丁惠如, 趙 敏, 程寧寧, 付遠輝, 彭向雷, 虞結(jié)梅, 鄭妍鵬, 何金生

(北京交通大學生命科學與生物工程研究院, 北京 100044)

人呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus, RSV)是人類呼吸道疾病的重要病原體,所引發(fā)的感染是導(dǎo)致兒童下呼吸道疾病和毛細支氣管炎的主要病因,也是老年人和免疫功能低下患者發(fā)病和死亡的重要原因[1-3]。與RSV相關(guān)的呼吸道感染已成為全世界范圍內(nèi)主要的公共衛(wèi)生問題之一,盡管從20世紀60年代起已開始研發(fā)RSV疫苗和治療藥物,但目前不僅仍無安全、有效的疫苗問世,針對RSV感染的抗病毒治療藥物也非常有限。迄今為止,僅有利巴韋林(Ribavirin)和帕利珠單抗(Palivizumab)兩種藥物用于防治RSV感染[4-6]。然而,Ribavirin療效欠佳、副作用大,存在一定的健康風險,并不建議常規(guī)使用[7-9]。Palivizumab是特異性針對RSV F蛋白的人源化單克隆抗體,已獲美國FDA批準,可用于預(yù)防高危嬰幼兒因RSV感染而引發(fā)嚴重下呼吸道疾病,但其價格昂貴且不能用于RSV感染后的治療[10-12]。因此,尋找安全、高效的抗RSV治療性藥物,仍是當前亟待解決的重要課題。

目前,抗RSV藥物研發(fā)主要使用永生化的非極化上皮細胞系或RSV半許可復(fù)制動物模型[13-15]。永生化的呼吸道來源的細胞系,如HEp-2、BEAS-2B和A549細胞等,雖然在抗RSV藥物體外藥效評價具有一定價值,但很難反映呼吸道上皮細胞的復(fù)雜性[16-17]。小鼠等嚙齒動物模型對RSV感染是半許可復(fù)制,亦難以再現(xiàn)人類RSV感染特征,作為抗病毒藥物功效評價具有一定的局限性[18]。研究表明[19-23],人原代呼吸道上皮細胞(Human airway epithelial cell,hAEC)在允許細胞極化的條件下培養(yǎng)時會發(fā)生顯著的形態(tài)變化,可準確重現(xiàn)其正常的在體形態(tài)。與非極化的上皮細胞相比,極化的呼吸道上皮細胞能夠最大程度模擬體內(nèi)呼吸道情況。因此,原代培養(yǎng)的呼吸道上皮細胞,尤其是分化良好的hAEC在抗RSV藥物篩選、藥效評價等方面受到廣泛青睞。本研究建立了hAEC的培養(yǎng)方法并構(gòu)建了RSV的體外感染模型,在該模型上檢測了小分子化合物RSV-A-4和6-MMPr的抗RSV活性及其細胞毒性,進而探討兩種化合物抑制RSV復(fù)制的作用機制,為RSV藥物研發(fā)和發(fā)病機制等研究提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠胚胎成纖維細胞(NIH/3T3)購自中國科學院上海細胞庫;野生型RSV-long株購自美國ATCC;RSV-mGFP由法國Université de Versailles Saint-Quentin-en-Yvelines 大學Marie-Anne Rameix-Welti博士饋贈;RSV-A-4為前期本實驗室從國家新化合物庫篩選并結(jié)構(gòu)優(yōu)化的小分子化合物;6-MMPr和Ribavirin購自上海陶素生化科技有限公司;RSV-604和GS-5806購自美國MCE公司。

1.2 方法

1.2.1 hAEC標本的獲取及培養(yǎng)

采集志愿者鼻拭子(志愿者為本課題組學生,均獲知情同意,并經(jīng)北京交通大學理學院倫理審查委員會批準),浸泡于培養(yǎng)基中,充分洗滌后,450 g,室溫離心5 min,棄上清液,用F培養(yǎng)基(DMEM/F12,Gibco BRL, 美國)重懸后,加入到生長有NIH/3T3細胞的T25培養(yǎng)瓶中,37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng);每天更換F培養(yǎng)基,5 d后更換為無抗生素的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),hAEC生長密度達50%以上時進行傳代。

1.2.2 hAEC形態(tài)學觀察和活力測定

每天定時在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài),當hAEC生長密度達到80%時,采用胰酶消化細胞,制備單細胞懸液,0.4%臺盼藍染液染色后,置于倒置顯微鏡下觀察,隨機取3個視野統(tǒng)計死細胞與活細胞數(shù)目,進而計算hAEC的細胞存活率。

1.2.3 hAEC免疫熒光染色鑒定

按5×104個細胞/孔,將hAEC接種于置入細胞爬片的6孔板中,37 ℃、5% CO2培養(yǎng),每天換液并記錄細胞狀態(tài),當細胞豐度達到80%左右時,吸出培養(yǎng)基,PBS洗3次后,用預(yù)冷的95%乙醇4 ℃固定30 min;棄去乙醇,PBS洗3次,加入含5%胎牛血清的封閉液,37 ℃封閉30 min;PBS洗3次,加入兔抗人角蛋白單克隆抗體(Abcam,Cat.No.ab53280)(1∶1 000稀釋),37 ℃孵育1 h;PBS 洗3次,加入山羊抗兔 DyLight488 熒光二抗(Abcam,Cat.No.ab96899)(1∶5 000稀釋),37 ℃孵育1 h;PBS洗滌后,加入DAPI 核染劑染色15 min,最后用90%甘油進行封片后在顯微鏡下觀察。

1.2.4 RSV感染hAEC

P3代hAEC生長密度達到60%時準備接毒,棄去原培養(yǎng)基,PBS洗1次,加入7 mL 2%細胞維持液,按0.1 MOI接種 RSV-mGFP病毒,混勻,37 ℃、5% CO2培養(yǎng),接毒約20 h后,更換維持液,每天觀察細胞病變情況,待細胞完全病變后,收集病毒。

1.2.5 細胞活性檢測(MTS法)

按1.5×104個細胞/孔將hAEC接種于96孔板,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)過夜;棄去原培養(yǎng)基,PBS洗過后,將0.1、1、10、100和1 000 μmol/L的待測化合物加入96孔板中,100 μL/孔,設(shè)置陰性對照、陽性對照組(Ribavirin)及空白對照。37 ℃培養(yǎng)48 h,棄原培養(yǎng)基,PBS洗1次,避光將MTS和PMS按照20∶1混合,并將20 μL混合液與100 μL 2%細胞維持液加入到96孔板中,37 ℃孵育3 h后,使用多能酶標儀檢測490 nm處OD值,計算細胞活性CC50。

細胞活性=(實驗組吸光度值-空白對照組吸光度值)/(細胞陰性對照組吸光度值-空白對照組吸光度值)×100%

1.2.6 化合物抑制RSV復(fù)制活性分析

按2×104個細胞/孔將hAEC接種于黑色透明底96孔板,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h后,將濃度為0.02、0.2、2、20和200 μmol/L的待測化合物分別與3 000 PFU/50 μL的 RSV-mGFP等體積混合,按100 μL/孔加入96孔板中,同時設(shè)置陰性對照(DMSO稀釋50倍)和病毒對照組(只加3 000 PFU的RSV-mGFP),37 ℃,5% CO2培養(yǎng)48 h,用多功能酶標儀檢測綠色熒光蛋白的熒光強度,并計算IC50。

1.2.7 Time-of-addition assay分析

將hAEC按1.5×104個細胞/孔接種于96孔板,37 ℃培養(yǎng)24 h后棄培養(yǎng)基,PBS洗1次,加入用2%維持液稀釋的RSV病毒液,每孔3 000 PFU/100 μL,37 ℃、5% CO2孵育2 h,此時間點定位第0小時,棄去培養(yǎng)基,PBS洗滌1次,加入90 μL維持液,37 ℃培養(yǎng);將化合物用維持液稀釋,使稀釋濃度低于其CC50,但大于IC50,RSV-A-4、6-MMPr、RSV-604、GS-5806及Ribavirin分別為1 mmol/L、50 μmol/L、10 μmol/L、1 mmol/L和100 μmol/L,設(shè)立陰性對照組;分別于-1、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13及14 h時,加入10 μL不同化合物及DMSO,加入病毒約24 h后,PBS洗3次,提取細胞與病毒RNA,RT-qPCR測定RSV病毒滴度。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

正態(tài)分布數(shù)據(jù)選用t檢驗和單因素方差分析方法,非正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗,通過IBM SPSS statistics 22軟件進行統(tǒng)計學分析,通過GraphPad Prism 8作圖,以P<0.05作為不同組間差異具有顯著性的標準。

2 結(jié)果與分析

2.1 hAEC細胞培養(yǎng)與鑒定

2.1.1 hAEC形態(tài)學觀察

顯微鏡下觀察hAEC生長情況,結(jié)果如圖1所示。接種hAEC第2 天,即可見有原代細胞出現(xiàn);第3～5天,細胞團逐漸變大,細胞聚集成團;第5～8天,細胞數(shù)量逐漸增多,細胞團面積也逐漸變大,細胞呈扁平狀、多邊形狀,密集呈鵝卵石鋪路樣分布生長(圖2),約占細胞培養(yǎng)瓶的80%以上;第10天,細胞匯合度達90%,說明hAEC在滋養(yǎng)層細胞上生長良好。

紅圈標示的是原代細胞,第10天時原代細胞匯合度達90%左右。圖1 hAEC的連續(xù)培養(yǎng)狀態(tài)(4×)Figure 1 The continuous culture of hAEC (4×)

hAEC傳代結(jié)果顯示(圖3),在首次傳代的第1天,即可見有小的原代細胞團出現(xiàn),待細胞長到第4天時,匯合度可達90%左右,表明首次傳代的細胞比原代培養(yǎng)的細胞生長更快。

圖3 hAEC首次傳代后生長狀態(tài)(4×)Figure 3 The growth status of hAEC after the first cell passage(4×)

2.1.2 hAEC活力測定

hAEC用0.4%臺盼藍染色后鏡檢顯示多數(shù)為強光點,只有較少數(shù)為藍色點。結(jié)果提示,原代培養(yǎng)的hAEC細胞活性較高。隨機選取3個樣本(圖4),計算hAEC存活率分別為94.23%、90.10%和95.19%,培養(yǎng)的hAEC平均細胞活力則為93.51%。

活細胞未被染色用黑色圈標示;死細胞被染色為深藍色用紅色圈標示。圖4 臺盼藍染色檢測hAEC存活率 (10×)Figure 4 The hAEC survival rate determined by trypan blue staining (10×)

2.1.3 hAEC免疫熒光染色鑒定

細胞免疫熒光染色結(jié)果顯示(圖5),hAEC經(jīng)兔抗人角蛋白單克隆抗體與山羊抗兔 DyLight488 熒光二抗結(jié)合孵育后呈陽性,胞漿著色為綠色,細胞經(jīng)DAPI復(fù)染后,細胞核為藍色,人角蛋白單克隆抗體能與培養(yǎng)的原代細胞特異性結(jié)合,表明培養(yǎng)的細胞為hAEC。

(a)hAEC細胞胞漿著色(10×);(b)hAEC細胞胞漿著色(20×);(c)hAEC細胞核經(jīng)DAPI復(fù)染后著色(10×);(d)hAEC細胞核經(jīng)DAPI復(fù)染后著色(20×);(e)merge后圖像(10×);(f)merge后圖像(20×)。圖5 免疫熒光染色鑒定hAECFigure 5 Identification of hAEC by immunofluorescence staining

2.1.4 RSV感染hAEC

如圖6所示,P3代hAEC接種RSV-mGFP 24 h時,僅有極小的融合現(xiàn)象,提示病毒開始在細胞中復(fù)制;接種48和72 h時,可見病毒大量復(fù)制,出現(xiàn)大面積細胞融合、細胞核核聚集等典型的CPE,這表明RSV能夠在hAEC中有效復(fù)制,也說明原代培養(yǎng)的hAEC可作為一種較為理想的RSV體外感染模型。

圖6 RSV-mGFP感染hAEC后細胞病變狀態(tài)Figure 6 The cytopathic effect (CPE) of hAEC infected with RSV-mGFP at different time points

2.2 RSV-A-4和6-MMPr的體外抗RSV活性

相對永生化的細胞系,原代培養(yǎng)的呼吸道上皮細胞能夠最大程度模擬體內(nèi)真實的生理狀態(tài)和個體之間的差異,因此,根據(jù)課題組前期實驗基礎(chǔ),本研究選取了RSV-A-4與6-MMPr兩種小分子化合物進行基于hAEC的抗RSV活性研究,RSV-A-4與6-MMPr對hAEC的細胞毒性及對RSV的抑制效果如表1和圖7所示。

表1 RSV-A-4和6-MMPr基于hAEC的CC50、IC50及SITable 1 The CC50, IC50 and SI of RSV-A-4 and 6-MMPr based on hAEC

(a)RSV-A-4和6-MMPr的細胞毒性檢測結(jié)果;(b)RSV-A-4和6-MMPr的抗RSV活性檢測結(jié)果。實驗結(jié)果以平均值±標準差表示,* 為P<0.05。圖7 基于hAEC的RSV-A-4和6-MMPr細胞毒性和抗RSV活性Figure 7 The cytotoxicities and anti-RSV activities of RSV-A-4 and 6-MMPr on hAEC

由表1可見,6-MMPr在hAEC上的CC50值為(95 526±10.97) μmol/L,而RSV-A-4對hAEC幾乎無毒性,RSV-A-4與6-MMPr 的IC50值分別為(207.3±4.766) μmol/L和(3 191±6.106) μmol/L。

2.3 RSV-A-4與6-MMPr均于病毒基因組復(fù)制階段抑制RSV復(fù)制

鑒于篩選的RSV-A-4和6-MMPr在hAEC體系中具有良好的抗RSV活性,本研究在hAEC中采用Time-of-addition assay對其抗病毒作用機制進行了初步探討。結(jié)果如圖8所示,在-1、0、1、2、3、4和5 h給予RSV-A-4或6-MMPr均可有效抑制RSV復(fù)制,與靶向N蛋白藥物RSV 604相似,由此推測RSV-A-4和6-MMPr主要是在RSV的感染晚期或進入細胞后發(fā)揮抗感染作用。

虛線指示RSV感染細胞的時間為2 h;實驗結(jié)果以平均值±標準差表示。圖8 RSV-A-4和6-MMPr抑制RSV復(fù)制周期結(jié)果Figure 8 The experimental results of RSV-A-4 and 6-MMPr inhibit RSV replication cycle

3 討論與結(jié)論

呼吸道上皮是呼吸道重要天然屏障,作為人類呼吸道與外界環(huán)境相連的第一道免疫防線,hAEC對維持防御功能和各項生理功能的運行起關(guān)鍵作用[24-25]。分化良好的hAEC由多層上皮細胞組成,包括纖毛、杯狀細胞和基底細胞等,可模仿人呼吸道的生理功能和形態(tài)環(huán)境,是研究RSV感染更為合適的體外模型。目前,全球范圍內(nèi)已有多個研究小組建立了人呼吸道上皮細胞的原代培養(yǎng)方法,且已將hAEC用于呼吸道病毒感染和呼吸道固有免疫等領(lǐng)域的研究[26-28]。但需要指出的是,hAEC培養(yǎng)在我國尚處于起步階段,因此,建立hAEC培養(yǎng)對開展RSV疫苗和抗RSV藥物研究具有重要價值和意義。

本文通過采集志愿者鼻拭子分離和培養(yǎng)出hAEC,并對hAEC細胞形態(tài)、活性及純度進行了鑒定,結(jié)果顯示hAEC的培養(yǎng)方法成功建立。相對細胞系,hAEC對培養(yǎng)環(huán)境和實驗操作的要求更苛刻,不規(guī)范的實驗操作可能會導(dǎo)致細胞生長緩慢、表型不一致甚至細胞污染,因而,規(guī)范實驗操作和有效控制細胞污染是獲得高質(zhì)量hAEC的關(guān)鍵因素。此外,對人呼吸道上皮細胞培養(yǎng)模型,通常從呼吸道中鼻上皮、鼻咽上皮(腺樣體)和氣管支氣管上皮這3個區(qū)域來獲得原代上皮細胞,因而優(yōu)化取材獲得合格質(zhì)量的樣本是成功培養(yǎng)hAEC的另一個關(guān)鍵因素。hAEC在體外通常只能傳代20多次,因而,如何圍繞有限傳代次數(shù)的hAEC設(shè)計實驗,經(jīng)濟高效地利用好hAEC,也是一個挑戰(zhàn)。當新收獲的或傳代的hAEC在允許細胞極化的條件下培養(yǎng)時,其細胞形態(tài)會發(fā)生顯著變化,使得細胞更準確地重現(xiàn)其正常的體內(nèi)形態(tài),獲得分化良好的極化的hAEC。在不斷探索之后發(fā)現(xiàn),當人呼吸道上皮細胞被體外培養(yǎng)在多孔載體上的氣-液兩相界面處時,其表現(xiàn)出了與體內(nèi)幾乎相同的形態(tài)學和關(guān)鍵生理學過程[29-31]。我們也曾嘗試建立基于氣-液兩相的hAEC培養(yǎng)方法,但目前尚未獲得分化良好的極化的hAEC,因而,將hAEC培養(yǎng)于多孔載體的氣-液兩相界面,獲得分化良好的極化的hAEC將是我們下一步工作的重點。

在成功培養(yǎng)出hAEC后,考察了課題組前期在Hep-2和BEAS-2B細胞系中篩選出具有抑制RSV增殖的活性骨架化合物RSV-A-4和具有廣譜抗病毒作用的硫唑嘌呤(AZA)三級代謝產(chǎn)物6-MMPr在hAEC體系中的抗RSV活性及其抗RSV活性的可能作用機制。實驗結(jié)果顯示:6-MMPr在hAEC上的CC50值為(95 526±10.97) μmol/L,而RSV-A-4對hAEC幾乎無毒性,RSV-A-4與6-MMPr 的IC50值分別為(207.3±4.766) μmol/L和(3 191±6.106) μmol/L;Time-of-addition assay實驗結(jié)果則揭示,RSV-A-4和6-MMPr的體外抗病毒活性主要是作用于RSV的復(fù)制階段,二者均是于RSV感染早期,RSV復(fù)制階段抑制RSV活性,但還需要進一步闡明RSV-A-4和6-MMPr的有效作用靶點和確切分子機制等。

綜上所述,研究成功構(gòu)建了RSV的體外感染模型hAEC,并在hAEC上考察了RSV-A-4和6-MMPr的抗RSV活性,并探討二者抗RSV的可能作用機制,為進一步研發(fā)抗RSV藥物奠定了重要基礎(chǔ)。但后續(xù)工作尚需在小鼠體內(nèi)進一步驗證RSV-A-4和6-MMPr的體內(nèi)抗病毒活性,以明確其應(yīng)用前景。