。

3 討論

木薯是我國(guó)熱區(qū)重要的生物質(zhì)能源和飼料，其葉片可作為動(dòng)物飼料的加工原料，也可飼養(yǎng)木薯蠶。由于紫葉木薯葉片富含花青素，因此作為木薯蠶飼料潛力較大（曹萌萌等，2022）。ANR是花青素生物合成途徑中的關(guān)鍵酶，對(duì)花青素含量有重要影響（余永亮等，2023）。研究木薯ANR對(duì)改善木薯葉片品質(zhì)、提高木薯葉片經(jīng)濟(jì)價(jià)值具有重要意義。

本研究發(fā)現(xiàn)3種顏色的木薯葉片中MeANR基因的CDS序列一致，均與Phytozome數(shù)據(jù)庫(kù)中公布的MeANR基因序列存在7個(gè)堿基差異。在SC9木薯葉片中瞬時(shí)沉默MeANR基因，新長(zhǎng)出的葉片顏色變紫，且沉默效率越高，紫色越深（Luo et al.，2023），表明MeANR是木薯葉片花青素積累的負(fù)調(diào)控基因。由于綠葉木薯（SC9）和紫葉木薯中MeANR基因CDS并無(wú)差異，推測(cè)導(dǎo)致葉片顏色差異的原因是MeANR基因在紫葉木薯中的相對(duì)表達(dá)量較低，也可能是MeANR基因啟動(dòng)子區(qū)域存在差異，仍需進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。后續(xù)研究可分別擴(kuò)增3種顏色的木薯葉片中MeANR基因的啟動(dòng)子序列，篩選上游調(diào)控MeANR基因的轉(zhuǎn)錄因子，構(gòu)建MeANR基因過(guò)表達(dá)載體及基因編輯載體，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法遺傳轉(zhuǎn)化SC9木薯FEC，驗(yàn)證MeANR基因表達(dá)變化對(duì)木薯葉片花青素含量的影響，為提高木薯葉片品質(zhì)提供理論依據(jù)。本研究對(duì)MeANR基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MeANR蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋和無(wú)規(guī)卷曲組成，而延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角占比較少，與越橘（宋楊等，2019）、紅花（魯?shù)ささ龋?022）等物種的ANR蛋白一致；MeANR屬于穩(wěn)定的親水性蛋白，不存在信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)，與紅花CtANR3蛋白理化性質(zhì)及蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)（魯?shù)ささ龋?023）一致。

本研究實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MeANR基因在花葉木薯葉片中的相對(duì)表達(dá)量最高，在紫葉木薯葉片中的相對(duì)表達(dá)量最低；MeANR基因主要在SC9木薯的芽、嫩葉、成熟葉和花中高表達(dá)，而在莖中的低表達(dá)，與芒果不同品種ANR基因表達(dá)模式（李先良等，2017）及葡萄（Bogs et al.，2005）、川桑（孟帥，2019）中ANR基因在不同組織的表達(dá)特性基本一致。上述結(jié)果表明，ANR基因在不同植物品種及不同組織的表達(dá)差異較大。研究表明，植物激素可調(diào)節(jié)花青素和原花青素等物質(zhì)的合成，外源激素及環(huán)境因子共同作用于結(jié)構(gòu)基因，進(jìn)而影響植物花青素含量（王華等，2015）。本研究還發(fā)現(xiàn)，MeANR基因?qū)A、ABA和MeJA處理均有不同程度的響應(yīng)，SA處理下隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，MeANR基因的相對(duì)表達(dá)量呈先下降后上升的趨勢(shì)，處理后24h抑制效果最顯著，且轉(zhuǎn)MeANR基因的酵母菌在SA誘導(dǎo)后酵母菌存活率低于對(duì)照（轉(zhuǎn)pDR196空載體的酵母菌）；ABA和MeJA處理下，MeANR基因的相對(duì)表達(dá)量均呈不同程度的上升，且轉(zhuǎn)MeANR基因酵母菌在誘導(dǎo)后存活率顯著高于對(duì)照。早期研究發(fā)現(xiàn)，外源ABA和MeJA能通過(guò)上調(diào)花青素合成相關(guān)基因的表達(dá)水平，進(jìn)而誘導(dǎo)植物花青素的生物合成（Shen et al.，2014；An et al.，2018；陳俊潔等，2020），同時(shí)外源GA3處理也可促進(jìn)花青素的積累（Weiss et al.，1995），但SA、ABA和MeJA在調(diào)節(jié)木薯花青素合成過(guò)程中的作用機(jī)制和分子機(jī)制尚未清晰，仍需進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。此外，不同物種中植物花青素調(diào)控機(jī)制也會(huì)存在差異（王如鳳等，2019），仍有待深入研究。

4 結(jié)論

木薯葉片顏色深度與花青素含量存在正相關(guān)性，MeANR是木薯葉片花青素積累的負(fù)調(diào)控基因，具有明顯的組織表達(dá)特異性，受SA抑制，受ABA和MeJA誘導(dǎo)。

參考文獻(xiàn)（（References））：

曹萌萌，楊龍，陳松筆，安飛飛. 2022. 不同木薯葉營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)飼養(yǎng)木薯蠶的影響［J］. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，53（6）：1759-1767. ［Cao M M，Yang L，Chen S B，An F F. 2022. Effects of cassava leaves nutrient components on eri-silkworm bree-ding［J］. Journal of Southern Agriculture，53（6）：1759-1767.］ doi：10.3969/j.issn.2095-1191.2022.06.030.

曹升，陳江楓，黃富宇，嚴(yán)華兵，韋朝念，李富山，陸柳英，覃夏燕，陳會(huì)鮮，李恒銳. 2021. 廣西木薯產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀分析及其發(fā)展建議［J］. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，52（6）：1468-1476.［ Cao S，Chen J F，Huang F Y，Yan H B，Wei C N，Li F S，Lu L Y，Qin X Y，Chen H X，Li H R. 2021. Development status and countermeasures of cassava industry in Guangxi［J］. Guangxi Agricultueal Sciences，52（6）：1468-1476.］ doi：10.3969/j.issn.2095-1191.2021.06.005.

陳俊潔，梅松，胡彥如. 2020. 脫落酸激素誘導(dǎo)擬南芥幼苗中花青素的合成［J］. 廣西植物，40（8）：1169-1180.［ Chen J J，Mei S，Hu Y R. 2020. Abscisic acid induces anthocyanin synthesis in Arabidopsis thaliana seedlings［J］. Guihaia，40（8）：1169-1180.］ doi：10.11931/guihaia.gxzw201902021.

郭松，常慶瑞，趙澤英，李莉婕，童倩倩. 2024. 基于高光譜的不同生育期玉米花青素含量估測(cè)［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，40（2）：303-311.［ Guo S，Chang Q R，Zhao Z Y，Li L J，Tong Q Q. 2024. Estimation of anthocyanin content in maize at different growth stages based on hyperspectral technology［J］. Jiangsu Journal of Agricultural Sciences，40（2）：303-311.］ doi：10.3969 /j.issn.1000-4440.2024.02.012.

李先良，趙志常，高愛(ài)平，陳業(yè)淵，黃建峰，黨志國(guó)，羅睿雄. 2017. 芒果ANR基因的克隆及其表達(dá)分析［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，45（4）：22-25.［ Li X L，Zhao Z C，Gao A P，Chen Y Y，Huang J F，Dang Z G，Luo R X. 2017. Cloning and expression analysis of mango ANR gene［J］. Jiangsu Agri‐cultural Sciences，45（4）：22-25.］ doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2017.04.006.

劉愷媛，王茂良，辛海波，張華，叢日晨，黃大莊. 2021. 植物花青素合成與調(diào)控研究進(jìn)展［J］. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，37（14）：41-51.［ Liu K Y，Wang M L，Xin H B，Zhang H，Cong R C，Huang D Z. 2021. Anthocyanin biosynthesis and regu‐late mechanisms in plants：A review［J］. Chinese Agricul‐tural Science Bulletin，37（14）：41-51.］ doi：10.11924/j.issn. 1000-6850.casb2020-0390.

魯?shù)さ?，譚政委，李磊，余永亮，許蘭杰，楊紅旗，董薇，梁慧珍. 2022. 紅花花青素還原酶基因ANR的克隆及表達(dá)分析［J］. 核農(nóng)學(xué)報(bào)，36（3）：517-526.［ Lu D D，Tan Z W，Li L，Yu Y L，Xu L J，Yang H Q，Dong W，Liang H Z. 2022. Cloning and expression analysis of anthocyanidin reduc‐tase gene ANR in Carthamus tinctorius L［. J］. Journal of Nuclear Agricultural Sciences，36（3）：517-526.］ doi：10. 11869/j.issn.100-8551.2022.03.0517.

魯?shù)さぃT政委，余永亮，李磊，許蘭杰，楊紅旗，楊青，董薇，安素妨，梁慧珍. 2023. 紅花CtANR2和CtANR3基因的克隆、結(jié)構(gòu)及表達(dá)模式分析［J］. 華北農(nóng)學(xué)報(bào)，38（1）：84-93. ［Lu D D，Tan Z W，Yu Y L，Li L，Xu L J，Yang H Q，Yang Q，Dong W，An S F，Liang H Z. 2023. Cloning，structure and expression profile analysis of CtANR2 and CtANR3 genes from Carthamus tinctorius L［. J］. Acta Agriculturae Boreali-Sinica，38（1）：84-93.］ doi：10.7668/hbnxb.2019 3450.

孟帥. 2019. 川桑原花青素合成關(guān)鍵酶基因LAR和ANR的鑒定與功能研究［D］. 重慶：西南大學(xué) . ［Meng S. 2019. Identification and functional analyses of LAR and ANR encoding key enzymes in proanthocyanidins from mulberry［D］. Chongqing：Southwest University.］

申玉曉. 2019. 玫瑰MYB轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控類(lèi)黃酮介導(dǎo)的逆境響應(yīng)機(jī)制研究［D］. 武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué).［ Shen Y X. 2019. MYB transcription factors regulate flavonoid-mediated stress response in Rose rugosa［D］. Wuhan：Huanzhong Agricultural University.］

宋楊，劉紅弟，王海波，張紅軍，劉鳳之. 2019. 越橘原花青素合成相關(guān)基因 VcLAR和 VcANR的克隆和功能鑒定［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，35（3）：682-688.［ Song Y，Liu H D，Wang H B，Zhang H J，Liu F Z. 2019. Molecular cloning and functional identification of proanthocyanidin synthesis related genes VcLAR and VcANR of blueberry［J］. Jiangsu Journal of Agricultural Sciences，35（3）：682-688.］ doi：10. 3969/j.issn.1000-4440.2019.03.025.

王華，李茂福，楊媛，金萬(wàn)梅. 2015. 果實(shí)花青素生物合成分子機(jī)制研究進(jìn)展［J］. 植物生理學(xué)報(bào)，51（1）：29-43.［ Wang H，Li M F，Yang Y，Jin W M. 2015. Recent advances on the molecular mechanisms of anthocyanin synthesis in fruits［J］. Plant Physiology Journal，51（1）：29-43.］ doi：10. 13592/j.cnki.ppj.2014.0321.

王琴飛，吳秋妃，徐緩，林立銘，張振文. 2018. 木薯葉片中黃酮醇類(lèi)物質(zhì)的提取與檢測(cè)［J］.西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，31（8）：1694-1699.［ Wang Q F，Wu Q F，Xu H，Lin L M，Zhang Z W. 2018. Extraction and detection of flavonols from ca-ssava leaves［J］. Southwest China Journal of Agricultural Sciences，31（8）：1694-1699.］ doi：10.16213/j.cnki.scjas. 2018.8.024.

王如鳳，苗柯，曹方園，方榮俊，潘剛，趙衛(wèi)國(guó)，張林，程嘉翎，劉利. 2019. 桑樹(shù)二氫黃酮醇-4-還原酶和花青素合酶基因在桑椹中的表達(dá)譜及其與花青素含量的關(guān)系［J］. 蠶業(yè)科學(xué)，45（6）：790-798.［ Wang R F，Miao K，Cao F Y，F(xiàn)ang R J，Pan G，Zhao W G，Zhang L，Cheng J L，Liu L. 2019. Expression pattern of mulberry dihydroflavonol 4-reductase and anthocyanidin synthase genes and their rela‐tionship with anthocyanidin content in mulberry frui［t J］. Acta Sericologica Sinica，45（6）：790-798.］ doi：10.13441/j.cnki.cykx.2019.06.002.

武傳建，戚驍，李仁賽，封功成，蘇靜靜，葛海軍，馬代夫，王愛(ài)民. 2017. 甘薯IbANR基因的多態(tài)性分析［J］. 江蘇師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），35（1）：30-33.［ Wu C J，Qi X，Li R S，F(xiàn)eng G C，Su J J，Ge H J，Ma D F，Wang A M. 2017. Polymorphic analyses of IbANR gene from sweetpotato［J］. Journal of Jiangsu Normal University（ Natural Science Edition），35（1）：30-33.］ doi：10.3969/j.issn.2095-4298. 2017.01.007.

楊波，劉海霞，牛鐵泉，張鵬飛，梁長(zhǎng)梅，趙旗峰，溫鵬飛 . 2021. TRV介導(dǎo)的葡萄葉片 VvANR基因瞬時(shí)表達(dá)分析［J］. 核農(nóng)學(xué)報(bào)，35（4）：826-836.［ Yang B，Liu H X，Niu T Q，Zhang P F，Liang C M，Zhao Q F，Wen P F. 2021. Tran‐sient ecpression analysis of VrANR gene in grape leaves mediated by TRV［J］. Journal of Nuclear Agricultural Sciences，35（4）：826-836.］ doi：10.11869/j.issn.100-8551. 2021.04.0826.

余永亮，魯?shù)さ?，譚政委，楊紅旗，李磊，許蘭杰，楊青，董薇，安素妨，郭水柱，高松，梁慧珍. 2023. 不同品種忍冬ANR基因克隆、表達(dá)模式及原核表達(dá)分析［J］. 藥學(xué)學(xué)報(bào)，58（11）：3449-3460.［ Yu Y L，Lu D D，Tan Z W，Yang H Q，Li L，Xu L J，Yang Q，Dong W，An S F，Guo S Z，Gao S，Liang H Z. 2023. Effects of cassava leaves nutrient compo‐nents on eri-silkworm breeding［J］. Acta Pharmaceutica Sinica，58（11）：3449-3460.］ doi：10.16438/j.0513-4870. 2023-0608.

張振文，徐緩，吳秋妃，林立銘，李開(kāi)綿. 2018. 木薯葉花青素提取工藝研究［J］. 熱帶作物學(xué)報(bào)，39（3）：570-574.［ Zhang Z W，Xu H，Wu Q F，Lin L M，Li K M. 2018. Extraction of anthocyanin from cassava leaves［J］. Chinese Journal of Tropical Crops，39（3）：570-574.］ doi：10.3969/j.issn.1000-2561.2018.03.026.

Albert S，Delseny M，Devic M. 2010. BANYULS，a novel negative regulator of flavonoid biosynthesis in the Arabi‐dopsis seed coa［t J］. The Plant Journal，11（2）：289-299. doi：10.1046/j.1365-313X.1997.11020289.x.

An F F，Xiao X H，Chen T，Xue J J，Luo X Q，Ou W J，Li K M，Cai J，Chen S B. 2022. Systematic analysis of bHLH tran‐scription factors in cassava uncovers their roles in posthar‐vest physiological deterioration and cyanogenic glycosides biosynthesis［J］. Frontiers in Plant Science，13：901128. doi：10.3389/fpls.2022.901128.

An J P，Yao J F，Xu R R，You C X，Wang X F，Hao Y J. 2018. Apple bZIP transcription factor MdbZIP44 regulates abscisic acid-promoted anthocyanin accumulation［J］. Plant Cell and Environment，41（11）：2678-2692. doi：10.1111/pce.13393.

Bogs J，Downey M O，Harvey J S，Ashton A R，Tanner G J，Robinson S P. 2005. Proanthocyanidin synthesis and expression of genes encoding leucoanthocyanidin reduc‐tase and anthocyanidin reductase in developing grape be-rries and grapevine leaves［J］. Plant Physiology，139（2）：652-663. doi：10.1104/PP.105.064238.

Dela G，Or E，Ovadia R，Nissim-Levi A，Weiss D，Oren-Shamir M. 2003. Changes in anthocyanin concentration and com‐position in ‘Jagua’ rose flowers due to transient high-temperature condition［s J］. Plant Science，164（3）：333-340. doi：10.1016/S0168-9452（02）00417-X.

Gargouri M，Gallois B，Chaudière J. 2009. Binding-equilibrium and kinetic studies of anthocyanidin reductase from Vitis vinifera［J］. Archives of Biochemistry and Biophysics，491（1-2）：61-68. doi：10.1016/j.abb.2009.09.010.

Han YP，Vimolmangkang S，Soria-Guerra R E，Korban S S. 2012. Introduction of apple ANR gene into tobacco inhi-bits expression of both CHI and DFR gene in flowers，lea-ding to loss of anthocyanin［J］. Journal of Experimental Botany，63（7）：2437-2447. doi：10.1093/jxb/err415.

Jaakola L. 2013. New insights into the regulation of anthocya-nin biosynthesis in fruits［J］. Trends in Plant Science，18（9）：477-483. doi：10.1016/j.tplants.2013.06.003.

Kong J M，Chia L S，Goh N K，Chia T F，Brouillard R. 2003. Analysis and biological activities of anthocyanins［J］. Phy‐tochemistry，64（5）：923-933. doi：10.1016/s0031-9422（03） 00438-2.

Latif S，Müller J. 2015. Potential of cassava leaves in human nutrition：A review［J］. Trends in Food Science ＆ Techno-logy，44（2）：147-158. doi：10.1016/j.tifs.2015.04.006.

Luo X Q，An F F，Xue J J，Zhu W L，Wei Z W，Ou W J，Li K M，Chen S B，Cai J. 2023. Integrative analysis of metabo‐lome and transcriptome reveals the mechanism of color for‐mation in cassava （Manihot esculenta Crantz） leaves［J］. Frontiers in Plant Science，14：1181257. doi：10.3389/fpls. 2023.1181257.

Matsui K，Hisano T，Yasui Y，Mori M，Walker A R，Morishita T，Katsu K. 2016. Isolation and characterization of genes encoding leucoanthocyanidin reductase（FeLAR） and an-thocyanidin reductase （FeANR） in buckwheat （Fagopy‐rum esculentum）［J］. Journal of Plant Physiology，205：41-47. doi：10.1016/j.jplph.2016.08.010.

Rabbi I Y，Kayondo S I，Bauchet G，Yusuf M，Aghogho C I，Ogunpaimo K，Uwugiaren R，Smith I A，Peteti P，Agbona A，Parkes E，Lydia E，Wolfe M，Jannink J L，Egesi C，Kulakow P. 2022. Genome-wide association analysis reveals new insights into the genetic architecture of defen‐sive，agro-morphological and quality-related traits in cas‐sava［J］. Plant Molecular Biology，109（3）：195-213. doi：10.1007/s11103-020-01038-3.

Shen X J，Zhao K，Liu L L，Zhang K C，Yuan H Z，Liao X，Wang Q，Guo X W，Li F，Li T H. 2014. A role for Pac‐MYBA in ABA-regulated anthocyanin biosynthesis in red-colored sweet cherry cv. Hong Deng （Prunus avium L.） ［J］. Plant and Cell Physiology，55（5）：862-880. doi：10. 1093/pcp/pcu013.

Weiss D，van der Luit A，Knegt E，Vermeer E，Mol J N M，Kooter J M. 1995. Identification of endogenous gibberel‐lins in petunia flowers （induction of anthocyanin biosyn‐thetic gene expression and the antagonistic effect of abscisic acid）［J］. Plant Physiology，107（3）：695-702. doi：10.1104/pp.107.3.695.

Yan P，Zeng Y J，She W T，Tuo D C，Li X Y，Zhou P. 2020. Nimble cloning：A simple，versatile，and efficient system for standardized molecular cloning［J］. Frontiers in Bioen‐gineering and Biotechnology，7：460. doi：10.3389/fbioe. 2019.00460.

Zhang Z，Chen C，Jiang C Y，Lin H，Zhao Y H，Guo Y S. 2024. VvWRKY5 positively regulates wounding-induced antho‐cyanin accumulation in grape by interplaying with VvMYBA1 and promoting jasmonic acid biosynthesis［J］. Horticulture Research，11（5）：uhae083. doi：10.1093/hr/uhae083.