王 丹,楊啟梅,劉曉娜,陳菁華(西北婦女兒童醫(yī)院耳鼻喉科,西安 7006;陜西省人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科;通訊作者,E-mail:703379@qq.com)

慢性中耳炎(chronic otitis media,COM)是臨床上多發(fā)的兒童性疾病[1],主要分為慢性分泌性中耳炎和慢性化膿性中耳炎[2,3],疾病的發(fā)展會(huì)導(dǎo)致聽(tīng)力損失、語(yǔ)言發(fā)育延遲以及永久性中耳損傷等[4]。研究表明,在COM的細(xì)菌感染中,大多數(shù)病例是由革蘭氏陰性菌引起[5]。脂多糖是革蘭氏陰性菌的一種成分,已在人類(lèi)中耳積液(middle ear fluid,MEE)中檢測(cè)到[6],其在慢性中耳炎患者中的水平明顯高于急性中耳炎患者[7]。研究表明,COM與持續(xù)性細(xì)菌感染有關(guān),在90%以上的COM患者的中耳黏膜(middle ear mucosa,MEM)活檢標(biāo)本中均發(fā)現(xiàn)了不同的致病菌群[8]。據(jù)報(bào)道,咽鼓管(eustachian tube,ET)功能紊亂和持續(xù)的細(xì)菌感染與COM的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)[9]。通過(guò)ET阻斷產(chǎn)生的COM小鼠顯示出持續(xù)的漿液性中耳積液,同時(shí)伴有中耳腔內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(尤其是淋巴細(xì)胞)和細(xì)胞因子產(chǎn)生的組織學(xué)變化[10]。

不可分型流感嗜血桿菌(non-typeableHaemophilusinfluenzae,NTHi)被認(rèn)為是COM的主要病原體[11]。NTHi菌株可以在氣道內(nèi)持續(xù)很長(zhǎng)時(shí)間,當(dāng)宿主的黏膜清除機(jī)制受損時(shí),NTHi可以引起一系列的氣道感染[12]。目前,通常采用制造ET功能障礙和持續(xù)NTHi細(xì)菌感染構(gòu)建COM動(dòng)物模型,以用于研究COM的發(fā)病機(jī)制[12-14]。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg),也被稱(chēng)為抑制性T細(xì)胞,是由一個(gè)特定的細(xì)胞亞群組成,在功能上抑制免疫系統(tǒng)的過(guò)度激活,保持對(duì)自我抗原的免疫耐受[15],編碼Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子叉頭盒P3(fork headbox protein 3,Foxp3)的基因是Treg分化和功能的主基因[16]。研究表明,Treg可針對(duì)體內(nèi)的細(xì)菌、病毒和寄生蟲(chóng)抗原被激活和擴(kuò)大[17]。本研究通過(guò)ET阻斷和接種NTHi,建立了持續(xù)性NTHi感染的小鼠COM模型,以探究Treg對(duì)慢性中耳炎感染進(jìn)展的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)購(gòu)自上海生工有限公司;巧克力瓊脂、多聚甲醛購(gòu)自碧云天生物科技有限公司;27號(hào)針頭購(gòu)自Hamilton公司(美國(guó));山羊血清、牛血清白蛋白購(gòu)自AusgeneX公司(澳大利亞);一抗TNF-α、IL-1β、IL-10、TGF-β和CD4抗體、Foxp3抗體、CD25抗體均購(gòu)自Abcam公司(美國(guó));商用ELISA試劑盒購(gòu)自R&D公司(美國(guó));Ⅳ型膠原酶購(gòu)自Sigma公司(美國(guó));CD4+CD25+FOXP3+Treg調(diào)節(jié)性T細(xì)胞檢測(cè)試劑盒購(gòu)自EXBIO公司(捷克);蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與菌株 4周齡BALB/c小鼠購(gòu)自陜西中醫(yī)藥大學(xué)【SCXK(陜)2021-001】,所有小鼠均在西北婦女兒童醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物屏障設(shè)施中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,然后進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn),本研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合動(dòng)物福利規(guī)范,獲得本院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(審批號(hào):No.2021-9-06-1035)。具有活性的不可分型流感嗜血桿菌NTHi菌株由西北婦女兒童醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 方法

1.2.1 NTHi誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性COM小鼠模型 根據(jù)文獻(xiàn)所述研究方法[18],NTHi菌株采用巧克力瓊脂于37 ℃和5%CO2下培養(yǎng)16 h,測(cè)定細(xì)菌濃度,加入磷酸鹽緩沖溶液(PBS)制備濃度為2×109CFU/mL的細(xì)菌懸液。采用異氟醚吸入法麻醉小鼠后,于小鼠頜下皮膚處切口,暴露右下鼓室,切開(kāi)靠近鼓室的咽鼓管(ET),并將明膠海綿插入ET(形成ET阻塞)。然后用27號(hào)針頭在鼓膜上開(kāi)2個(gè)微孔,將微吸管插入其中一個(gè)孔中,緩慢接種10 μL的NTHi細(xì)菌懸浮液,每3 d注射1次,共3次。通過(guò)對(duì)小鼠進(jìn)行耳鏡監(jiān)測(cè),出現(xiàn)中耳積液和中耳黏膜組織增厚表示造模成功。本實(shí)驗(yàn)設(shè)置模型組(n=40)和對(duì)照組(n=40),模型組為造模成功的小鼠,對(duì)照組為未進(jìn)行ET阻斷和NTHi接種的小鼠。

分別在末次注射后的第3天(M3 d組)、第14天(M14 d組)、第28天(M28 d組)和第56天(M56 d組),模型組和對(duì)照組均各取8只小鼠給予腹腔注射3%戊巴比妥麻醉處理并斷頭處死。對(duì)各只小鼠進(jìn)行耳鏡監(jiān)測(cè),確認(rèn)MEE狀態(tài)和鼓膜的變化。根據(jù)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[19]進(jìn)行炎癥嚴(yán)重程度評(píng)分:0分,灰色和半透明的鼓膜,沒(méi)有MEE;1分,灰色和不透明的鼓膜,有漿液性MEE或黏液性MEE;2分,黃色和不透明鼓膜,有膿性MEE;3分,不透明鼓膜,有漿液性MEE。收集各只小鼠MEE,取部分連續(xù)稀釋后將樣品置于巧克力瓊脂上,培養(yǎng)并計(jì)數(shù)細(xì)菌菌落。使用200 μL生理鹽水清洗小鼠中耳,分離收集小鼠中耳組織和中耳黏膜組織后續(xù)實(shí)驗(yàn)備用。

1.2.2 蘇木精-伊紅(HE)染色檢測(cè)小鼠中耳黏膜組織炎性病變程度 各組小鼠中耳黏膜組織使用4%多聚甲醛固定48 h,并在0.12 mol/L的EDTA溶液(pH=7.4)中脫鈣后,再進(jìn)行梯度乙醇脫水和二甲苯處理,然后包埋于石蠟切成4 μm厚度切片。按照試劑盒方法進(jìn)行HE染色,使用Image J軟件檢測(cè)和分析黏膜厚度和MEM中的炎性細(xì)胞數(shù)量,采用光學(xué)顯微鏡觀(guān)察并拍照。

1.2.3 免疫組織化學(xué)檢測(cè)CD4+和Foxp3+細(xì)胞水平 取1.2.2項(xiàng)下制好的石蠟切片,于室溫下用3%的H2O2處理15 min。再將切片于含5%正常山羊血清的PBS緩沖液中封閉處理30 min,然后加入兔抗小鼠CD4抗體(1∶500)或兔抗小鼠Foxp3抗體(1∶500)于含1%牛血清白蛋白的PBS緩沖液于室溫下孵育12 h。PBS清洗后,切片與加入生物素化的山羊抗兔抗體(1∶1 000)的1%牛血清白蛋白的PBS緩沖液于室溫下孵育6 h。用PBS沖洗后,經(jīng)過(guò)DAB液顯色,然后蘇木素染色、藍(lán)化、脫水和透明處理,最后中性樹(shù)膠封片,采用光學(xué)顯微鏡觀(guān)察并拍照,采用Image J軟件量化陽(yáng)性染色強(qiáng)度。

1.2.4 ELISA檢測(cè)小鼠MEE中炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-10和TGF-β水平 取1.2.1項(xiàng)下收集的MEE,按照ELISA試劑盒方法檢測(cè)腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、IL-10和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-β)的水平。

1.2.5 Western blot檢測(cè)小鼠中耳黏膜組織中炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-10和TGF-β蛋白表達(dá)水平 取方法1.2.1項(xiàng)下分離收集的各組小鼠中耳黏膜組織,加入RIPA裂解液提取組織總蛋白,采用BCA試劑盒對(duì)總蛋白定量。再經(jīng)過(guò)12%的SDS-PAGE電泳分離蛋白條帶,轉(zhuǎn)移至PVDF膜,然后加入5%的脫脂牛奶封閉。加入一抗TNF-α(1∶500)、IL-1β(1∶1 000)、IL-10(1∶500)和TGF-β(1∶500)于4 ℃下孵育過(guò)夜。再加入稀釋后的二抗于室溫下孵育2 h,經(jīng)過(guò)ECL顯色和曝光后成像。采用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值,GAPDH作為內(nèi)參蛋白。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)分析小鼠中耳黏膜組織CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞水平 參考文獻(xiàn)[20]方法,取1.2.1項(xiàng)下收集的小鼠新鮮中耳黏膜組織,采用0.5 mg/mL的Ⅳ型膠原酶解離處理組織,分離并培養(yǎng)制作獲得單細(xì)胞懸浮液,調(diào)整細(xì)胞密度為1.0×106個(gè)/mL用于流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。單細(xì)胞懸浮液中加入異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的抗CD4單克隆抗體mAb、藻紅素(PE)標(biāo)記的抗Foxp3 mAb和別藻藍(lán)蛋白(APC)標(biāo)記的抗CD25 mAb,然后4℃下避光處理30 min,PBS洗滌后流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)分析CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4+比例,采用Cell Quest軟件分析Treg的免疫熒光強(qiáng)度。

1.2.7 注射抗CD25 mAb模擬體內(nèi)Treg耗竭并檢測(cè)T細(xì)胞和炎性因子水平 參考文獻(xiàn)[21]方法,在ET阻斷和NTHi接種處理后第14,28,42天,每只小鼠腹腔注射125 μl抗-CD25 mAb(作為抗-CD25組,n=8),PBS組小鼠腹腔注射等體積PBS(n=8)。在治療第56天后,小鼠腹腔注射3%戊巴比妥麻醉處理后斷頭處死,立即分離收集脾臟、頸部淋巴結(jié)和中耳黏膜組織,采用IV型膠原酶解離處理制作獲得單細(xì)胞懸浮液。按照1.2.6所述檢測(cè)脾臟、頸部淋巴結(jié)和中耳黏膜組織中CD4+CD25+Foxp3+Treg陽(yáng)性細(xì)胞百分比;按照1.2.1所述收集各只小鼠MEE,培養(yǎng)并計(jì)數(shù)細(xì)菌菌落;按照1.2.3所述檢測(cè)中耳黏膜組織單細(xì)胞懸浮液中TNF-α、IL-1β、IL-10和TGF-β的水平。

1.3 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果

2.1 NTHi成功誘導(dǎo)構(gòu)建小鼠COM模型

與對(duì)照組相比,模型組小鼠均在3 d后出現(xiàn)中耳積液且為膿性,在第14天炎癥嚴(yán)重程度和細(xì)菌數(shù)量均至最高值;從第28天至第56天,小鼠炎癥嚴(yán)重程度和中耳積液細(xì)菌數(shù)量均呈一定程度下降,但相較于對(duì)照組仍處于較高水平(P<0.05,見(jiàn)表1)。

表1 兩組小鼠中耳炎癥嚴(yán)重程度和中耳積液細(xì)菌數(shù)量比較Table 1 Comparison of the severity of middle ear inflammation and the number of bacteria in middle ear effusion between the two groups of mice

2.2 NTHi誘導(dǎo)的COM小鼠中耳黏膜組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和黏膜厚度增加

HE染色結(jié)果顯示,對(duì)照組小鼠中耳黏膜組織正常;與對(duì)照組比較,模型組小鼠接種后第3天,小鼠中耳黏膜組織出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn),炎性細(xì)胞數(shù)量和黏膜厚度增加(P<0.05),到第14天至最高值;接種后第28天至第56天,小鼠中耳黏膜厚度和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度增加趨勢(shì)稍有減緩(P<0.05,見(jiàn)圖1)。

注:與對(duì)照組相比,*P<0.05,**P<0.01。圖1 NTHi誘導(dǎo)的COM小鼠中耳黏膜組織炎癥和黏膜厚度變化Figure 1 Changes of inflammation and mucosal thickness in mucosal tissue of COM mice induced by NTHi

2.3 NTHi誘導(dǎo)的COM小鼠中耳黏膜組織中CD4+CD25+Foxp3+ Treg細(xì)胞水平升高

免疫組化結(jié)果顯示,模型組小鼠接種后第3天,中耳黏膜組織中CD4+和Foxp3+細(xì)胞陽(yáng)性染色水平升高,從接種后第28天至第56天,中耳黏膜組織中CD4+和Foxp3+細(xì)胞陽(yáng)性染色水平升高趨勢(shì)稍有緩解(見(jiàn)圖2)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,模型組小鼠接種后第3天,中耳黏膜組織中CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞水平升高(P<0.05),到第14天至最高值;接種后第28天至第56天,與對(duì)照組相比仍處于較高水平(P<0.05,見(jiàn)圖3)。

圖2 免疫組織化學(xué)檢測(cè)小鼠中耳黏膜組織中CD4+和Foxp3+細(xì)胞變化Figure 2 Changes of CD4+ and Foxp3+ cells in mouse middle ear mucosa detected by immunohistochemistry

注:與對(duì)照組相比,*P<0.05,**P<0.01。圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠中耳黏膜組織中CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞變化Figure 3 Changes of CD4+CD25+Foxp3+ cells in mouse middle ear mucosa detected by flow cytometry

2.4 NTHi誘導(dǎo)的COM小鼠中耳積液和中耳黏膜組織中炎性因子水平升高

ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,模型組小鼠接種后第3天,中耳積液中促炎因子IL-1β和TNF-α的水平達(dá)到最高(P<0.001),在第14天抑炎因子IL-10和TGF-β的水平達(dá)到最高(P<0.001),在第28,56天,IL-1β、TNF-α、IL-10和TGF-β的水平均呈下降趨勢(shì),但與對(duì)照組相比仍處于較高水平(P<0.01,見(jiàn)圖4)。Western blot檢測(cè)小鼠中耳黏膜組織中炎性因子水平結(jié)果變化趨勢(shì)與ELISA檢測(cè)結(jié)果一致(見(jiàn)圖5)。

注:與對(duì)照組相比,**P<0.01,***P<0.001。圖4 ELISA檢測(cè)小鼠中耳積液中炎性因子表達(dá)水平變化Figure 4 Expressions of inflammatory factors in the middle ear effusion of mice detected by ELISA

注:與對(duì)照組相比,**P<0.01,***P<0.001。圖5 Western blot檢測(cè)小鼠中耳黏膜組織中炎性因子表達(dá)水平變化Figure 5 Expressions of inflammatory factors in mouse middle ear mucosa detected by Western blot

2.5 Treg細(xì)胞消耗對(duì)COM小鼠細(xì)菌清除和炎癥的影響

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,與PBS組小鼠相比,抗-CD25組小鼠中耳黏膜、脾臟和頸部淋巴結(jié)組織中CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞比例均顯著降低(P<0.05,見(jiàn)圖6)。細(xì)菌計(jì)數(shù)和炎性因子檢測(cè)結(jié)果顯示,與PBS組小鼠相比,抗-CD25組小鼠中耳積液中細(xì)菌數(shù)和中耳黏膜組織中炎性因子IL-1β、TNF-α、IL-10和TGF-β的水平均降低(P<0.01,見(jiàn)圖7)。

圖6 抗CD25 mAb對(duì)小鼠中耳黏膜組織、脾臟和頸部淋巴結(jié)中CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞的影響Figure 6 Effect of anti-CD25 mAb on CD4+CD25+Foxp3+ cells in middle ear mucosa tissue, spleen and cervical lymph nodes of mice

注:與PBS組相比,**P<0.01。圖7 抗CD25 mAb對(duì)小鼠中耳積液細(xì)菌數(shù)和中耳黏膜組織中炎性因子水平的影響Figure 7 Effects of anti-CD25 mAb on bacterial count and inflammatory factors in middle ear effusion of mice

3 討論

慢性中耳炎(COM)是中耳和乳突腔的一種慢性炎癥,通常由復(fù)發(fā)性急性中耳炎發(fā)展而來(lái),涉及多微生物的感染[22]。NTHi被認(rèn)為是呼吸道感染疾病的重要病原菌,也是急性中耳炎的主要病原體[23]。先前有研究報(bào)道[24],接種NTHi誘發(fā)了栗鼠的急性中耳炎,但在14 d后,僅能檢測(cè)到少量具有活性的NTHi,而在大鼠急性中耳炎模型中8 d后檢測(cè)不到NTHi的存在。以上動(dòng)物造模過(guò)程中并沒(méi)有實(shí)施ET阻斷處理,而中耳的感染進(jìn)程也僅限于幾個(gè)星期。在本研究中,通過(guò)將NTHi接種至中耳并采用ET阻斷處理成功建立了COM小鼠模型。結(jié)果顯示,COM小鼠的中耳黏膜增厚,且出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn);在造模后第56天,COM小鼠中耳黏膜組織仍存在炎癥病理狀態(tài),且在COM小鼠的中耳積液中均檢測(cè)到NTHi的存在。

CD4+CD25+Foxp3+Treg作為T(mén)淋巴細(xì)胞亞群的成員,主要對(duì)機(jī)體免疫反應(yīng)起到負(fù)調(diào)控作用,通過(guò)免疫抑制作用讓機(jī)體產(chǎn)生免疫耐受性,以防止自身免疫疾病的發(fā)生,同時(shí)還會(huì)導(dǎo)致炎癥反應(yīng)趨向慢性發(fā)展[25]。研究顯示,在健康黏膜中觀(guān)察到T細(xì)胞輔助亞群的平衡在炎癥黏膜中發(fā)生改變,CD4+/CD8+T細(xì)胞的比例根據(jù)慢性鼻炎炎癥的嚴(yán)重程度而增加[19]。本研究結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,模型組COM小鼠中耳黏膜組織中CD4+和Foxp3+細(xì)胞和CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞比例均發(fā)生不同程度的升高,這表明Treg在COM發(fā)生過(guò)程中已發(fā)揮免疫效應(yīng)。也有報(bào)道顯示,Treg細(xì)胞與炎癥反應(yīng)的發(fā)生密切相關(guān),且具有一定的抗炎作用,研究認(rèn)為T(mén)reg細(xì)胞通過(guò)對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)過(guò)度活化和病理性自身免疫反應(yīng)的抑制,發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能,維持機(jī)體免疫平衡,同時(shí)還可以發(fā)揮抗炎作用[26]。本研究中,與對(duì)照組比較,模型組COM小鼠隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng),小鼠中耳積液和中耳黏膜組織中促炎性因子IL-1β和TNF-α水平迅速升高,這些促炎因子激活機(jī)體先天和獲得性免疫系統(tǒng)清除侵入的抗原;同時(shí)也檢測(cè)到抑炎因子IL-10和TGF-β水平的升高,這可能提示機(jī)體內(nèi)T淋巴細(xì)胞亞群CD4+CD25+Foxp3+Treg發(fā)揮免疫抑制作用,通過(guò)分泌或誘導(dǎo)產(chǎn)生抑炎因子IL-10和TGF-β,以維持機(jī)體內(nèi)炎癥反應(yīng)的平衡,促使機(jī)體恢復(fù)正常免疫和生理水平,避免產(chǎn)生自身免疫性傷害。

CD4+T細(xì)胞可通過(guò)TGF-β誘導(dǎo)的Foxp3的表達(dá)轉(zhuǎn)化為CD4+Treg[27]。1型調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tr1細(xì)胞)通過(guò)產(chǎn)生高水平的IL-10來(lái)抑制抗原特異性免疫反應(yīng),而Tr1細(xì)胞在激活后可暫時(shí)表達(dá)Foxp3;調(diào)節(jié)T細(xì)胞3型(Th3)通過(guò)產(chǎn)生高水平的TGF-β以驅(qū)動(dòng)外周抗原特異性Foxp3調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化,在誘導(dǎo)和維持外周耐受方面發(fā)揮了關(guān)鍵作用[28]。在本研究中,這些Treg被認(rèn)為與NTHi感染中的持續(xù)炎癥有關(guān)。眾所周知,Treg在控制感染性疾病(包括病毒、寄生蟲(chóng)和細(xì)菌)方面發(fā)揮著重要作用,Treg在宿主防御中發(fā)揮著兩種不同的關(guān)鍵免疫作用(保護(hù)性或有害性)[29]。Treg細(xì)胞已成為機(jī)體對(duì)細(xì)菌、真菌和病毒免疫抵抗的重要組成部分,其發(fā)揮的免疫防御功能有效減輕了機(jī)體組織損傷程度,但另一方面也導(dǎo)致機(jī)體對(duì)入侵病原體的免疫反應(yīng)降低,致使病原體在宿主體內(nèi)持久存在[30]。研究表明,結(jié)核分枝桿菌對(duì)機(jī)體的持久性感染與Treg細(xì)胞在損傷組織內(nèi)持續(xù)增殖和聚集密切相關(guān),而當(dāng)對(duì)Treg細(xì)胞適當(dāng)消耗后,小鼠對(duì)結(jié)核分枝桿菌的負(fù)擔(dān)顯著下降[31]。嚴(yán)唯[32]研究發(fā)現(xiàn),煙曲霉菌感染小鼠肺部后,CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞參與了抑制宿主炎癥反應(yīng)過(guò)程,但同時(shí)也抑制了宿主對(duì)煙曲霉菌的清除作用;當(dāng)模型小鼠腹腔注射CD25中和抗體后,CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞比例下降,受感染的小鼠肺部對(duì)煙曲霉菌的負(fù)荷也下降。在本研究中,COM小鼠腹腔注射抗-CD25 mAb后,第56天CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞比例顯著下降,同時(shí)MEE中的細(xì)菌數(shù)量也顯著減少,這表明機(jī)體過(guò)度免疫后,CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞的適當(dāng)降低,能夠促進(jìn)宿主對(duì)細(xì)菌的清除作用,該結(jié)果與嚴(yán)唯[32]的研究結(jié)果一致。

本研究證明了Treg細(xì)胞在慢性中耳炎中發(fā)揮免疫保護(hù)和抑制自身免疫性傷害兩種不同免疫作用,同時(shí)發(fā)現(xiàn)在中耳局部的免疫應(yīng)答中Treg細(xì)胞發(fā)揮主要免疫作用,但炎癥作為一種可能涉及全身組織器官的反應(yīng),慢性中耳炎所引起的全身和局部免疫應(yīng)答中Treg細(xì)胞是否仍處于主導(dǎo)免疫角色未可知,這也是本研究的局限性之一。同時(shí),本研究未對(duì)慢性中耳炎小鼠Treg細(xì)胞發(fā)揮免疫效應(yīng)可能涉及到的分子信號(hào)通路做深入的解析,與T細(xì)胞分化相關(guān)的PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路[15],以及與中耳炎相關(guān)的TGF-β信號(hào)通路[33],都有可能是慢性中耳炎中Treg細(xì)胞發(fā)揮免疫作用的分子機(jī)制,這也是未來(lái)研究需要深度解析的方向。

綜上所述,本研究成功構(gòu)建NTHi可持續(xù)感染的COM小鼠模型,Treg細(xì)胞在慢性中耳炎的炎癥平衡維持中具有重要作用,抑制炎癥的進(jìn)展,但過(guò)度的Treg細(xì)胞抑制了宿主對(duì)細(xì)菌的清除作用。