王貴佐,楊淑梅,劉 璐(陜西省人民醫(yī)院呼吸與危重癥一科,西安 710068;通訊作者,E-mail:liulu290@126.com)

肺纖維化(pulmonary fibrosis, PF)是一種慢性間質(zhì)性肺疾病,以肺泡上皮損傷、成纖維細胞活化、細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)沉積和組織結(jié)構(gòu)破壞為特征[1]。該病好發(fā)于老年人,發(fā)病機制尚未完全明確,目前缺乏有效治療藥物,預(yù)后差[2]。肺泡上皮細胞(alveolar epithelial cell, AEC)向間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)被認為在肺纖維化過程中發(fā)揮重要作用[3]。AEC包括Ⅰ型肺泡上皮細胞(alveolar epithelial type Ⅰ cell, ATⅠ)和Ⅱ型肺泡上皮細胞(ATⅡ)。其中,ATⅡ占AEC的60%,占所有肺細胞的10%～15%,覆蓋約4%的肺泡表面[4]。除了可合成、分泌表面活性物質(zhì),ATⅡ還具有參與免疫反應(yīng)以及轉(zhuǎn)分化等多種功能,在肺發(fā)育和損傷修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用[5]。近年來研究發(fā)現(xiàn),ATⅡ不僅可分化為ATⅠ[6],還可向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)變,是肺纖維化過程中肌成纖維細胞的部分來源[7]。因此,揭示ATⅡ發(fā)生EMT的機制可為尋求預(yù)防和/或治療肺纖維化提供干預(yù)新靶點。

轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor, TGF-β1)可誘導(dǎo)肌成纖維細胞轉(zhuǎn)分化、EMT以及ECM沉積,在多種器官纖維化過程發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[8-10]。研究表明TGF-β1可通過激活經(jīng)典Smad和非經(jīng)典信號通路介導(dǎo)肌成纖維細胞激活、ECM沉積,最終誘導(dǎo)肺纖維化[11]。核因子紅細胞2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf2)是TGF-β1下游非經(jīng)典信號通路關(guān)鍵分子之一,可調(diào)節(jié)包括抗氧化、解毒酶等相關(guān)基因表達[12],在維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)、氧化還原平衡反應(yīng)方面發(fā)揮重要作用[13-15]。研究發(fā)現(xiàn),Nrf2下調(diào)可誘導(dǎo)EMT以及肺纖維化[16]。脂氧素A4(lipoxin A4, LXA4)是花生四烯酸的代謝產(chǎn)物,通過與細胞膜上的LXA4受體結(jié)合發(fā)揮作用[17]。激活LXA4受體可減輕機械通氣誘導(dǎo)的EMT和肺纖維化[18];LXA4穩(wěn)定類似物BML-111可抑制TGF-β1誘導(dǎo)的肺成纖維細胞活化,減輕博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化[19]。但LXA4通過何種機制減輕肺纖維化,還需進一步研究。本研究通過評估LXA4是否可抑制ATⅡ間質(zhì)轉(zhuǎn)化,探討其機制是否與LXA4上調(diào)Nrf2表達相關(guān),為肺纖維化臨床防治策略提供理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

TGF-β1粉劑(純度≥98%)購于美國PeproTech公司,LXA4酊劑(純度≥95%)購于美國Cayman Chemical公司,DMEM高糖培養(yǎng)基粉劑購于美國Gibco公司,胎牛血清購于中國浙江天杭生物科技股份有限公司,RIPA裂解液購自于中國上海碧云天公司,化學(xué)發(fā)光液購自于美國Milipore公司,大鼠抗人E鈣黏蛋白(E-cadherin)單克隆抗體、小鼠抗人α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)單克隆抗體、兔抗人Nrf2多克隆抗體、小鼠抗人β-actin單克隆抗體均購于美國Merck公司,HRP標(biāo)記羊抗兔及小鼠二抗購于美國Sigma-Aldrich公司,LipofectamineTM2000購于美國Invitrogen公司。

1.2 細胞培養(yǎng)、分組及干預(yù)

人肺腺癌A549細胞作為腺癌中的肺泡基底上皮細胞,具有AT Ⅱ的生物學(xué)特性,已作為AT Ⅱ的體外模型廣泛應(yīng)用。人肺腺癌A549細胞購于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會上海細胞庫。將A549細胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清和100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中,在37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

將A549細胞分為對照組、TGF-β1組、空質(zhì)粒+TGF-β1組、pcDNA3.1-Nrf2+TGF-β1組、LXA4+TGF-β1組。TGF-β1組以5 ng/mL TGF-β1干預(yù)A549細胞48 h;空質(zhì)粒+TGF-β1組和pcDNA3.1-Nrf2+TGF-β1組A549細胞先分別轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒和Nrf2過表達質(zhì)粒,再以5 ng/mL TGF-β1干預(yù)48 h;LXA4+TGF-β1組A549細胞先用100 nmol/L LXA4預(yù)處理6 h再給予5 ng/mL TGF-β1干預(yù)48 h。

1.3 免疫熒光染色檢測細胞E-cadherin、α-SMA表達

A549細胞消化后接種于預(yù)先放置有載玻片的6孔板中,移液管吸除培養(yǎng)液后PBS洗3次,4%多聚甲醛溶液固定15 min,0.1% Triton X-100作用20 min,用含10%血清的封閉液封閉25 min,加入E-cadherin(1∶200)、α-SMA抗體(1∶400),濕盒內(nèi)4 ℃孵育24 h,加入熒光二抗,室溫下避光孵育1 h,封片,熒光顯微鏡觀察E-cadherin和α-SMA表達。

1.4 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒過表達Nrf2

調(diào)整A549細胞密度至1×106個/mL,取2 mL接種于6孔板,將細胞分為空質(zhì)粒組、pcDNA3.1-Nrf2組,采用LipofectamineTM2000將濃度為0.5 μg/μL的空質(zhì)?；騈rf2過表達質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染細胞48 h。

1.5 免疫印跡法檢測細胞Nrf2蛋白水平

免疫印跡法檢測E-cadherin、α-SMA、Nrf2蛋白水平,β-actin作為內(nèi)參。使用RIPA裂解液提取總蛋白,測定蛋白濃度后按體積4∶1加入上樣緩沖液,100 ℃水浴變性。SDS-PAGE分離蛋白樣,采用濕轉(zhuǎn)法將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜。使用封閉液充分封閉,與一抗(大鼠抗人E-cadherin單克隆抗體、小鼠抗人α-SMA單克隆抗體、兔抗人Nrf2多克隆抗體,稀釋度均為1∶1 000;小鼠抗人β-actin單克隆抗體,稀釋度1∶5 000)孵育,4 ℃過夜,洗膜后與HRP標(biāo)記羊抗兔及小鼠二抗(稀釋度1∶10 000)室溫孵育2 h,再次洗膜后進行化學(xué)發(fā)光。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 TGF-β1誘導(dǎo)AT Ⅱ發(fā)生EMT

倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài),與對照組相比,TGF-β1組部分細胞失去原有的“鵝卵石”樣形態(tài),呈現(xiàn)出更加拉伸或伸長的紡錘形,這也是上皮細胞發(fā)生EMT的典型改變(見圖1A)。與對照組相比,TGF-β1組細胞間充質(zhì)標(biāo)志物(α-SMA)蛋白表達水平較對照組升高(P<0.01),而上皮標(biāo)志物(E-cadherin)的表達較對照組降低(P<0.05,見圖1B)。免疫熒光結(jié)果與免疫印跡結(jié)果一致,即TGF-β1組A549細胞α-SMA水平上調(diào)、E-cadherin水平下調(diào)(見圖1C)。

注:紅箭頭所指綠色熒光信號為α-SMA,黃箭頭所指綠色熒光信號為E-cadherin,白箭頭所指藍色熒光信號為細胞核。C.免疫熒光染色檢測細胞α-SMA和E-cadherin表達圖1 TGF-β1誘導(dǎo)A549細胞發(fā)生EMTFigure 1 TGF-β1 exposure induces EMT in A549 cells

2.2 Nrf2介導(dǎo)TGF-β1誘導(dǎo)的AT Ⅱ發(fā)生EMT

與對照組相比,TGF-β1組A549細胞Nrf2蛋白水平下調(diào)(P<0.05,見圖2A),pcDNA3.1-Nrf2組細胞Nrf2蛋白水平增加(P<0.05,見圖2B)。與TGF-β1組相比,pcDNA3.1-Nrf2+TGF-β1組A549細胞α-SMA蛋白水平降低(P<0.01),E-cadherin蛋白水平升高(P<0.05,見圖2C)。免疫熒光結(jié)果與免疫印跡結(jié)果一致(見圖2D)。

注:紅箭頭所指綠色熒光信號為α-SMA,黃箭頭所指綠色熒光信號為E-Cadherin,白箭頭所指藍色熒光信號為細胞核。D.免疫熒光染色檢測細胞α-SMA和E-cadherin表達圖2 Nrf2介導(dǎo)TGF-β1誘導(dǎo)A549細胞發(fā)生EMT作用 (n=3)Figure 2 Nrf2 mediates TGF-β1-induced EMT in A549 cells (n=3)

2.3 LXA4通過激活Nrf2抑制TGF-β1誘導(dǎo)的AT Ⅱ發(fā)生EMT

與對照組相比,TGF-β1組A549細胞α-SMA蛋白水平升高(P<0.01),E-cadherin及Nrf2蛋白水平降低(P<0.05);與TGF-β1組相比,LXA4+TGF-β1組A549細胞α-SMA蛋白水平降低,E-cadherin及Nrf2蛋白水平升高(P<0.05,見圖3A)。免疫熒光結(jié)果與免疫印跡結(jié)果一致(見圖3B)。

注:紅箭頭所指綠色熒光信號為α-SMA,黃箭頭所指綠色熒光信號為E-cadherin,白箭頭所指藍色熒光信號為細胞核。B.免疫熒光染色檢測細胞α-SMA和E-cadherin表達圖3 LXA4通過上調(diào)Nrf2抑制TGF-β1誘導(dǎo)的A549細胞發(fā)生EMTFigure 3 LXA4 inhibits TGF-β1-induced EMT in A549 cells by upregulation of Nrf2

3 討論

肺纖維化以ECM的過度產(chǎn)生和聚集,以及肺組織結(jié)構(gòu)的異常重構(gòu)為特征[20]。目前尚無有效措施治愈或逆轉(zhuǎn)肺纖維化的進展,免疫抑制劑(如環(huán)磷酰胺)和皮質(zhì)類固醇(如地塞米松)已被用于治療特發(fā)性肺纖維化急性加重,旨在減輕癥狀和炎癥反應(yīng),但因療效有限以及不容忽視的不良反應(yīng)限制了它們的臨床應(yīng)用[21,22]。抗纖維化藥物尼達尼布和吡非尼酮雖可延緩肺纖維化進展[23,24],但卻不能治愈肺纖維化。目前,肺移植是終末期肺纖維化患者最終選擇的治療手段,但存在手術(shù)費用高、肺供體稀缺和遠期生存率差等客觀問題。因此,本研究以在肺纖維化中發(fā)揮重要作用的AT Ⅱ為研究對象,探討EMT的潛在機制,旨在為肺纖維化臨床干預(yù)提供靶點。

ACE失去頂端-基底極性和細胞間黏附性(兩者為上皮細胞的特征),并獲得間充質(zhì)細胞的分子及生理特性,具備膠原蛋白合成及收縮能力,即EMT參與肺纖維化的發(fā)生發(fā)展過程[25]。肺纖維化患者和動物模型中均可檢測到ACE向間質(zhì)轉(zhuǎn)化;在肺纖維化中約有1/3的成纖維細胞是經(jīng)EMT形成[26],因此探討ACE發(fā)生間質(zhì)轉(zhuǎn)化的潛在機制、尋求干預(yù)靶點,具有重要臨床意義。目前研究認為,Nrf2在包括肺纖維化在內(nèi)的多種以氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)為潛在病理機制的器官系統(tǒng)疾病中發(fā)揮保護作用[27-29]。激活Nrf2可分別抑制肝細胞及腎小管上皮細胞發(fā)生間質(zhì)轉(zhuǎn)化,減輕小鼠肝纖維化、腎間質(zhì)纖維化嚴(yán)重程度[30-32],但上調(diào)/激活Nrf2是否也可抑制ACE發(fā)生間質(zhì)轉(zhuǎn)化,進而延緩/減輕肺纖維化嚴(yán)重程度,尚無相關(guān)報道。本研究結(jié)果顯示,TGF-β1可通過抑制Nrf2誘導(dǎo)A549細胞發(fā)生間質(zhì)轉(zhuǎn)化,而預(yù)先過表達Nrf2可抑制TGF-β1誘導(dǎo)EMT的作用,提示Nrf2在肺纖維化EMT中發(fā)揮重要作用。這與Zhang等[16]研究結(jié)果一致,即TGF-β1可通過下調(diào)Nrf2誘導(dǎo)大鼠AT Ⅱ和A549細胞發(fā)生間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

LXA4在炎癥后的組織修復(fù)調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用,特別是在肺、腎臟和皮膚纖維化中[33-35]。LXA4穩(wěn)定類似物BML-111可抑制乳腺癌細胞[36]、子宮內(nèi)膜上皮細胞[37]以及肝癌細胞[38]發(fā)生EMT。在大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細胞[39]、視網(wǎng)膜色素上皮細胞[40]、心肌細胞[41]等多種非ACE中,LXA4可激活Nrf2信號通路。此外,LXA4還可降低肺纖維化模型肺組織中TGF-β水平,并表現(xiàn)出抗纖維化作用[33]。但LXA4的抗肺纖維化作用是否與其抑制ACE向間質(zhì)轉(zhuǎn)化,及其潛在機制尚未明確。本研究在此基礎(chǔ)上深入探索,結(jié)果顯示,在A549細胞中,LXA4可抑制TGF-β1誘導(dǎo)的Nrf2下調(diào)及EMT作用。

綜上所述,LXA4通過上調(diào)Nrf2表達,抑制AT Ⅱ發(fā)生EMT,為肺纖維化臨床治療提供新的思路。但本研究僅進行體外實驗,不能完全反映體內(nèi)的真實情況,還須體內(nèi)實驗進一步證實。另外,除了上調(diào)Nrf2外,可能還有其他機制介導(dǎo)LXA4抑制AT Ⅱ間質(zhì)轉(zhuǎn)化、改善肺纖維化的作用。這有待我們在下一步研究中,驗證LXA4穩(wěn)定類似物在肺纖維化動物模型中的作用及分子機制;并進一步探索是否存在其他潛在作用機制及其之間的相互關(guān)系。