韓紅霞,張晉欣(山西省心血管病醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科神經(jīng)重癥病區(qū),太原 030024;通訊作者,E-mail:zhangjinxin558@126.com)

多發(fā)性硬化癥(multiple sclerosis, MS)是一種器官特異性的慢性炎癥性疾病,其特征是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system, CNS)的脫髓鞘和軸突破壞[1]。MS的發(fā)病機制復(fù)雜,主要包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞穿透血腦屏障浸潤中樞,導(dǎo)致膠質(zhì)細(xì)胞的激活,最終引發(fā)髓鞘損傷和CNS白質(zhì)丟失[2]。由于MS的病因尚未完全明確,因此人們?nèi)栽谔剿鱉S疾病進(jìn)展的有效治療方法[3]。實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE),由神經(jīng)抗原特異性T細(xì)胞誘導(dǎo)[4],已被公認(rèn)為是研究治療MS的潛在藥物療效及探討MS分子機制廣泛使用的動物模型[5]。

L-3-正丁基酞(L-3-n-butylphthalide, NBP)最初提取于芹菜籽,是治療急性缺血性中風(fēng)的有效藥物[6]。越來越多的證據(jù)表明,NBP可以重建血流,減輕血腦屏障損傷[7],減輕腦出血模型大鼠的炎癥反應(yīng)和腦水腫[8],減少梗死病變,預(yù)防神經(jīng)損傷,但其在MS中的潛在治療機制尚未完全闡明。

小G蛋白RhoA屬于Ras同源基因家族,其下游效應(yīng)蛋白是Rho依賴性激酶(Rho-dependent kinase, ROCK),在星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元中普遍表達(dá),并通過與其下游受體結(jié)合來調(diào)控肌凝、肌動蛋白等參與調(diào)控細(xì)胞骨架的形成,對膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞的發(fā)育成熟、髓鞘形成、突觸的可塑性等發(fā)揮至關(guān)重要的作用[9,10]。研究發(fā)現(xiàn),抑制RhoA/ROCK信號通路可以調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞的極化,從而減弱脈絡(luò)膜新生血管[11]。此外,研究表明抑制RhoA/ROCK信號通路可有效減輕缺血性卒中誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥[12],提示RhoA/ROCK信號通路與神經(jīng)炎癥有密切的相關(guān)性。而RhoA/ROCK信號通路在EAE中作用機制尚未有研究報道。因此,本研究從抑制免疫炎癥的角度觀察NBP對EAE模型小鼠的影響,探討其作用機制是否與RhoA/ROCK信號通路介導(dǎo)有關(guān)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級C57BL/6雌性小鼠32只,10周齡,體質(zhì)量(20±2)g,購自北京維通利華實驗動物科技有限公司,實驗動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(京)2021-0006。飼養(yǎng)在山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心的屏障環(huán)境中(實驗動物使用許可證號:SYXK(晉)2019-0007),SPF條件下飼養(yǎng),12 h光照/12 h黑暗循環(huán),標(biāo)準(zhǔn)喂食自由食物和水。實驗操作符合山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物福利倫理(SYDL2023061)。

1.2 試劑及儀器

NBP(批號:6606-49-5)購自石藥集團(tuán)恩必普藥業(yè)有限公司,髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白肽片段35-55(MOG35-55)(批號:149635-73-4)、弗氏完全佐劑(complete Freund′s adjuvant,CFA)(批號:S6322)、Total RNA Extraction Kit(批號:RTN350)、real time-PCR試劑盒(批號:QR0200)均購自美國Sigma公司,IL-10(批號:RX-G203075M)、IL-1β(批號:RX-G203063M)、IL-6(批號:RX-G203049M)和IL-18(批號:RX203064M)酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒均購自睿信生物科技有限公司,TNF-α、TNFR1、IL-1β及內(nèi)參β-actin引物由華大基因科技有限公司合成,RhoA(批號:ab54835)、ROCKⅠ(批號:ab134181)、ROCKⅡ(批號:ab125025)和β-actin抗體(批號:ab8226)均購自美國abcam公司。

組織切片掃描系統(tǒng)(型號:Scanscope-cs)購自美國Aperio公司,熒光定量PCR儀(型號:Step one plus)購自美國ABI公司,垂直電泳系統(tǒng)(型號:Mana-TROTEAN)購自美國Bio公司等。

1.3 方法

1.3.1 EAE模型構(gòu)建及分組 32只C57BL/6雌性小鼠隨機分為:對照組(control組)、EAE組、NBP低劑量組(L-NBP)和NBP高劑量組(H-NBP),每組8只。EAE造模方法參考之前的研究[13],使用生理鹽水將MOG35-55多肽稀釋至5 g/L,然后加入等體積的CFA,混勻后加入一定體積的再滅活結(jié)核分枝桿菌,輕輕吹打混勻,形成4 g/L的結(jié)核桿菌H37Ra油包水乳劑。在小鼠脊柱兩側(cè)選取4點皮下注射0.1 mL MOG35-55水乳劑。除對照組以外,其余各組小鼠均皮下注射MOG35-55多肽油包水乳劑進(jìn)行造模,對照組皮下注射等體積的生理鹽水。

1.3.2 NBP體內(nèi)給藥 根據(jù)中國患者的NBP臨床劑量(25～50 mg/d),結(jié)合體表面積轉(zhuǎn)換法(小鼠換算系數(shù)0.002 6),按小鼠劑量=人劑量[mg/(kg·d)]×70 kg×0.002 6/0.02 kg,計算得小鼠的NBP使用劑量為3.25～6.5 mg/(kg·d)。以該劑量作為理論參考,本研究選擇NBP低劑量3.25 mg/(kg·d),高劑量6.5 mg/(kg·d)。對照組和EAE組給予等體積生理鹽水,均采用腹腔注射給藥,連續(xù)28 d。

1.3.3 EAE病情評分 從免疫當(dāng)日開始,每7 d對各組小鼠進(jìn)行稱重,并采用Weaver評分法進(jìn)行評分[14],由1名對治療組不知情的觀察者進(jìn)行神經(jīng)功能觀察評估。評分標(biāo)準(zhǔn):總分為0～5分。尾巴的得分為0～2分,四肢的得分為0～3分。尾部的評分定義為:0分,正常;1分,部分癱瘓;2分,完全癱瘓。四肢分別評估如下:0分,正常;1分,步態(tài)改變或虛弱;2分,癱瘓;3分,完全癱瘓的肢體。

1.3.4 取材及標(biāo)本處理 各組小鼠體內(nèi)給藥后28 d取材。①取血清:眼眶靜脈叢取血于1.5 mL離心管中,室溫靜置30 min,1 200 r/min離心10 min,收集血清。②脊髓組織病理取材:0.6%戊巴比妥鈉麻醉小鼠后,使用生理鹽水進(jìn)行心臟灌注,再使用4%多聚甲醛進(jìn)行固定,斷頭取脊髓組織,置于多聚甲醛中固定24 h,石蠟包埋后進(jìn)行切片,分別進(jìn)行蘇木精和伊紅(HE),勞克堅牢藍(lán)(Luxol fast blue, LFB)染色。

1.3.5 HE染色及病理評分 對脊髓組織進(jìn)行HE染色,以評估炎癥浸潤情況。HE染色后,采用組織切片掃描系統(tǒng)進(jìn)行觀察。組織病理學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)如下[5]:0分,正常;1分,輕度炎癥,少量炎癥細(xì)胞浸潤;2分,中度炎癥,組織血管周圍出現(xiàn)炎癥浸潤;3分,嚴(yán)重炎癥,血管周圍出現(xiàn)炎癥細(xì)胞袖帶樣浸潤;4分,大量炎癥,血管周圍炎癥細(xì)胞袖帶樣延伸至鄰近組織。

1.3.6 LFB染色及病理評分 取各組小鼠脊髓,石蠟包埋脊髓組織,切片、二甲苯梯度水合,蒸餾水清洗,浸入0.1% LFB溶液,60 ℃密封浸染8～16 h;蒸餾水清洗,加入95%酒精,0.05%碳酸鋰水溶液分色10 s以上,在70%酒精中繼續(xù)分色直到能看清灰、白色能分清晰為止。組織切片掃描系統(tǒng)觀察組織病理變化并進(jìn)行評分。LFB評分標(biāo)準(zhǔn)[15]:0分,無脫髓鞘;1分,罕見脫髓鞘;2分,少數(shù)脫髓鞘;3分,大面積脫髓鞘。

1.3.7 ELISA檢測小鼠血清的炎性因子 眼眶靜脈叢采血法取小鼠靜脈血,離心后取血清,根據(jù)ELISA試劑說明書檢測各小鼠血清中IL-10、IL-1β、IL-6和IL-18的水平。

1.3.8 real-time PCR檢測脊髓組織炎癥相關(guān)因子的mRNA表達(dá) 提取各組脊髓組織總RNA,根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,TNF-α、TNFR1、IL-1β及內(nèi)參β-actin的引物由華大基因科技有限公司合成,引物序列見表1。依據(jù)real time-PCR試劑盒擴(kuò)增條件,在熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增結(jié)束后,采用2-ΔΔCt法計算各基因的RNA相對表達(dá)量。

1.3.9 Western blot法測定脊髓組織RhoA/ROCK信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平 NBP體內(nèi)給藥28 d,取小鼠脊髓,液氮速凍后,-80 ℃保存。使用RIPA裂解液提取蛋白,BCA法測蛋白濃度。10% SDS-PAGE電泳分離蛋白,轉(zhuǎn)膜至PDVF膜。5%脫脂奶粉封閉1.5 h,按照抗體說明書加入一定稀釋比例的一抗[RhoA(1∶2 000)、ROCKⅠ(1∶1 000)、ROCKⅡ(1∶1 000)及β-actin(1∶5 000)],4 ℃搖床過夜;次日,PBST洗3次,加入辣根過氧化物酶標(biāo)記兔抗鼠IgG二抗(1∶5 000),室溫孵育1 h,PBST洗滌3次;最后,用3-氨基-9-乙基咔唑(3-amino-9-ethylcarbazole,AEC)顯色試劑盒進(jìn)行顯色。用Image J分析蛋白條帶灰度值,以RhoA、ROCKⅠ及ROCKⅡ與內(nèi)參蛋白β-actin灰度比值計算其相對表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠體質(zhì)量變化情況

與對照組相比,EAE組小鼠體質(zhì)量從免疫后第2周開始下降(P<0.01);與EAE組比較,L-NBP組和H-NBP組小鼠體質(zhì)量從免疫第2周開始增加(P<0.05);與L-NBP組比較,H-NBP組小鼠體質(zhì)量在免疫后第4周增加明顯,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見圖1)。

注:與對照組比較,**P<0.001,***P<0.001,****P<0.000 1;與EAE組比較,#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001;與L-NBP組比較,△P<0.05。圖1 各組小鼠免疫后體質(zhì)量變化情況Figure 1 Changes of body weight of mice after the immunization in each group

2.2 各組小鼠神經(jīng)功能障礙評分結(jié)果

對照組神經(jīng)功能評分每時點均為0分;與對照組相比,EAE組小鼠的神經(jīng)功能評分降低(P<0.000 1)。與EAE組相比,L-NBP組和H-NBP組小鼠的神經(jīng)功能障礙評分均降低(P<0.05),發(fā)病潛伏期均延長(P<0.05),發(fā)病高峰期均延遲(P<0.05)。與L-NBP組相比,H-NBP組小鼠的神經(jīng)功能障礙評分降低(P<0.05),發(fā)病潛伏期延長(P<0.01),發(fā)病高峰期延遲(P<0.01,見圖2)。

注:與對照組比較,****P<0.000 1;與EAE組比較,##P<0.01,###P<0.001,####P<0.000 1;與L-NBP組比較,△P<0.05,△△P<0.01。圖2 NBP對EAE小鼠的神經(jīng)功能障礙的影響Figure2 Effect of NBP on neurological dysfunction in EAE mice

2.3 各組小鼠脊髓組織HE染色結(jié)果

HE染色結(jié)果顯示:與對照組相比,EAE組小鼠脊髓組織血管周圍有大量炎癥細(xì)胞浸潤,脊髓組織組織病理學(xué)評分升高(P<0.000 1);與EAE組相比,L-NBP組和H-NBP組炎癥細(xì)胞浸潤減少,組織病理學(xué)評分均降低(P<0.05);與L-NBP組相比,H-NBP組炎癥細(xì)胞浸潤減少,組織病理學(xué)評分降低(P<0.05,見圖3)。

圖3 各組小鼠脊髓組織HE染色結(jié)果 (×200)Figure 3 HE staining results of spinal cord tissue of mice in each group (×200)

2.4 各組小鼠脊髓組織LFB染色結(jié)果

LFB染色結(jié)果顯示:與對照組比較,EAE組出現(xiàn)明顯的脫髓鞘及空泡改變,LFB評分增高(P<0.000 1);與EAE組相比,L-NBP組和H-NBP組小鼠的脫髓鞘及空泡化程度降低,LFB評分均降低(P<0.05);與L-NBP組相比,H-NBP組小鼠的脫髓鞘及空泡化程度進(jìn)一步降低,LFB評分降低(P<0.05,見圖4)。

圖4 LFB染色觀察NBP對小鼠脊髓組織的影響 (×200)Figure 4 Effect of NBP on spinal cord of mice observed by LFB staining (×200)

2.5 各組小鼠外周血IL-10、IL-1β、IL-6和IL-18表達(dá)變化

與對照組相比,EAE組小鼠外周血IL-10含量降低(P<0.000 1),IL-18、IL-6和IL-1β含量增加(P<0.001);與EAE組相比,L-NBP組和H-NBP組小鼠外周血IL-10含量增加,IL-18、IL-1β和IL-6含量均降低(P<0.05);與L-NBP組相比,H-NBP組小鼠外周血IL-10含量增加,IL-18、IL-1β和IL-6含量降低(P<0.05,見圖5)。

注:與對照組比較,***P<0.001,****P<0.000 1;與EAE組比較,##P<0.01,###P<0.001,####P<0.000 1;與L-NBP組比較,△P<0.05,△△P<0.01。圖5 NBP對EAE小鼠中血清IL-10、IL-1β、IL-6及IL-18的影響Figure 5 Effect of NBP on serum levels of IL-10, IL-1β, IL-6 and IL-18 in EAE mice

2.6 各組小鼠脊髓組織中炎癥因子相關(guān)基因的mRNA表達(dá)變化

real time-PCR結(jié)果顯示,與對照組相比,EAE組炎性細(xì)胞因子TNF-α、TNF受體1(TNFR1)及IL-1β mRNA表達(dá)升高(P<0.05);與EAE組相比,L-NBP組和H-NBP組TNF-α、TNFR1及IL-1β mRNA表達(dá)降低(P<0.05);與L-NBP組相比,H-NBP組TNF-α、TNFR1及IL-1β mRNA表達(dá)降低(P<0.05,見圖6)。

注:與對照組比較,***P<0.001,****P<0.000 1;與EAE組比較,##P<0.01,###P<0.001,####P<0.000 1;與L-NBP組比較,△P<0.05,△△P<0.01。圖6 NBP對EAE小鼠TNF-α、TNFR1和IL-1β mRNA表達(dá)的影響Figure 6 Effect of NBP on mRNA expressions of TNF-α, TNFR1 and IL-1β in EAE mice

2.7 各組小鼠脊髓組織RhoA/ROCK信號通路各蛋白的表達(dá)變化

與對照組相比,EAE組RhoA、ROCKⅠ以及ROCKⅡ蛋白表達(dá)增高(P<0.05);與EAE組相比,L-NBP組和H-NBP組RhoA、ROCKⅠ以及ROCKⅡ蛋白表達(dá)均降低(P<0.05);與L-NBP組相比,H-NBP組ROCKⅠ表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義,RhoA和ROCKⅡ蛋白表達(dá)降低(P<0.05,見圖7)。

注:與對照組比較,****P<0.000 1;與EAE組比較,###P<0.001,####P<0.000 1;與L-NBP組比較,△△P<0.01。圖7 NBP對EAE小鼠脊髓組織RhoA、ROCKⅠ和ROCKⅡ蛋白表達(dá)的影響Figure 7 Effect of NBP on the expression of RhoA, ROCKⅠ and ROCKⅡ proteins in spinal cord of EAE mice

3 討論

MS是一種自身免疫性疾病,研究者致力于探索免疫系統(tǒng)異常對疾病發(fā)生和發(fā)展的影響[2]。研究表明,T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞在MS中起著重要的作用[16]。另外,神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)也是MS主要特征之一[17]。研究者發(fā)現(xiàn)神經(jīng)炎癥會導(dǎo)致神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞損傷和髓鞘破壞[18,19],對微血管也有影響[20],相關(guān)的炎癥介質(zhì)加速了MS疾病進(jìn)展。目前關(guān)于MS的治療主要包括免疫調(diào)節(jié)治療、疾病修飾治療、康復(fù)治療和對癥治療等[21,22]。

研究發(fā)現(xiàn),NBP對缺血性卒中具有顯著的神經(jīng)保護(hù)作用[23]。此外,NBP對神經(jīng)退行性疾病的治療作用已經(jīng)超過了對中風(fēng)的作用,包括阿爾茨海默病(AD)[24,25]、血管性癡呆(VaD)[26]、帕金森病(PD)[27]和肌萎縮性側(cè)索硬化癥(ALS)等。然而,NBP對MS治療作用的研究尚未見報道。所以本實驗研究NBP對EAE的抑制炎癥作用,結(jié)果表明,NBP能夠顯著改善EAE小鼠的臨床癥狀和病理變化。首先,NBP改善了EAE小鼠的神經(jīng)功能癥狀。通過HE染色結(jié)果觀察到,在EAE小鼠中,脊髓組織出現(xiàn)了大量的炎癥細(xì)胞浸潤,且組織病理學(xué)評分明顯升高;而與EAE組相比,NBP組炎癥細(xì)胞浸潤和組織病理學(xué)評分均顯著降低。這表明NBP具有抗炎作用,能夠減少炎癥細(xì)胞的浸潤,改善脊髓組織的病理變化。其次,通過LFB染色結(jié)果觀察到,在EAE小鼠中,出現(xiàn)了明顯的脫髓鞘和空泡化,而NBP組脫髓鞘和空泡化現(xiàn)象明顯減少。這說明NBP能夠改善EAE小鼠的脫髓鞘情況,可能有助于保護(hù)神經(jīng)纖維,來改善EAE的嚴(yán)重程度。進(jìn)一步的實驗結(jié)果顯示,與對照組相比,EAE組小鼠的外周血中IL-10含量降低,而IL-18、IL-1β和TNF-β含量增加;而與EAE組相比,NBP組IL-10含量增加,IL-18、IL-1β和TNF-β含量降低。這表明NBP可能通過調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)的表達(dá),改善炎癥狀態(tài)。此外,通過real time-PCR分析發(fā)現(xiàn),在EAE小鼠的脊髓組織中,炎性細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β以及TNFR1的表達(dá)明顯升高,而NBP組這些炎癥因子的表達(dá)水平下降。這進(jìn)一步證實了NBP具有抗炎作用,對EAE具有重要的保護(hù)作用。上述結(jié)果說明NBP可通過抑制神經(jīng)炎癥來實現(xiàn)神經(jīng)保護(hù)作用,與NBP能減輕神經(jīng)炎癥[28]的報道相一致。

RhoA/ROCK通路蛋白是缺血性卒中病理過程中神經(jīng)炎癥的重要調(diào)節(jié)因子[12]。研究表明,RhoA/ROCK通路的上調(diào)在促進(jìn)神經(jīng)炎癥和介導(dǎo)腦損傷中具有重要作用[29]。抑制RhoA/ROCK通路可以減少促炎因子IL-6、IL-1β和TNF-α等的釋放,促進(jìn)神經(jīng)元的恢復(fù)[30]。本研究結(jié)果顯示,EAE小鼠的脊髓組織中RhoA、ROCKⅠ和ROCKⅡ蛋白的表達(dá)升高,說明其神經(jīng)炎癥可能是通過上調(diào)RhoA/ROCK通路來實現(xiàn)的;而經(jīng)NBP干預(yù)后RhoA、ROCKⅠ和ROCKⅡ蛋白表達(dá)下降。表明NBP可能通過抑制RhoA/ROCK信號通路的激活,發(fā)揮其保護(hù)作用。

綜上所述,NBP通過抑制炎癥細(xì)胞浸潤和炎癥因子的表達(dá),改善脫髓鞘,調(diào)節(jié)免疫介質(zhì)的平衡,通過抑制RhoA/ROCK信號通路的激活,發(fā)揮其對EAE小鼠的保護(hù)作用。這些結(jié)果的發(fā)現(xiàn)為MS的治療提供了更為全面的理論支持。但本研究也存在一定的局限性:①沒有評估NBP的不良反應(yīng);②缺乏陽性對照組,樣本量偏小;③未使用RhoA/ROCK通路的抑制劑來確定NBP治療EAE的確切機制。因此,還需要更多的研究進(jìn)一步揭示NBP/RhoA/ROCK與抑制神經(jīng)炎癥之間的確切關(guān)系。