付錦程 付濤

泛素特異性蛋白酶7(ubiquitin-specific protease 7,USP7)是一種廣泛參與DNA修復(fù)、細(xì)胞分裂、細(xì)胞凋亡、基因表達(dá)、蛋白定位、蛋白降解等多種細(xì)胞過程的去泛素化酶[1]。有研究表明,UPS7在調(diào)節(jié)多種信號(hào)通路相關(guān)因子、調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡、協(xié)助建立腫瘤免疫逃逸、參與DNA損傷修復(fù)等促進(jìn)腫瘤發(fā)生,發(fā)展的機(jī)制中發(fā)揮著重要的作用。USP7廣泛的生物學(xué)效應(yīng)使其成為研究腫瘤機(jī)制和進(jìn)展過程的重要分子。本文對(duì)USP7的結(jié)構(gòu)、廣泛的生物學(xué)功能及其在結(jié)直腸癌中的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

一、USP7的結(jié)構(gòu)與功能

USP7能與單純皰疹病毒1型(herpes simplex virus type 1,HSV-1) 編碼的具有泛素連接酶(ubiquitin-ligase enzymes 3,E3)活性的感染性細(xì)胞蛋白(infected cell protein 0,ICP0)結(jié)合,也被稱為皰疹病毒相關(guān)泛素特異性蛋白(herpesvirus-associated ubiquitin-specific protein,HAUSP)[2]。USP7由1 102個(gè)氨基酸組成,具有高度保守的結(jié)構(gòu)域,自氨基末端至羧基末端包括：氨基末端多聚谷氨酰胺(polyglutamine,poly Q)延伸,腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子(tumor necrosis factor receptor-related factor,TRAF)樣結(jié)構(gòu)域,催化結(jié)構(gòu)域(catalytic domain,CD)和羧基末端區(qū)域。

USP7是一種半胱氨酸蛋白酶,具有三個(gè)部分的保守USP7結(jié)構(gòu)域,稱為手指、拇指和手掌[3-4]。USP7結(jié)構(gòu)域的大小從300到800多個(gè)氨基酸不等[3]。輔助結(jié)構(gòu)域,包括泛素相關(guān)結(jié)構(gòu)域(UBA)、泛素相互作用基序(UIM)和鋅指泛素特異性蛋白酶結(jié)構(gòu)域(ZnF-UBP)以及末端擴(kuò)展,被認(rèn)為賦予了USP7的底物特異性[3,5]。由于一些USP7控制細(xì)胞周期進(jìn)程、DNA損傷修復(fù)和與癌癥相關(guān)的細(xì)胞信號(hào),它們在腫瘤發(fā)生中的作用已被研究[3,6-8],關(guān)于其結(jié)構(gòu)和功能也是最近才開始被研究[9]。

二、USP7的功能

1.p53依賴途徑：隨著研究的深入,越來越多的USP7底物被鑒定出來,這些底物中關(guān)于p53的研究最為透徹。正常細(xì)胞中的p53主要通過Murine double minute 2(MDM2)介導(dǎo)的泛素化和隨之而來的降解維持低水平狀態(tài)[10]。p53和MDM2均是USP7的底物,且以互斥的方式特異性地識(shí)別USP7 的TRAF樣結(jié)構(gòu)域,由于MDM2的親和力強(qiáng)于p53,因此,正常細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中MDM2是USP7的首選底物[11-12]。在細(xì)胞應(yīng)激的條件下,MDM2磷酸化降低了其與USP7結(jié)合的親和力,使USP7從穩(wěn)定MDM2轉(zhuǎn)換為穩(wěn)定p53,誘導(dǎo)凋亡途徑激活[13],這個(gè)現(xiàn)象被研究人員稱為“開關(guān)”效應(yīng)。腫瘤抑制因子p53在腫瘤預(yù)防中起著重要作用。在人類腫瘤的發(fā)展過程中,p53經(jīng)常因直接突變或調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)改變而失活。p53是分子網(wǎng)絡(luò)中的一個(gè)中心樞紐,它能感知各種細(xì)胞應(yīng)激,并引發(fā)有效的抗增殖反應(yīng),包括細(xì)胞周期阻滯、凋亡和衰老。此外,p53還參與調(diào)控其他細(xì)胞過程,如代謝、自噬和鐵死亡等[14]。

2.非p53依賴途徑：除了USP7-MDM2-p53軸之外,USP7還通過p53非依賴性的途徑參與細(xì)胞增殖和凋亡調(diào)控,這種效應(yīng)主要源于USP7參與調(diào)節(jié)多種信號(hào)通路相關(guān)因子,改變它們的表達(dá)水平和亞細(xì)胞定位。

USP7可以通過逆轉(zhuǎn)多泛素化,穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)致其靶點(diǎn)表達(dá)增加,如USP7通過TRAF樣結(jié)構(gòu)域和Ubl結(jié)構(gòu)域與NOTCH1胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(Intracellular domain of NOTCH1,ICN1)交互,使其穩(wěn)定并異常激活,導(dǎo)致NOTCH1靶基因的表達(dá)上調(diào),促進(jìn)急性T淋巴細(xì)胞白血病的發(fā)展,而USP7缺失可使NOTCH1的多聚泛素化增強(qiáng),導(dǎo)致其降解[15]。

USP7可以使E3泛素連接酶NEDD4L去泛素化,通過NEDD4L-SMAD軸影響神經(jīng)系統(tǒng)[16]。USP7也可以調(diào)節(jié)TBX3、直接結(jié)合TBX3并減少其泛素化和降解來抑制p57KIP2的表達(dá),促進(jìn)甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞增殖[17]。USP7逆轉(zhuǎn)單泛素化和多泛素化標(biāo)記的能力使其能夠從多方面調(diào)節(jié)信號(hào)通路轉(zhuǎn)錄因子,這種通過逆轉(zhuǎn)多泛素化改變轉(zhuǎn)錄因子的穩(wěn)定性和逆轉(zhuǎn)單泛素化改變轉(zhuǎn)錄因子的亞細(xì)胞定位之間的差異性,將是一個(gè)有待進(jìn)一步研究的課題。

3.促進(jìn)DNA修復(fù)及細(xì)胞分裂分化：USP7對(duì)DNA損傷和耐受有重要作用。當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)DNA雙鏈斷裂(DNA double strand breaks ,DSBs)時(shí),會(huì)出現(xiàn)DNA損傷反應(yīng)(DNA damage response,DDR),這個(gè)過程需要關(guān)鍵調(diào)控因子MRE11-RAD50-NBS1(MRN)復(fù)合物和DDR信號(hào)的核心成分DNA損傷檢查點(diǎn)蛋白調(diào)節(jié)因子1(mediator of DNA damage checkpoint protein 1,MDC1)。MRN識(shí)別DSBs信號(hào)時(shí)導(dǎo)致MDC1與磷酸化組蛋白H2AX結(jié)合,使得泛素E3連接酶RNF168聚集,促進(jìn)多聚泛素鏈在染色質(zhì)上形成,同時(shí)生成染色質(zhì)綁定的p53結(jié)合蛋白1(p53 binding protein 1,p53BP1)和乳腺癌蛋白1(breast cancer protein 1),產(chǎn)生有效的DNA修復(fù)[18-20]。

4.表觀遺傳學(xué)調(diào)控功能：USP7作為翻譯后蛋白穩(wěn)定性調(diào)節(jié)因子的作用被廣泛接受。它可能以通過組蛋白H3K9的甲基轉(zhuǎn)移酶SUV39H1以表觀遺傳學(xué)機(jī)制調(diào)控p53靶蛋白[21]。USP7是控制組蛋白H2A泛素化水平的非典型多梳抑制復(fù)合體1(polycomb repressive complex 1,PRC1)的組分之一[22]。有研究顯示,延伸蛋白BC和多梳抑制復(fù)合物相關(guān)蛋白EPOP能夠通過招募USP7調(diào)控H2B泛素化水平,參與癌癥增殖調(diào)控[23]。這些研究為USP7調(diào)控組蛋白標(biāo)記的結(jié)構(gòu)提供了更清晰的解釋。

E3連接酶泛素樣含PHD和環(huán)指域(ubiquitin-like with PHD and ring finger domain 1,UHRF1)是DNA甲基化機(jī)制的重要組成部分,能夠結(jié)合半甲基化的CpG島并招募維持甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT1,以確保DNA甲基化模式通過復(fù)制傳播[24]。UHRF1、USP7和DNMT1還可以作為泛素E3連接酶-USP7靶復(fù)合物在已知的抑癌基因啟動(dòng)子處形成,通過增加DNA甲基化和組蛋白修飾來抑制它們[25]。提示了USP7表觀遺傳調(diào)控和DNA修復(fù)兩大功能之間存在聯(lián)系。

三、USP7與結(jié)直腸癌

1.USP7在結(jié)直腸癌中的研究進(jìn)展：正如上文所述,USP7具有廣泛且迥異的生物學(xué)功能,使得其在結(jié)直腸癌(CRC)中的表現(xiàn)也呈現(xiàn)出顯著的差異,在CRC中像“雙刃劍”一樣,即USP7既可以促進(jìn)腫瘤生長,又可以抑制腫瘤生長。

Kerstin等[26]的研究顯示,USP7既具有促癌效應(yīng),又具有抑癌效應(yīng)：在無應(yīng)激的癌細(xì)胞中,無論上調(diào)還是下調(diào)USP7均能穩(wěn)定p53,從而導(dǎo)致抑制細(xì)胞生長并誘導(dǎo)凋亡。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也證實(shí),USP7上調(diào)或下調(diào),都使腫瘤的體積和重量下降,腫瘤生長抑制。有研究表明,USP7的上調(diào)所帶來的生長抑制效應(yīng)可能源于其穩(wěn)定了p53,同時(shí)激活p53依賴的凋亡途徑;而USP7下調(diào)所帶來的生長抑制效應(yīng)則較為復(fù)雜,因?yàn)槠湫Ч蕾囉趐53、MDM2和USP7相對(duì)化學(xué)計(jì)量,當(dāng)USP7部分減少時(shí)可使p53失活,而USP7接近完全消失時(shí)則由于MDM2的失穩(wěn)定性而使p53趨于穩(wěn)定?？偠灾?在CRC中,USP7下調(diào)所帶來的p53依賴和p53獨(dú)立同時(shí)存在的生長抑制作用,表現(xiàn)為促增殖蛋白的減少和抗增殖蛋白的增加。

Yang等[27-28]通過實(shí)時(shí)PCR和蛋白質(zhì)印跡分析了25例結(jié)腸癌及癌旁組織中USP7表達(dá),發(fā)現(xiàn)USP7在癌組織中顯著下調(diào),同時(shí)還觀察到癌組織中磷酸化STAT3的表達(dá)升高。隨后在結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116、SW620和SW480中發(fā)現(xiàn),磷酸化STAT3增多時(shí),USP7的表達(dá)水平會(huì)降低,同時(shí)內(nèi)源性p53蛋白水平下降。通過熒光素酶報(bào)告和芯片分析發(fā)現(xiàn)STAT3與USP7啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合導(dǎo)致組蛋白去乙?；?(histone deacetylase 1,HDAC 1)招募抑制USP7活性進(jìn)而使內(nèi)源性p53蛋白水平降低,導(dǎo)致腫瘤生長。Choi等[29]研究發(fā)現(xiàn),FAM188B的mRNA和蛋白水平在結(jié)腸癌細(xì)胞系(HCT116,SW620,HT-29)中均有較高的表達(dá)。FAM188下調(diào)可以通過細(xì)胞周期阻滯或細(xì)胞死亡導(dǎo)致體外細(xì)胞生長抑制,這一過程的機(jī)制是：FAM188B的沉默激活了p53,從而上調(diào)凋亡相關(guān)基因?qū)е录?xì)胞死亡。這種效應(yīng)是通過與USP7相互作用來調(diào)控p53的穩(wěn)定性。FAM188B中存在USP7結(jié)合基序,當(dāng)FAM188B過表達(dá)時(shí),會(huì)使得其結(jié)合的USP7顯著增加,導(dǎo)致泛素化的p53增多,使p53凋亡途徑被抑制;反之,當(dāng)FAM188B表達(dá)下調(diào)時(shí),游離的USP7增多,使得p53上調(diào),激活p53凋亡信號(hào)通路,抑制腫瘤生長?？偠灾?FAM188B的發(fā)現(xiàn)為USP7-MDM2-p53軸增添了新的內(nèi)容。

在促進(jìn)癌癥進(jìn)展的研究中,Novellasdemunt等[30]在APC突變SW480細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn),敲減USP7會(huì)使CRC細(xì)胞的生長受限。隨后將SW480細(xì)胞系導(dǎo)入免疫缺陷模型鼠(SCID mice)中,構(gòu)建異種移植模型,結(jié)果表明,USP7特異性抑制劑P2207對(duì)小鼠腫瘤生長有明顯的抑制作用,分離瘤體顯示出對(duì)Wnt靶基因的抑制,這種效應(yīng)與敲減USP7一致,并且在APC突變的細(xì)胞中更為明顯。該研究顯示了USP7促進(jìn)CRC發(fā)展的機(jī)制：APC突變的CRC細(xì)胞中Wnt活化和轉(zhuǎn)化的閾值-β-catenin抑制結(jié)構(gòu)域(β-catenin inhibitory domain ,CID)缺失,使得β-catenin暴露于USP7下,放大了USP7對(duì)β-catenin去泛素化效應(yīng),導(dǎo)致Wnt信號(hào)的異常激活,促進(jìn)了細(xì)胞增殖和腫瘤進(jìn)展。

有關(guān)USP7抑制劑的研究也進(jìn)一步證實(shí)了USP7所帶來的促癌效應(yīng)。Du等[37]發(fā)現(xiàn),結(jié)腸癌中USP7與DNMT1的豐度相關(guān)(R2=0.84)。USP7敲減的結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)組蛋白去乙?；窰DAC抑制劑更敏感：相較于正常細(xì)胞系,USP7敲減的細(xì)胞中HDAC抑制劑可以誘導(dǎo)5～10倍的細(xì)胞凋亡,增加了凋亡細(xì)胞標(biāo)志物的豐度,包括caspase3,6,9和PARP。An等[31]發(fā)現(xiàn)與正常細(xì)胞相比,USP7在CRC細(xì)胞系HCT116,SW480,Caco-2,SW620 and HT-29中高表達(dá)。減少USP7的表達(dá)可以有效抑制CRC細(xì)胞系HCT116,SW480,Caco-2的增殖,由于三種細(xì)胞系中p53的狀態(tài)差異大,表明這種效應(yīng)是非p53依賴性的。有數(shù)據(jù)分析顯示,CRC病人的總體生存率與USP7水平呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān),低表達(dá)USP7的病人顯示出相對(duì)增加的無復(fù)發(fā)生存的可能性。隨后使用USP7抑制劑P5091處理細(xì)胞,顯著抑制了細(xì)胞生長,增加了細(xì)胞凋亡,這與β-catenin降解有關(guān)。P5091能夠增加β-catenin的泛素化從而加快其降解,顯著降低β-catenin的水平,抑制了Wnt/β-catenin通路的異常激活,誘導(dǎo)了凋亡途徑。隨后的裸鼠異種移植實(shí)驗(yàn)證實(shí),使用P5091治療的裸鼠腫瘤的直徑和重量都明顯降低,并且荷瘤小鼠的體重沒有明顯下降,顯示出較好的耐受性?？偠灾?P5091的處理在體內(nèi)和體外均能通過抑制Wnt/β-catenin通路來抑制CRC的增殖。研究表明,USP7抑制劑在CRC中的顯著作用,進(jìn)一步開發(fā)和完善有助于CRC的靶向治療。

2.USP7在結(jié)直腸癌中的研究方向

正如上文所述,USP7的生物學(xué)功能廣泛,普遍參與細(xì)胞調(diào)節(jié),尤其是調(diào)節(jié)信號(hào)通路相關(guān)因子。已有的研究闡明了USP7如何調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin、JAK/STAT等信號(hào)通路相關(guān)因子以促進(jìn)CRC的進(jìn)展,未來探究其他通路中USP7與CRC的關(guān)系將是一個(gè)方向,例如,目前研究已經(jīng)證實(shí)Hippo通路與CRC的發(fā)展密切相關(guān)[32],而且已有研究人員證實(shí)USP7穩(wěn)定該通路的轉(zhuǎn)錄因子Yki,促進(jìn)肝細(xì)胞癌的發(fā)展[33]。上文提到USP7通過去泛素化可以調(diào)節(jié)NOTCH通路、Hedgehog通路、PI3K/Akt通路的相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子,而這些通路廣泛參與癌癥的發(fā)生和發(fā)展,提示我們研究USP7如何通過這些通路促進(jìn)CRC的進(jìn)展。

另外,關(guān)于非編碼RNA協(xié)同USP7在腫瘤中研究逐漸增多,如上文所示的miR-205與USP7的關(guān)系,最近的研究也顯示在體脂較高的肝細(xì)胞癌病人中,由脂肪細(xì)胞分泌的外泌體中的環(huán)狀RNAs(circular RNAs,circRNAs)上調(diào),通過抑制microRNA-34a(miR-34a),激活USP7,導(dǎo)致一組基因上調(diào),包括細(xì)胞周期蛋白cyclin A2,促進(jìn)腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移[34]。也有研究表明,長鏈非編碼RNA(lncRNA)可以通過USP7蛋白介導(dǎo)Wnt/β-catenin通路促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生[35],這也為USP7在結(jié)直腸癌的研究中提供了新的方向。

四、結(jié)語

USP7具有廣泛的表達(dá)調(diào)節(jié),其主要底物不僅涉及經(jīng)典的腫瘤抑制因子,如p53和PTEN,還涉及各種信號(hào)通路分子,如Yki、Ci/Gil、NOTCH1、β-catenin等,還參與細(xì)胞分裂、細(xì)胞分化、DAN損傷修復(fù)及表觀遺傳學(xué)的調(diào)控,使得USP7具有獨(dú)特的研究價(jià)值。