陳瓊芳,胡燦,唐海亮,張宗利,周利琴

三烏膠丸是彝族名方三烏湯劑型改良而成,具有祛寒除濕、祛風(fēng)通絡(luò)、活血止痛、強(qiáng)筋健骨等功效[1],主要用于風(fēng)寒濕邪、風(fēng)痰、淤血引起的風(fēng)濕麻木、骨節(jié)腫痛、腰腿疼痛、四肢癱瘓、陳傷勞損、中風(fēng)偏癱、口眼歪斜、失語(yǔ)及風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕性肌炎、骨質(zhì)增生、坐骨神經(jīng)痛、肩周炎、創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎等疾病[2-3]。為論證三烏膠丸的臨床毒性,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察三烏膠丸對(duì)美國(guó)癌癥研究所(ICR)小鼠和SD大鼠的急性毒性反應(yīng),以期為三烏膠丸提供安全性評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 實(shí)驗(yàn)起始時(shí)間2020年3—4月。選取ICR小鼠40只,SPF級(jí),雌雄各半,體質(zhì)量18.2～21.0 g,小鼠由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司供應(yīng),實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(湘)2019-0004,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(湘)2015-0016,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：1107272011001256。根據(jù)中心標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(SOP)規(guī)定區(qū)段隨機(jī)法將ICR小鼠分為ICR對(duì)照組和ICR三烏膠丸組,每組20只。另選取SD大鼠40只,SPF級(jí),雌雄各半,體質(zhì)量180.0～212.3 g,大鼠由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司供應(yīng),實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(湘)2019-0004,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(湘)2015-0016,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：1107272011001255。按照區(qū)段隨機(jī)法將SD大鼠分為SD對(duì)照組和SD三烏膠丸組,每組20只。

1.2 藥品試劑 三烏膠丸(云南金烏黑藥制藥有限公司生產(chǎn),規(guī)格：每1 g浸膏相當(dāng)于生藥3.02 g,批號(hào)：200205);對(duì)照品：純水,臨用前現(xiàn)制,TCH-RO/20C型純化機(jī)(中心編號(hào)：TZ/csy001);丙泊酚注射液(西安力邦制藥有限公司生產(chǎn),規(guī)格：20 ml/200 mg,批號(hào)：11904303)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 本實(shí)驗(yàn)采用最大給藥量法。ICR對(duì)照組小鼠給予純水40 ml/kg經(jīng)口灌胃,每天2次,每次間隔6 h。ICR三烏膠丸組小鼠給予三烏膠丸,臨床劑量為30.2 g生藥/d,按成年人平均體質(zhì)量60 kg計(jì)算約為0.503 g生藥/kg,按體表面積換算成小鼠等效劑量為3.926 g生藥/kg;根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果,按照40 ml/kg經(jīng)口灌胃三烏膠丸藥液,給藥前禁食不禁水約13 h,當(dāng)日給藥2次(2次給藥間隔6 h,2次給藥間禁食不禁水),累積劑量為132.88 g生藥/kg(44.0 g干浸膏/kg),給藥劑量約是成年人臨床給藥劑量的264倍(按公斤體質(zhì)量計(jì))/34倍(按體表面積計(jì))。

根據(jù)《藥物單次給藥毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》相關(guān)要求及結(jié)合前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果,按體表面積換算成大鼠等效劑量為2.718 g生藥/kg,采用最大給藥量法進(jìn)行試驗(yàn),SD對(duì)照組、SD三烏膠丸組分別按20 ml/kg經(jīng)口灌胃給予純水、三烏膠丸藥液,給藥前禁食不禁水約13 h,當(dāng)日給藥2次(2次給藥間隔6 h,2次給藥間禁食不禁水),累積劑量為66.44 g生藥/kg,給藥劑量約是成年人臨床給藥劑量的132倍(按公斤體質(zhì)量計(jì)算)/24倍(按體表面積計(jì)算)。

各組均連續(xù)觀察14 d。

1.4 觀察指標(biāo)與方法 (1)一般情況：觀察小鼠及大鼠一般活動(dòng)情況,包括外觀、行為、飲食情況、排泄物等,并觀察其中毒及死亡情況。(2)大體解剖檢查結(jié)果：觀察期結(jié)束時(shí),予丙泊酚乳狀注射液(20 mg/kg)2.0 ml/kg尾靜脈注射,處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物后進(jìn)行大體解剖,觀察其心臟、腦、肝臟、脾臟、腎臟的表面及切面,對(duì)異常器官進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。(3)體質(zhì)量：于給藥前及給藥后第4、7、10、14天,使用ME2002E型電子天平(中心編號(hào)：555)稱(chēng)量實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的體質(zhì)量。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況 各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均未出現(xiàn)死亡,未見(jiàn)明顯的活動(dòng)異常及中毒癥狀。

2.2 大體解剖病理結(jié)果 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物各器官表面和切面均未見(jiàn)明顯異常。

2.3 體質(zhì)量比較 給藥前及給藥后第4、7、10、14天,2組小鼠體質(zhì)量比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)表1～3;給藥前及給藥后第4、7、10、14天,2組大鼠體質(zhì)量比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)表4～6。

表1 ICR對(duì)照組與ICR三烏膠丸組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)體質(zhì)量比較

表2 ICR對(duì)照組與ICR三烏膠丸組雌性小鼠不同時(shí)間點(diǎn)體質(zhì)量比較

表3 ICR對(duì)照組與ICR三烏膠丸組雄性小鼠不同時(shí)間點(diǎn)體質(zhì)量比較

表4 SD對(duì)照組與SD三烏膠丸組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)體質(zhì)量比較

表5 SD對(duì)照組與SD三烏膠丸組雌性大鼠體質(zhì)量比較

表6 SD對(duì)照組與SD三烏膠丸組雄性大鼠體質(zhì)量比較

3 討 論

三烏膠丸是在彝族經(jīng)典名方三烏湯的基礎(chǔ)上,經(jīng)多次劑型改造升級(jí)而來(lái)[4],該藥由生川烏、生草烏、何首烏、附子(附片)、生白附子、乳香、冰糖、鮮豬蹄組成[5],其中生川烏為毛茛科植物卡氏烏頭的母根,有小瘤狀凸起的側(cè)根及除去子根后的痕跡,主要含烏頭堿、中烏頭堿、塔技烏頭胺、杰斯烏頭胺、苯甲酰烏頭胺、苯甲酰中烏頭胺等化學(xué)成分,具有祛風(fēng)濕、溫經(jīng)、止痛的功效,多用于治療風(fēng)寒濕痹、關(guān)節(jié)疼痛、心腹冷痛、寒疝疼痛,跌打損傷及麻醉止痛等[6];生草烏為毛茛科多年生草本植物烏頭或北烏頭的塊根,具有不定根殘基形成環(huán)多角,主要成分有烏頭堿、次烏頭堿、根烏頭定堿、烏頭芬堿等,具有祛風(fēng)除濕、溫經(jīng)止痛的功效,可用于治療風(fēng)寒濕痹、關(guān)節(jié)疼痛、心腹冷痛、寒疝作痛及麻醉止痛[7]。何首烏是為蓼科植物何首烏的塊根烏的干燥塊根,含蒽醌類(lèi)化合物,主要成分為大黃酚和大黃素,還含有卵磷脂、粗脂肪等,具有補(bǔ)益精血(制用)、解毒、截瘧、潤(rùn)腸通便(生用)的功效,主治精血虧虛、頭暈眼花、須發(fā)早白、腰膝酸軟、久瘧、癰疽、瘰疬、腸燥便秘[8]。附子為毛茛科植物烏頭子根的加工品,主要含有烏頭堿、次甲基烏頭堿等生物堿,還含有脂類(lèi)、有機(jī)酸及微量元素等,具有回陽(yáng)救逆、補(bǔ)火助陽(yáng)、散寒止痛的功效,常用于治療亡陽(yáng)虛脫、肢冷脈微、心陽(yáng)不足、胸痹心痛、虛寒吐瀉、脘腹冷痛、陽(yáng)痿宮冷、陰寒水腫、陽(yáng)虛外感、寒濕痹痛[9]。生白附子為天南星科植物獨(dú)角蓮的干燥塊莖,主要含β-谷甾醇、葡萄糖苷、內(nèi)消旋肌醇、黏液質(zhì)、蔗糖、皂苷等化學(xué)成分,具有祛風(fēng)化痰、定驚搐、解毒散結(jié)、止痛的功效,可用于治療中風(fēng)痰壅,口眼歪斜,語(yǔ)言謇澀,驚風(fēng)癲癇,破傷風(fēng),痰厥頭痛,偏正頭痛,瘰疬痰核,毒蛇咬傷[10]。乳香為橄欖科植物乳香樹(shù)及同屬植物樹(shù)皮滲出的樹(shù)脂,主要成分為樹(shù)脂、樹(shù)膠、揮發(fā)油等,善活血定痛、消腫生肌,可用于治療胸痹心痛、胃脘疼痛、痛經(jīng)經(jīng)閉、產(chǎn)后瘀阻、癥瘕腹痛、風(fēng)濕痹痛、筋脈拘攣、跌打損傷、癰腫瘡瘍[11]。鮮豬蹄為豬科豬屬動(dòng)物豬的蹄,具有補(bǔ)氣血、潤(rùn)肌膚、通乳汁、托瘡毒之功效,常用于治療虛勞羸瘦、產(chǎn)后乳少、面皺少華、癰疽瘡毒等?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,三烏膠丸具有顯著的抗炎鎮(zhèn)痛、活血通經(jīng)、祛瘀活絡(luò)的作用,還可增強(qiáng)機(jī)體免疫力[12-13]。

本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)采用最大給藥量法,ICR小鼠及SD大鼠以最大濃度的三烏膠丸藥液經(jīng)口灌胃14 d,來(lái)了解三烏膠丸的急性毒性情況,可為其重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)的劑量設(shè)計(jì)、毒性反應(yīng)指標(biāo)的選擇提供依據(jù)[14-15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：(1)ICR三烏膠丸組小鼠在給藥當(dāng)天,部分小鼠拉稀便,給藥后第1天恢復(fù)正常,截至觀察期結(jié)束,所有小鼠、大鼠未見(jiàn)明顯異常。(2)觀察期結(jié)束時(shí),大體解剖肉眼觀察結(jié)果顯示,ICR小鼠與SD大鼠各主要器官均未見(jiàn)明顯毒性反應(yīng)。(3)ICR三烏膠丸組小鼠按40 ml/kg經(jīng)口灌胃給予最大濃度0.55 g干浸膏/ml藥液,當(dāng)日給藥2次,累積劑量為132.88 g生藥/kg(44.0 g干浸膏/kg)[相當(dāng)于成年人臨床給藥劑量的264倍(按公斤體質(zhì)量計(jì))/34倍(按體表面積計(jì))],結(jié)果顯示,給藥前及給藥后第4、7、10、14天,ICR對(duì)照組與ICR三烏膠丸組小鼠、ICR對(duì)照組與ICR三烏膠丸組雌、雄小鼠體質(zhì)量比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,可見(jiàn)三烏膠丸對(duì)ICR小鼠體質(zhì)量無(wú)明顯影響。SD大鼠按20 ml/kg經(jīng)口灌胃給予0.55 g干浸膏/ml三烏膠丸藥液,當(dāng)日給藥2次,累積劑量為66.44 g生藥/kg(22.0 g干浸膏/kg)[相當(dāng)于成年人臨床給藥劑量的132倍(按公斤體質(zhì)量計(jì))/24倍(按體表面積計(jì))],結(jié)果顯示,給藥前及給藥后第4、7、10、14天,SD對(duì)照組與SD三烏膠丸組小鼠、SD對(duì)照組與SD三烏膠丸組雌雄小鼠體質(zhì)量比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,可見(jiàn)三烏膠丸對(duì)SD大鼠體質(zhì)量無(wú)明顯影響,且對(duì)雌、雄鼠體質(zhì)量的影響無(wú)差異。

綜上所述,三烏膠丸對(duì)ICR小鼠在相當(dāng)于成年人臨床給藥劑量的264倍(按公斤體質(zhì)量計(jì))/34倍(按體表面積計(jì))內(nèi)未見(jiàn)有明顯急性毒性反應(yīng),三烏膠丸對(duì)SD大鼠在相當(dāng)于成年人臨床給藥劑量的132倍(按公斤體質(zhì)量計(jì))/24倍(按體表面積計(jì))內(nèi)未見(jiàn)有明顯急性毒性反應(yīng)。

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