張 媛,魯 楊,彭迎春,劉穎燕,章樂霞,楊 洋(樂山市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科,樂山 64000;西安市人民醫(yī)院,西安市第四醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心;通訊作者,E-mail:yangyang9840056@63.com)

子癇前期(preeclampsia,PE)是一種妊娠期特有的妊娠期高血壓合并癥,是導(dǎo)致孕產(chǎn)婦和圍產(chǎn)兒死亡、早產(chǎn)和胎兒生長受限的主要原因,其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,目前缺乏有效的治療方法[1,2]。PE的發(fā)生發(fā)展與炎癥反應(yīng)過度激活和氧化應(yīng)激產(chǎn)物水平增加有關(guān),抗炎和抗氧化在PE治療中起重要作用[3]。血管內(nèi)皮功能障礙是PE發(fā)病的中心環(huán)節(jié)[4,5]。正常情況下,細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)、血管細(xì)胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)和白細(xì)胞功能相關(guān)抗原(leukocyte function-related antigen-1,LFA-1)的表達(dá)水平較低,無法使內(nèi)皮黏附中性粒細(xì)胞[6]。然而,腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ(interferon-γ,IFN-γ)、白細(xì)胞介素-1(interleukin-1,IL)和單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP)等促炎細(xì)胞因子的增加可激活PE患者血管內(nèi)皮和白細(xì)胞上的黏附分子配體,從而上調(diào)ICAM-1、VCAM-1和LFA-1的水平,導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞與中性粒細(xì)胞黏附并誘導(dǎo)內(nèi)皮損傷[7]。因此,改善內(nèi)皮功能障礙是治療PE的有效途徑。迷迭香酸(rosmarinic acid,RA)是一種來自唇形科植物的水溶性天然酚酸類化合物,如迷迭香、鼠尾草、羅勒等。RA具有多種藥理活性,包括抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒等[8,9]。研究表明,RA通過降低內(nèi)皮素-1和血管緊張素轉(zhuǎn)換酶活性以及增加一氧化氮水平來降低果糖誘導(dǎo)的高血壓[10]。RA通過調(diào)節(jié)磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶和葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4的表達(dá)來改善鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的1型糖尿病或高脂飲食誘導(dǎo)的2型糖尿病大鼠的高血糖和胰島素敏感性[11]。然而,目前尚無文獻(xiàn)報道RA在PE中的應(yīng)用效果。本研究通過觀察RA對PE大鼠收縮壓、24 h尿蛋白、胎鼠體質(zhì)量和死亡率、PE大鼠胎盤和腎臟組織形態(tài)、血清氧化應(yīng)激指標(biāo)、血清炎癥細(xì)胞因子、胎盤黏附因子、胎盤TLR4信號通路的影響,探討RA治療PE大鼠模型的效果,及其對炎癥和內(nèi)皮功能障礙的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗試劑 迷迭香酸(R4033)購自美國Sigma公司;L-NAME(ST1555-10g),蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒(C0105M)、過碘酸雪夫(PAS)染色試劑盒(C0142M)、RIPA裂解液(P0013C),BCA試劑盒(P0012S)、BeyoECL Plus(P0018S)購自上海碧云天生物技術(shù)公司;超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(A001-3-2)、丙二醛(MDA)試劑盒(A003-1-2)購自南京建成生物工程研究所;IL-1β ELISA試劑盒(ER1094)、IL-6 ELISA試劑盒(ER0042)、IFN-γ ELISA試劑盒(ER0012)、MCP-1 ELISA試劑盒(ER0047)購自武漢菲恩生物科技有限公司;ICAM-1(ab171123)、LFA-1(ab52895)、VCAM-1(ab174279)、Toll樣受體4(TLR4)(ab217274);髓樣分化因子88(MyD88)(ab2064)、GAPDH(ab181602)一抗和山羊抗兔IgG H&L(HRP)(ab6721)二抗購自美國Abcam公司。

1.1.2 實驗儀器 ZS-Z無創(chuàng)尾動脈血壓測量分析系統(tǒng)(北京眾實迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責(zé)任公司);ZH-B6大鼠代謝籠(安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司);7600-020型全自動生化分析儀(日本日立公司)。

1.1.3 實驗動物 7～8周齡SPF級成年Sprague-Dawley(SD)大鼠(雄性:體質(zhì)量270～310 g;雌性:體質(zhì)量210～240 g)購自西安交通大學(xué)實驗動物中心,生產(chǎn)許可證SCXK(陜)2020-001。所有大鼠均不限制食物和水,并在(22±3)℃、(60±3)%濕度和12 h光暗循環(huán)的環(huán)境中飼養(yǎng)。將大鼠按照雌雄2∶1比例同籠飼養(yǎng),觀察到雌鼠陰道中精子并有陰栓脫落為孕第0天。本研究大鼠實驗操作遵循實驗動物福利倫理審查指南標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行,經(jīng)過西安市人民醫(yī)院倫理委員會審查通過(審批號202203161703)。

1.2 方法

1.2.1 PE大鼠建模 參考文獻(xiàn)[12]方法建立PE大鼠模型。孕第11天開始,對大鼠連續(xù)4 d每天皮下注射1 mL的左旋硝基精氨酸甲酯(L-NAME,200 mg/kg),孕第15天測量收縮壓(SBP),SBP升高30 mmHg以上表示建模成功。

1.2.2 大鼠分組及處理 孕第15天時,將30只成功建模的大鼠隨機(jī)分為3組:模型組、50RA組和100RA組,每組10只;另取10只同期孕鼠作為對照組。孕第15天時,對照組和模型組大鼠每天灌胃1 mL的0.9%氯化鈉溶液,50RA組和100RA組大鼠分別給予1 mL的劑量為50 mg/kg和100 mg/kg的RA治療處理,各組大鼠均連續(xù)灌胃7 d處理。參考文獻(xiàn)[13,14]設(shè)定RA的使用劑量。

1.2.3 SBP的測定 孕第21天時,應(yīng)用無創(chuàng)尾動脈血壓測量分析系統(tǒng)測量各組大鼠收縮壓(systolic blood pressure,SBP)。

1.2.4 24 h尿蛋白的測定 孕第21天時,使用ZH-B6大鼠代謝籠收集尿液,將大鼠尿液離心(4 ℃,2 000 r/min,15 min)取上清。通過全自動生化分析儀測定24 h尿蛋白。

1.2.5 胎鼠體質(zhì)量和死亡率的測定 孕第21天時,用2%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉孕鼠,剖宮取出胎鼠,統(tǒng)計各組胎鼠體質(zhì)量和死亡率。

1.2.6 胎盤和腎臟組織學(xué)染色 孕第21天時,分離大鼠胎盤和腎臟,組織標(biāo)本在4%多聚甲醛中固定48 h,石蠟包埋,切成4 μm厚切片。按照試劑盒說明,胎盤組織進(jìn)行HE染色,腎臟組織進(jìn)行PAS染色。

1.2.7 血清SOD和MDA的檢測 孕第21天時,大鼠眼眶靜脈叢采血0.5 mL,離心(4 ℃,3 000 r/min,15 min)取血清。按照試劑盒說明檢測大鼠血清SOD和MDA水平。

1.2.8 血清炎性細(xì)胞因子的檢測 孕第21天時,使用ELISA試劑盒檢測大鼠血清中炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、IFN-γ和MCP-1的水平。

1.2.9 Western blot檢測ICAM-1、LFA-1、VCAM-1、TLR4和MyD88蛋白表達(dá)水平 使用RIPA裂解緩沖液提取大鼠胎盤組織勻漿中的總蛋白,并使用BCA試劑盒測定蛋白濃度。蛋白質(zhì)(45 μg/泳道)通過10%的SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。在與抗ICAM-1(1∶1 000)、LFA-1(1∶2 000)、VCAM-1(1∶1 000)、TLR4(1∶2 000)、MyD88(1∶2 000)一抗在4 ℃過夜孵育。隨后,將膜與山羊抗兔IgG H&L(HRP)(1∶2 000)二抗在室溫下孵育2 h。使用BeyoECL Plus顯色,并使用Image J軟件分析光密度。GAPDH(1∶2 000)作為內(nèi)參蛋白。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 RA對PE大鼠SBP和24 h尿蛋白的影響

孕第21天時,與對照組相比,模型組大鼠SBP和24 h尿蛋白水平均升高(P<0.05);與模型組相比,50RA組和100RA組大鼠的SBP和24 h尿蛋白水平均降低(P<0.05,見表1)。

表1 RA對孕21 d PE大鼠SBP和24 h尿蛋白水平的影響Table 1 Effects of RA on SBP and 24 h urine protein le-vels in PE rats at the 21st day of pregnancy

2.2 RA對胎鼠體質(zhì)量和死亡率的影響

與對照組相比,模型組胎鼠體質(zhì)量降低(P<0.05);與模型組相比,50RA組和100RA組胎鼠體質(zhì)量均升高(P<0.05,見表2)。與對照組相比,模型組胎鼠死亡率升高(4.92%vs29.82%,P<0.05);與模型組相比,50RA組和100RA組胎鼠死亡率均降低(29.82%vs17.46%,13.33%,P<0.05);各組間胎鼠死亡率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=9.928,P=0.019,見表2)。

表2 RA對胎鼠體質(zhì)量和死亡率的影響Table 2 Effects of RA on body weight and mortality of fetal rats

2.3 RA對PE大鼠胎盤和腎臟組織形態(tài)的影響

孕第21天時,胎盤組織HE染色顯示,對照組大鼠胎盤血運豐富,形態(tài)正常;模型組大鼠胎盤絨毛數(shù)量減少,結(jié)構(gòu)異常,壞死;50RA組和100RA組大鼠的胎盤形態(tài)較模型組明顯改善(見圖1)。孕第21天時,腎臟組織PAS染色顯示,對照組大鼠腎小球形態(tài)正常,結(jié)構(gòu)完整;模型組大鼠腎小球肥大,邊界不清晰,腎小球系膜基質(zhì)堆積,腎小球基底膜增厚;50RA組和100RA組的大鼠腎臟形態(tài)較模型組明顯改善(見圖1)。

圖1 RA對孕21 d PE大鼠胎盤和腎臟組織形態(tài)的影響 (×400)Figure 1 Effects of RA on placenta and kidney morphology of PE rats at pregant day 21 (×400)

2.4 RA對PE大鼠血清氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

各組大鼠孕第21天時血清SOD和MDA水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。與對照組相比,模型組的血清SOD水平降低,MDA升高(P<0.05);與模型組相比,50RA組和100RA組的血清SOD水平均升高,MDA均降低(P<0.05,見圖2)。

注:與對照組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05;與50RA組比較,&P<0.05。圖2 RA對孕21 d PE大鼠血清SOD和MDA水平的影響Figure 2 Effect of RA on serum SOD and MDA levels in PE rats at pregant day 21

2.5 RA對PE大鼠血清炎癥細(xì)胞因子的影響

孕第21天時,與對照組相比,模型組大鼠的血清IL-1β、IL-6、IFN-γ和MCP-1水平均升高(P<0.05);與模型組相比,50RA組和100RA組大鼠的血清IL-1β、IL-6、IFN-γ和MCP-1水平均降低(P<0.05,見圖3)。

注:與對照組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05;與50RA組比較,&P<0.05。圖3 RA對孕21 d PE大鼠血清IL-1β、IL-6、IFN-γ和MCP-1水平的影響Figure 3 Effect of RA on serum IL-1β, IL-6, IFN-γ and MCP-1 levels in PE rats at pregant day 21

2.6 RA對PE大鼠胎盤黏附因子的影響

孕第21天時,與對照組相比,模型組大鼠胎盤組織中ICAM-1、LFA-1和VCAM-1的蛋白表達(dá)水平均升高(P<0.05);與模型組相比,50RA組和100RA組大鼠胎盤組織中ICAM-1、LFA-1和VCAM-1的蛋白表達(dá)水平均降低(P<0.05,見圖4)。

注:與對照組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05;與50RA組比較,&P<0.05。圖4 Western blot檢測RA對孕21 d PE大鼠胎盤組織中ICAM-1、LFA-1和VCAM-1的蛋白表達(dá)水平的影響Figure 4 Effect of RA on protein expression levels of ICAM-1, LFA-1 and VCAM-1 in placental tissue of PE rats at pregant day 21 by Western blot

2.7 RA對PE大鼠胎盤TLR4信號通路的影響

孕第21天時,與對照組相比,模型組大鼠胎盤組織中TLR4和MyD88的蛋白表達(dá)水平均升高(P<0.05);與模型組相比,50RA組和100RA組大鼠胎盤組織中TLR4和MyD88的蛋白表達(dá)水平均降低(P<0.05,見圖5)。

注:與對照組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05;與50RA組比較,&P<0.05。圖5 Western blot檢測RA對孕21 d PE大鼠胎盤組織中TLR4和MyD88的蛋白表達(dá)水平的影響Figure 5 Effect of RA on protein expression levels of TLR4 and MyD88 in placental tissue of PE rats at pregant day 21 by Western blot

3 討論

氧化應(yīng)激、炎癥、免疫和血管內(nèi)皮功能障礙已經(jīng)成為治療PE的創(chuàng)新靶點[15]。探索靶向這些異常途徑的新藥物可能會產(chǎn)生更有效的治療效果。目前有許多預(yù)防和治療PE的候選藥物正在研究中,包括質(zhì)子泵抑制劑[16]、二甲雙胍[17]、他汀類藥物[18]、白藜蘆醇[19]、褪黑素[20]等,然而,這些藥物大多數(shù)具有副作用。阻礙PE新藥研發(fā)的一個重要問題是新藥對母嬰的安全性。RA是一種天然酚酸類化合物,目前廣泛用于食品和化妝品行業(yè),具有良好的安全性[21]。此外,RA具有降壓、降糖、抗糖尿病等作用[10,11]。本研究推測RA可能是治療PE的高安全性潛在藥物,因此,本研究首次探索了RA治療PE大鼠模型的效果。L-NAME誘導(dǎo)PE大鼠模型是一種誘導(dǎo)實驗性高血壓的方法,其病情類似于臨床PE。本研究結(jié)果表明,50 mg/kg和100 mg/kg的RA均降低了PE大鼠SBP和24 h尿蛋白水平,提高了胎鼠體質(zhì)量,降低了胎鼠死亡率,改善了胎盤和腎臟組織形態(tài),這些結(jié)果說明RA在治療PE方面具有較高的潛力。

氧化應(yīng)激和炎癥是PE發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素,PE發(fā)展過程中的低氧環(huán)境可以促使過多的活性氧、炎癥因子釋放到母體循環(huán)中[22],損傷胎盤內(nèi)皮,引起內(nèi)皮功能障礙[23]。大量研究證實,抗氧化酶SOD在PE患者中降低[24],而脂質(zhì)氧化代謝物MDA升高[25]。IL-1β、IL-6、IFN-γ和MCP-1是參與PE胎盤炎癥的主要因子[26,27]。本研究表明,50 mg/kg和100 mg/kg的RA均抑制了PE大鼠的氧化應(yīng)激和炎癥,表現(xiàn)為血清SOD水平升高,MDA降低,以及血清IL-1β、IL-6、IFN-γ和MCP-1水平降低。因此,RA的抗氧化和抗炎作用可能是治療PE的主要機(jī)制。內(nèi)皮調(diào)節(jié)血管擴(kuò)張能力,內(nèi)皮功能障礙表現(xiàn)為血管的收縮和舒張動態(tài)平衡功能被破壞,從而引起高血壓,這是PE的主要臨床特征[28]。血管收縮增強(qiáng)損害了腦、心、肝和腎等主要器官的血液供應(yīng),在腎臟中主要表現(xiàn)為尿蛋白排泄增加,稱為蛋白尿[29]。黏附因子(如ICAM-1、LFA-1和VCAM-1)與內(nèi)皮功能障礙密切相關(guān),黏附因子的大量分泌可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞與中性粒細(xì)胞黏附并誘導(dǎo)內(nèi)皮損傷[6,7]。本研究表明,50 mg/kg和100 mg/kg的RA均抑制了PE大鼠胎盤組織中ICAM-1、LFA-1和VCAM-1的蛋白表達(dá),表明RA可能通過減少胎盤組織的黏附因子來減輕PE大鼠的內(nèi)皮功能障礙。目前,其他學(xué)者也報道了RA對內(nèi)皮功能的保護(hù)作用。例如,RA通過激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)通路減輕過氧化氫引起的大鼠主動脈環(huán)內(nèi)皮功能障礙[30];RA可減輕糖尿病引起的大鼠主動脈血管功能障礙[13]。因此,RA治療PE的機(jī)制與其內(nèi)皮功能保護(hù)作用有密切關(guān)聯(lián)。

TLR4信號通路在人類各種疾病病理損傷中發(fā)揮重要作用[31]。MyD88是重要的細(xì)胞內(nèi)銜接蛋白,可作為TLR4信號級聯(lián)的效應(yīng)器,MyD88的激活可促進(jìn)炎癥[32]。TLR4信號通路也是參與PE形成的重要通路[33]。TLR4信號通路不僅參與炎癥和氧化應(yīng)激的調(diào)控,而且其過度激活也會損傷內(nèi)皮功能[34]。目前,大量學(xué)者認(rèn)為TLR4信號通路是治療PE的重要靶標(biāo)[35,36]。本研究表明,50 mg/kg和100 mg/kg的RA均抑制了PE大鼠胎盤組織中TLR4和MyD88的蛋白表達(dá),從而抑制了TLR4信號通路的激活。其他文獻(xiàn)已經(jīng)報道了RA對TLR4及其下游信號分子表達(dá)的抑制作用[37,38]。因此,本研究認(rèn)為RA可能通過減輕TLR4信號通路介導(dǎo)的炎癥、氧化應(yīng)激和內(nèi)皮功能障礙來發(fā)揮其對PE的治療作用。

綜上所述,本研究表明RA有效減輕了PE大鼠的臨床癥狀,RA可能通過減輕TLR4信號通路介導(dǎo)的炎癥、氧化應(yīng)激和內(nèi)皮功能障礙來發(fā)揮其對PE的治療作用。因此,RA作為治療PE的新型天然藥物,可能具有較高的開發(fā)價值。