劉雨溪,王 璐,龍凱花,劉 洋,靳景瑞,張 紅,(陜西省中醫(yī)藥研究院中藥研究所,西安 7000;陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院;中國(guó)醫(yī)科大學(xué)臨床二系;通訊作者,E-mail:zhanghong9999@6.com)

慢性萎縮性胃炎(chronic atrophic gastritis,CAG)是一種消化系統(tǒng)常見疾病,其特征是胃黏膜因潰瘍、糜爛和慢性炎癥而失去正常的腺上皮,導(dǎo)致黏膜損傷和功能障礙[1]。在臨床上,CAG患者常表現(xiàn)為上腹部隱痛、脹滿、噯氣和食欲不振等消化系統(tǒng)癥狀。此外,一些患者還會(huì)出現(xiàn)胃食管反流和膽汁反流等問題,這些問題對(duì)生活質(zhì)量產(chǎn)生了嚴(yán)重的影響[2]。1975年,Correa[3]提出了一個(gè)漸進(jìn)演變模式:正常胃黏膜—淺表性胃炎—萎縮性胃炎—腸上皮化生—異型增生—胃癌。而后1978年世界衛(wèi)生組織將CAG列入癌前狀態(tài),受到了醫(yī)學(xué)界的普遍重視[4]。胃癌是一種常見的惡性腫瘤,胃癌位居2022年中國(guó)癌癥發(fā)病率和死亡率的前三位,并且發(fā)病率均位居世界前列,造成沉重的疾病負(fù)擔(dān)[5]。目前胃癌尚無滿意的治療方法且發(fā)病機(jī)制不完全清楚,但眾所周知,CAG是胃癌發(fā)生發(fā)展的主要因素之一[6]。因此,成功治療CAG可能有助于預(yù)防胃癌的發(fā)生。若能逆轉(zhuǎn)CAG,則可成為防治胃癌前病變(precancerous lesions,PLGC)及降低胃癌發(fā)生率的重要措施。為了實(shí)現(xiàn)對(duì)CAG及胃癌的逆轉(zhuǎn)和預(yù)防,需要建立動(dòng)物模型并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究以深入探究其發(fā)病機(jī)制和治療方法。目前對(duì)CAG或PLGC動(dòng)物模型的建立包括單化學(xué)因素或多化學(xué)因素造模法、物理刺激法、免疫造模法、幽門螺桿菌感染法、手術(shù)造模法以及中醫(yī)證候模型復(fù)制法[7]。無論采用何種方法,結(jié)果都與理想的動(dòng)物模型存在一定程度的差異。由于對(duì)于藥物作用時(shí)間、劑量、成模穩(wěn)定性等方面在建模期間缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。因此找到穩(wěn)定、可靠的動(dòng)物模型復(fù)制方法成為臨床研究的重要基礎(chǔ)。N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)是最公認(rèn)的CAG造模試劑之一,具有致癌性;脫氧膽酸鈉可中和胃酸,造成胃黏膜病變且模擬膽汁反流對(duì)胃黏膜的侵害;水楊酸鈉屬于非甾體抗炎藥,可釋放大量促炎因子從而加速黏膜炎癥;飲食不規(guī)律會(huì)造成胃酸分泌紊亂,從而對(duì)胃黏膜產(chǎn)生刺激,進(jìn)而引發(fā)胃炎[8-10]。人體是復(fù)雜機(jī)體,病變發(fā)作往往非單一因素所致,故常采取多化學(xué)因素聯(lián)合的方式進(jìn)行造模,多因素模型相對(duì)穩(wěn)定可靠,可縮短造模時(shí)間,提高成模率[11]。目前雖然已有多因素造模法,但其造模效率和可復(fù)制性仍需提高[12,13]。本研究采用MNNG聯(lián)合脫氧膽酸鈉、水楊酸鈉和不定期禁食的4種因素綜合造模方法構(gòu)建CAG及PLGC動(dòng)物模型,以期為后續(xù)CAG及PLGC藥物開發(fā)提供符合臨床特點(diǎn)的動(dòng)物模型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 60只2月齡雄性SPF級(jí)SD大鼠購(gòu)自西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[生產(chǎn)許可證:SCXK(陜)2020-005],所有實(shí)驗(yàn)在陜西省中醫(yī)藥研究院倫理委員會(huì)許可下進(jìn)行[(2023)動(dòng)物倫審第(10)號(hào)]。實(shí)驗(yàn)按照3R原則進(jìn)行。

1.1.2 試劑 MNNG、水楊酸鈉及脫氧膽酸鈉均購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將大鼠按照體質(zhì)量隨機(jī)分為對(duì)照組(n=10)和模型組(n=50)。對(duì)照組正常喂養(yǎng),模型組采用MNNG(200 μg/mL)自由飲用+2%(m/V)水楊酸鈉隔日灌胃+脫氧膽酸鈉(20 mmol/L)隔日灌胃復(fù)合造模法,每周間隔禁食3 d,造模6個(gè)月。

1.2.2 檢測(cè)指標(biāo)與方法 每日觀察大鼠狀態(tài),包括毛發(fā)、糞便及活動(dòng),并監(jiān)測(cè)大鼠體質(zhì)量。于造模第3,4,5個(gè)月分別通過過量CO2吸入法處死送病理學(xué)診斷大鼠各3只,第6個(gè)月處死10只,處死大鼠后取胃組織進(jìn)行HE染色,觀察病理變化。于造模結(jié)束后采用混合純氧進(jìn)行麻醉,通過氧氣氣流使異氟烷揮發(fā),異氟烷濃度2%～3%,麻醉5 min。通過眼眶取血采對(duì)照組和模型組大鼠血液,采用ELISA法檢測(cè)每只大鼠血清中胃蛋白酶原Ⅰ(PG Ⅰ)、胃蛋白酶原Ⅱ(PG Ⅱ)及胃泌素17(G-17)含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Graphpad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。兩組動(dòng)物生存曲線采用Kaplan-Meier法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。兩組PG Ⅰ、PG Ⅰ與PG Ⅱ比值(PG R)、G-17數(shù)據(jù)經(jīng)檢驗(yàn)符合正態(tài)分布且方差齊,使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠臨床體征

對(duì)照組大鼠體形肥胖,毛色光亮,反應(yīng)靈敏,飲食、飲水量正常,大便成形,視力正常。模型組大鼠自第3個(gè)月開始體形均明顯較對(duì)照組瘦小,皮毛發(fā)黃,喜蜷臥扎堆,反應(yīng)遲鈍,部分大鼠大便質(zhì)稀、視力不佳。

2.2 各組大鼠死亡情況

模型組大鼠于第3個(gè)月開始出現(xiàn)死亡,至第6個(gè)月模型成功。除第3,4,5個(gè)月分別常規(guī)處死送病理學(xué)診斷大鼠各3只,及第6個(gè)月處死10只外,異常死亡6只,死亡率12%,異常死亡大鼠經(jīng)解剖發(fā)現(xiàn)5只出現(xiàn)嚴(yán)重胃腸脹氣,1只為灌胃嗆咳窒息。對(duì)照組大鼠無死亡。造模過程中,大鼠生存曲線見圖1。

圖1 對(duì)照組和模型組造模過程中大鼠生存曲線Figure 1 Survival rate of control and model rats during the modeling

2.3 各組大鼠體質(zhì)量比較

與對(duì)照組相比,模型組大鼠于第1個(gè)月開始明顯降低(P<0.05);第2～6個(gè)月模型組大鼠體質(zhì)量較穩(wěn)定,有輕微下降趨勢(shì),對(duì)照組大鼠體質(zhì)量隨時(shí)間穩(wěn)步增長(zhǎng)(見圖2)。

注:與同時(shí)點(diǎn)對(duì)照組比較,**P<0.05。圖2 對(duì)照組和模型組造模過程中大鼠體質(zhì)量變化Figure 2 Changes of body weight during the modeling in control group and model group

2.4 各組大鼠胃黏膜病理組織學(xué)比較

HE染色結(jié)果顯示:對(duì)照組大鼠胃組織黏膜無異常,胃腺細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常,未見炎癥(見圖3A);大鼠造模3個(gè)月,胃組織黏膜層可見少量上皮細(xì)胞與較多胃腺細(xì)胞脫落,固有層可見多處輕度出血,局部可見少量胃腺細(xì)胞壞死,黏膜下層可見水腫,結(jié)締組織排列疏松(見圖3B);大鼠造模4個(gè)月,大量胃腺細(xì)胞壞死脫落,核固縮深染或碎裂,黏膜腺體減少,有明顯間質(zhì)纖維增生(見圖3C);大鼠造模5個(gè)月,胃黏膜層變薄,黏膜腺體減少,間質(zhì)纖維增生并伴隨少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)(見圖3D);大鼠造模6個(gè)月,可見慢性萎縮性胃炎的典型病理特征,胃組織可見大量胃腺擴(kuò)張,小面積潰瘍,多量黏膜上皮細(xì)胞壞死脫落,固有層胃腺壞死,結(jié)構(gòu)消失,結(jié)締組織增生,伴少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),多量胃腺腔內(nèi)可見少量粒細(xì)胞,大面積黏膜層與肌層分離(見圖3E)。造模6個(gè)月,部分大鼠胃部形成隆起型腫瘤,呈不規(guī)則狀,血管豐富;組織可見廣泛性全層壞死,黏膜上皮及大量胃腺結(jié)構(gòu)消失,伴有較多的粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及巨噬細(xì)胞浸潤(rùn),結(jié)締組織增生修復(fù),腔內(nèi)多見壞死細(xì)胞碎片,腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)至固有層,此為胃癌的病理特征(見圖3F)。

注:A.對(duì)照組;B.模型組3個(gè)月;C.模型組4個(gè)月;D.模型組5個(gè)月;E.模型組6個(gè)月出現(xiàn)胃黏膜萎縮;F.模型組6個(gè)月出現(xiàn)胃癌。圖3 大鼠胃黏膜病理變化Figure 3 Pathological changes of gastric mucosa in rats

造模結(jié)束后,對(duì)照組大鼠胃組織無病變,模型組10只大鼠全部出現(xiàn)胃黏膜萎縮,4只出現(xiàn)不同程度的異型,2只出現(xiàn)腸上皮化生,1只出現(xiàn)胃癌(見表1,2)。

表1 各組大鼠造模6個(gè)月后胃黏膜病理改變 例(%)Table 1 Pathological changes of gastric mucosa in rats in each group after 6-month modeling cases(%)

表2 各組大鼠造模6個(gè)月后胃黏膜病變程度比較 例(%)Table 2 Comparison of the degree of gastric mucosal lesion of rats between two groups after 6-month modeling cases(%)

2.5 各組大鼠血清PG Ⅰ、PG R、G-17比較

造模結(jié)束后采集大鼠血清,檢測(cè)結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,模型組PG Ⅰ升高,PG R降低,G-17降低(均P<0.05,見圖4)。PG Ⅰ偏高代表胃酸分泌增加,PG R降低與腺體萎縮、上皮化生及異型增生相關(guān),G-17偏低提示可能出現(xiàn)胃黏膜萎縮、胃潰瘍或胃癌等器質(zhì)性胃部疾病。以上結(jié)果均能證明模型組大鼠已出現(xiàn)CAG相關(guān)癥狀。

注:與對(duì)照組比較,**P<0.05。圖4 對(duì)照組和模型組大鼠血清PG Ⅰ、PG R、G-17比較Figure 4 Comparison of PG Ⅰ, PG R, and G-17 in rat serum between control group and model group

3 討論

本研究采用復(fù)合造模法成功構(gòu)建了大鼠CAG癌前病變模型。隨著對(duì)CAG的發(fā)病機(jī)制及治療藥物研究的深入,出現(xiàn)多種多樣的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)造模方法。目前,常用造模方法包括化學(xué)造模法、物理刺激法、免疫造模法、幽門螺桿菌感染法、手術(shù)造模法以及中醫(yī)證候模型復(fù)制法等。其中化學(xué)造模法雖然實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)、操作次數(shù)多,但成模率相對(duì)較高、穩(wěn)定性好、操作也較為簡(jiǎn)單。但運(yùn)用化學(xué)法造模時(shí),若只使用單因素,成功率低,因此,復(fù)合造模法應(yīng)用更為廣泛。

在復(fù)合造模法中,MNNG起主要作用,MNNG作為一種化學(xué)誘癌劑,主要模擬不當(dāng)攝入硝酸鹽后在胃內(nèi)轉(zhuǎn)化為亞硝酸胺等致癌物質(zhì),從而導(dǎo)致CAG、PLGC甚至胃癌的發(fā)生。CAG造模的研究中,MNNG自由飲用或定量灌胃法均有使用。有研究觀察了不同給藥劑量及給藥途徑的MNNG對(duì)大鼠胃黏膜組織病理學(xué)的影響,發(fā)現(xiàn)MNNG自由飲用聯(lián)合灌胃、雷尼替丁飼料、饑飽失常、燙熱高鹽飲食能成功誘導(dǎo)大鼠PLGC模型;但大劑量MNNG灌胃使PLGC誘變率降低,死亡率上升,并出現(xiàn)明顯前胃鱗狀上皮病變[12]。因此本研究在既往研究的基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化,采用MNNG自由飲用法,聯(lián)合其他因素進(jìn)行造模,從而提高造模的成功率和穩(wěn)定性,并降低死亡率。

MNNG不依賴于酶的代謝作用,而是直接作用于胃黏膜上皮,使原有DNA鏈上的堿基發(fā)生突變,誘導(dǎo)胃炎、癌前病變或胃癌的發(fā)生。大鼠的胃、肝、腎都有將MNNG轉(zhuǎn)化為MNG從而導(dǎo)致MNNG失活的能力,但胃的轉(zhuǎn)化能力最差,并且MNNG更易滲透胃幽門部和胃底部黏膜,所以通常選用MNNG誘導(dǎo)CAG或PLGC[13]。但人類CAG和PLGC通常是多因素共同作用的結(jié)果,目前也普遍認(rèn)為聯(lián)合應(yīng)用一些刺激因素造成胃黏膜非特異性損傷可提高CAG及PLGC的誘發(fā)率。飲食不規(guī)律會(huì)造成胃酸分泌紊亂,從而對(duì)胃黏膜產(chǎn)生刺激,進(jìn)而引發(fā)胃炎;脫氧膽酸鈉可誘導(dǎo)膽汁酸代謝紊亂和胃部菌群失調(diào),造成胃黏膜病變且模擬膽汁反流對(duì)胃黏膜的侵害;水楊酸鈉對(duì)胃黏膜的損傷表現(xiàn)在對(duì)局部的直接刺激作用引起胃黏膜炎性反應(yīng),胃黏膜細(xì)胞剝脫,并抑制胃黏膜的生長(zhǎng)。本研究使用的MNNG+水楊酸鈉+脫氧膽酸鈉配合不定期禁食的復(fù)合造模法,相比其他以MNNG為主的造模方法[12,13],動(dòng)物死亡率更低,穩(wěn)定性更高,能夠成功且穩(wěn)定地構(gòu)建CAG及PLGC模型,但由于動(dòng)物個(gè)體差異,造模進(jìn)程難以完全統(tǒng)一,檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)以PG Ⅰ、PG R、G-17及病理切片結(jié)果為主,所以CAG和PLGC模型之間的差異難以明確鑒別。造模6個(gè)月發(fā)現(xiàn)有個(gè)別大鼠已出現(xiàn)癌變,這也提示該造模方法能夠造成胃癌模型,但造模成功率及穩(wěn)定性有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

CAG是臨床常見慢性病,然而目前針對(duì)CAG的治療方法都不盡如人意,新型有效的治療方案亟待開發(fā)。構(gòu)建成熟可復(fù)制的CAG動(dòng)物模型,并從細(xì)胞和分子層面了解CAG病變的發(fā)病機(jī)制及演變過程,為研發(fā)防治CAG藥物提供基礎(chǔ)。本研究提供了一種行之有效的CAG大鼠造模方法,未來將在此方法的基礎(chǔ)上繼續(xù)完善,希望找到更加高效的造模方法,并能找到CAG與PLGC模型間的差別,為制定成功率高且簡(jiǎn)單易行的造模方法提供參考,為后續(xù)CAG及PLGC藥物開發(fā)提供符合臨床特點(diǎn)的動(dòng)物模型。