武上杰,欒園園,王明坤,張賀春,于 波,馬月輝,蔣 琳,何曉紅*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所,北京 100193;2.朝陽(yáng)市朝牧種畜場(chǎng)有限公司,朝陽(yáng) 122629)

布魯氏菌病(以下簡(jiǎn)稱布病)是一種由布魯氏菌(以下簡(jiǎn)稱布菌)感染引起的人畜共患病,具有高度傳染性,在170多個(gè)國(guó)家和地區(qū)流行,每年感染人數(shù)逾50萬(wàn)[1]。根據(jù)布菌對(duì)宿主的偏好性,一般將其分為羊種(B.melitensis)、牛種(B.abortus)、豬種(B.suis)、鼠種(B.neotomae)、犬種(B.canis)和綿羊附睪種(B.ovis)等[2]。其中,B.melitensis(綿羊和山羊均易感)的毒力和感染性最強(qiáng),也是人間布病的最主要病原,在我國(guó)占據(jù)主導(dǎo)地位[3]。此外,B.suis和B.ovis在綿羊群的感染狀況也不容忽視[4]。布病的典型癥狀表現(xiàn)為波浪熱、關(guān)節(jié)炎和繁殖障礙(公畜睪丸炎和附睪炎,母畜流產(chǎn)和不孕)。我國(guó)是綿羊生產(chǎn)大國(guó),存欄量在2022年已達(dá)1.86億只。但近年來(lái),綿羊布病疫情在華北和西北等地呈蔓延趨勢(shì)[5-6],不僅給我國(guó)綿羊養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)損失,還對(duì)公共衛(wèi)生形成重大安全隱患。

布病是自然疫源性傳染病,提高管理水平、接種疫苗和淘汰染疫動(dòng)物是部分發(fā)達(dá)國(guó)家防控和凈化布病的成功模式[3,7],但在我國(guó)仍面臨巨大挑戰(zhàn)[8]。一方面,布菌是兼性胞內(nèi)寄生菌,具有免疫逃避能力,布病臨床表現(xiàn)為隱性感染和慢性經(jīng)過(guò),早期難發(fā)現(xiàn),晚期難控制;另一方面,疫苗作用有限[9],加之我國(guó)羊群基數(shù)龐大,流動(dòng)性強(qiáng),尚未全面形成集約化養(yǎng)殖,疫苗難以完全覆蓋。因此常規(guī)措施難以有效控制布病在我國(guó)的流行態(tài)勢(shì)。從長(zhǎng)遠(yuǎn)來(lái)看,開(kāi)展綿羊抗布病新品種的選育工作,提高宿主動(dòng)物抗病力,能根本上從動(dòng)物源頭切斷布病的傳播途徑,真正落實(shí)“人病獸防,關(guān)口前移”。

1 布菌的致病機(jī)制

布菌是兼性胞內(nèi)寄生菌,能侵入多種細(xì)胞,介導(dǎo)凋亡與自噬進(jìn)程,建立起復(fù)制生態(tài)位以逃避免疫殺傷,營(yíng)造出微環(huán)境來(lái)維持慢性感染[10]。毒力因子的存在對(duì)于布菌生存繁殖的維系以及免疫逃避策略的執(zhí)行不可或缺。如布菌的非典型脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)協(xié)同外膜蛋白(outer membrane proteins,OMPs),不僅可抑制免疫激活,阻止補(bǔ)體沉積,還能限制溶酶體融合[11-13]。同時(shí),布菌缺少諸如外毒素、菌毛、鞭毛和質(zhì)粒等強(qiáng)效致病因子,因此其較弱的免疫原性往往不會(huì)引起宿主機(jī)體強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答[13]。

1.1 感染與侵襲

布菌可經(jīng)呼吸道、消化道、眼結(jié)膜和損傷皮膚感染宿主,侵入吞噬細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞和中性粒細(xì)胞)以及非吞噬細(xì)胞(如上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和滋養(yǎng)層細(xì)胞)[14]。脂筏(lipid raft)存在于質(zhì)膜表面,富含膽固醇和鞘磷脂,是參與細(xì)胞膜內(nèi)外信號(hào)傳導(dǎo)和物質(zhì)傳遞的專門膜微區(qū)[15],能介導(dǎo)巨噬細(xì)胞以內(nèi)吞的方式攝取布菌[16]。布菌的環(huán)β-1,2-葡聚糖(cyclic β-1, 2-glucan,CβG)能擾亂脂筏中的膽固醇組分[17-18]。發(fā)動(dòng)蛋白(dynamin)和網(wǎng)格蛋白(clathrin)共同作用于布菌內(nèi)化過(guò)程中包被囊泡的再分配和重排[19]。發(fā)動(dòng)蛋白具有GTP酶活性,可選擇性地調(diào)節(jié)囊泡的組裝[20];網(wǎng)格蛋白匯聚于脂筏,招募發(fā)動(dòng)蛋白富集,擠壓質(zhì)膜內(nèi)陷形成小窩,進(jìn)而包被囊泡[21]。至此,布菌被質(zhì)膜裹入細(xì)胞內(nèi)部。

1.2 運(yùn)輸與定位

巨噬細(xì)胞既是布菌侵入的主要靶細(xì)胞,又是先天免疫的重要功能細(xì)胞。90%的內(nèi)化布菌在感染前期會(huì)被清除,余下部分則遷移到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處建立起復(fù)制生態(tài)位[22]。布菌內(nèi)化后形成的囊泡結(jié)構(gòu)統(tǒng)稱布氏小體(Brucellacontaining vacuoles,BCVs),是布菌進(jìn)行胞內(nèi)運(yùn)輸與定位的載體。在轉(zhuǎn)運(yùn)初始階段,由BCVs形成的初級(jí)內(nèi)體(early endosome)短暫接觸溶酶體,獲得其表面標(biāo)記分子而成為eBCVs(early BCVs)[23],布菌CβG可阻止eBCVs被溶酶體深度融合[17-18]。同時(shí),這種有限融合產(chǎn)生的酸化環(huán)境提供了激活布菌IV型分泌系統(tǒng)(type IV secretion system,T4SS)的信號(hào)[24],T4SS分泌的效應(yīng)子重定向eBCVs的胞內(nèi)運(yùn)輸途徑,以阻止其與溶酶體過(guò)分接觸而被消化[13,25]。少數(shù)(約10%)逃避降解的布菌脫離內(nèi)體,驅(qū)動(dòng)效應(yīng)子截獲由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)出芽向高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)的囊泡[26]。BCVs與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)融合形成rBCVs(replicative BCVs)區(qū)隔,并帶有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的特異標(biāo)記[22,27]。另外,雙組分調(diào)控系統(tǒng)(two-component regulatory system,TCS)時(shí)刻調(diào)控布菌對(duì)環(huán)境信號(hào)刺激的感知、傳遞和反應(yīng)[28]。BCVs的胞內(nèi)運(yùn)輸與定位伴隨著分子標(biāo)記的更新,內(nèi)體特征的成熟標(biāo)志著復(fù)制生態(tài)位的建立。

1.3 繁殖與擴(kuò)散

在感染后期,rBCVs參與巨噬細(xì)胞的自噬途徑而轉(zhuǎn)化為aBCVs(autophagy BCVs),布菌完成胞內(nèi)循環(huán)后開(kāi)始胞間傳播[29]。巨噬細(xì)胞的裂解焦亡引發(fā)布菌的外流逸散,Hiyoshi等[30]發(fā)現(xiàn)布菌可利用T4SS穿透BCVs膜形成PIT(pore-induced intracellular trap)結(jié)構(gòu),誘使補(bǔ)體沉積其中,產(chǎn)生補(bǔ)體依賴的find-me信號(hào),啟動(dòng)中性粒細(xì)胞對(duì)PIT的胞吞攝取,而留存于PIT中的布菌得以逃避呼吸爆發(fā)。

2 綿羊布病的抗病育種研究進(jìn)展

畜禽抗病育種,簡(jiǎn)言之就是通過(guò)定向選擇或改變特定基因型來(lái)培育具有抗病能力的畜禽新品種,主要分為3個(gè)方向:家系群體選育、基因工程選育和標(biāo)記輔助選育。

2.1 抗病性與遺傳基礎(chǔ)

2.2 家系群體選育

群體選育指從畜禽種群挑選抗病力突出的個(gè)體作為親本建立家系,再通過(guò)對(duì)子代逐代選擇純化目的基因,獲得穩(wěn)定遺傳抗病性狀的新品種。這種傳統(tǒng)的育種方式實(shí)際上是對(duì)基因型的直接選擇,耗時(shí)、費(fèi)力和成本高的缺點(diǎn)突出,因此往往應(yīng)用于世代間隔短、群體規(guī)模大的家禽研究中,如雞抗沙門菌[35]和鴨抗肝炎病毒[36]等,而在綿羊的抗病研究中應(yīng)用較少。

2.3 基因工程選育

基因工程選育指利用鋅指核酸酶(ZFNs)、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(TALENs)和成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列及其相關(guān)蛋白(CRISPR/Cas9)等基因編輯技術(shù)對(duì)畜禽基因組敲除受體基因或轉(zhuǎn)入目的基因[37]。相較于其它基因編輯技術(shù),CRISPR/Cas9因其高效、穩(wěn)定和廉價(jià)的優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)中。

Toll樣受體4(TLR4)能識(shí)別布菌的脂多糖成分,激活炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)。2012年,中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)對(duì)薩?？司d羊受精卵微量注射線性化的pTLR4-3S載體,借助胚胎移植技術(shù),成功構(gòu)建了過(guò)表達(dá)TLR4的轉(zhuǎn)基因綿羊。進(jìn)一步的攻毒試驗(yàn)結(jié)果顯示,IL-6、IL-8和TNF-α的表達(dá)水平提高,炎癥細(xì)胞的凋亡增加,機(jī)體的抗布菌感染能力明顯增強(qiáng)[38]。在此基礎(chǔ)上,該團(tuán)隊(duì)改進(jìn)方法,在綿羊非繁殖季也能通過(guò)微量注射原核胚胎生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因綿羊,并且發(fā)現(xiàn)TLR4的過(guò)表達(dá)對(duì)綿羊的生長(zhǎng)無(wú)不良影響[39]。

褪黑素(melatonin,MT)是由松果體分泌的神經(jīng)類激素,作為一種抗氧化劑,可緩解氧化應(yīng)激和促進(jìn)免疫系統(tǒng)成熟,N-乙?；?5-羥色胺-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(N-acetylserotonin O-methyltransferase,ASMT)是其合成過(guò)程中的關(guān)鍵限速酶[40]。2017年,中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)選用杜泊綿羊作為供受體,利用CRISPR/Cas9、微量注射和胚胎移植技術(shù)成功構(gòu)建出過(guò)表達(dá)ASMT的轉(zhuǎn)基因綿羊[41]。布菌攻毒試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因綿羊均未患病,并且差異表達(dá)基因顯著富集在自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的相關(guān)通路,這表明轉(zhuǎn)基因綿羊抗布病能力強(qiáng)于野生型[42]。

2.4 標(biāo)記輔助選育

標(biāo)記輔助選擇(marker-assisted selection,MAS)指利用育種性狀相關(guān)標(biāo)記代替表型層次的選擇,抗病性狀標(biāo)記輔助選擇可分為免疫遺傳學(xué)標(biāo)記輔助選擇和分子標(biāo)記輔助選擇[43]。其中,分子標(biāo)記輔助選擇指從分子水平利用與目標(biāo)基因緊密連鎖的遺傳標(biāo)記直接選擇基因型,可在遺傳本質(zhì)上選育綿羊抗布病新品種。與家系群體選育相比,標(biāo)記輔助選育可有效縮短世代間隔、增大選擇強(qiáng)度、提高選種準(zhǔn)確性和降低育種成本;與基因工程選育相比,標(biāo)記輔助選育可避免生物安全、倫理道德和動(dòng)物福利等方面的諸多限制。主效基因的挖掘是標(biāo)記輔助選擇的基礎(chǔ)工作,以下從免疫和炎癥反應(yīng)的激活和效應(yīng)兩個(gè)階段介紹布病相關(guān)基因和非編碼RNA(non-coding RNAs,ncRNAs)。另外,如表1和表2所示,大多數(shù)研究選用B.abortusS2308經(jīng)典菌株驗(yàn)證基因功能,不同菌株與宿主之間作用機(jī)制的比較還未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。

表1 參與免疫和炎癥反應(yīng)激活階段的基因或ncRNA

表2 參與免疫和炎癥反應(yīng)效應(yīng)階段的基因或ncRNA

2.4.1 參與免疫和炎癥反應(yīng)激活階段的基因或ncRNA 免疫和炎癥反應(yīng)的激活依賴于模式識(shí)別受體(pattern recognition receptors,PRRs)結(jié)合病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)或損傷相關(guān)分子模式(damage-associated molecular patterns,DAMPs)。能識(shí)別布菌的PRRs主要分為Toll樣受體(toll-like receptors,TLRs)和NOD樣受體(NOD-like receptors,NLRs)。

2.4.1.1 Toll樣受體:TLRs是跨膜蛋白受體,其抗菌作用最早在1996年被發(fā)現(xiàn)于果蠅的真菌感染試驗(yàn)中[44]。迄今為止,在哺乳動(dòng)物中共鑒定到13種TLRs,能監(jiān)測(cè)多種PAMPs組分[45]。其中,TLR2駐留于質(zhì)膜,能識(shí)別布菌的OMP[46];TLR3和TLR7駐留于內(nèi)體膜,能識(shí)別布菌的RNA[47];TLR4駐留于質(zhì)膜,能識(shí)別布菌的LPS[48];TLR9駐留于內(nèi)體膜,能識(shí)別布菌的DNA[49]。除TLR3外,活化的TLRs均可募集髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)。MyD88是一種胞質(zhì)可溶性的接頭蛋白(adaptor),能將TLR信號(hào)向下游的IκB激酶(IKK)復(fù)合物和MAPK激酶激酶(MAP3K)轉(zhuǎn)導(dǎo),促進(jìn)炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子的釋放。若敲除小鼠的MyD88,則在感染布菌時(shí),其巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的TNF-α和IL-12顯著減少[50],TNF-α和IL-12是首要的促炎癥因子。由B.Melitensis分泌的TIR結(jié)構(gòu)域蛋白(TIR domain-containing proteins,Tcps)稱TcpB,TcpB可直接結(jié)合MyD88,阻礙TLR依賴于MyD88介導(dǎo)的NF-κB激活,還能誘導(dǎo)未折疊蛋白反應(yīng)的靶基因表達(dá)[51-52]。

2.4.1.2 NOD樣受體:NLRs家族是定位于胞漿的模式識(shí)別受體,其中,NOD1和NOD2可識(shí)別布菌胞壁的肽聚糖組分,通過(guò)結(jié)合接頭蛋白R(shí)IP2激活I(lǐng)KK復(fù)合物和MAP3K[53]。此外,NOD1和NOD2還是誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的重要介質(zhì):布菌在侵入宿主細(xì)胞后會(huì)通過(guò)T4SS釋放效應(yīng)子VceC,觸發(fā)由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激傳感器IRE1α介導(dǎo)的未折疊蛋白反應(yīng)。其中,IRE1α是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白,可募集TRAF2(TNF-receptor associated factor 2),依賴于NOD1和NOD2激活NF-κB受體[54]。布菌能通過(guò)IRE1α軸抑制宿主細(xì)胞的自噬[55]。NLRs家族的NLRP3受體蛋白在抗布菌感染中同樣發(fā)揮重要作用。一般地,NF-κB信號(hào)的激活促進(jìn)NLRP3的表達(dá),NLRP3與凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(ASC)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1前體(pro-caspase-1)組裝形成的NLRP3炎癥小體,同源活化的caspase-1剪切促炎細(xì)胞因子IL-1β和IL-18的前體,使其成熟并釋放到胞外,增強(qiáng)機(jī)體免疫能力[56]。最近的研究完善了該通路,在布菌感染時(shí),IRE1α可誘導(dǎo)活性氧(ROS)依賴性的NLRP3易位到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體連接處,激活caspase-2和BID之間的信號(hào)軸,導(dǎo)致線粒體的損傷相關(guān)分子模式(DAMP)釋放,刺激NLRP3炎癥小體合成[57]。這一發(fā)現(xiàn)整合了布菌感染過(guò)程中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、線粒體損傷與先天免疫之間的聯(lián)系。另外,黑色素瘤缺乏因子2(absent in melanoma 2,AIM2)是最近發(fā)現(xiàn)的胞內(nèi)PRR,可識(shí)別布菌DNA,由其組裝的AIM2炎癥小體,同樣能增進(jìn)IL-1β和IL-18的產(chǎn)生[56,58]。

2.4.1.3 其他模式識(shí)別受體:除TLRs和NLRs外,在2008年,首次發(fā)現(xiàn)了干擾素基因刺激蛋白(stimulator of interferon genes,STING)參與固有免疫應(yīng)答的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用[59]。STING位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜,不僅能作為PRR行使區(qū)別于TLR9的“布菌DNA識(shí)別作用”,還能充當(dāng)接頭蛋白發(fā)揮二級(jí)受體結(jié)合cGAMP的“布菌DNA傳感作用”,激活I(lǐng)型IFN的產(chǎn)生,調(diào)控促炎細(xì)胞因子通過(guò)NF-κB途徑介導(dǎo)巨噬細(xì)胞的自噬,支持CD8+T細(xì)胞的適應(yīng)性免疫[59-60]。最近,Khan等[61]發(fā)現(xiàn)布菌可在感染早期抑制宿主細(xì)胞編碼STING的Tmem173基因表達(dá),并能誘導(dǎo)靶作用于STING的miR-24產(chǎn)生,增加免疫激活的成本,破壞胞漿監(jiān)測(cè)的機(jī)制。在此基礎(chǔ)上,Oliveira團(tuán)隊(duì)[62-63]的兩項(xiàng)研究接連報(bào)道了STING通過(guò)缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)調(diào)控巨噬細(xì)胞在抗布菌感染中的代謝重編程,驅(qū)動(dòng)其向促炎的M1型或抗炎的M2型極化,并指出該過(guò)程與IRE1α所介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激緊密聯(lián)系。有關(guān)HIF的發(fā)現(xiàn)已獲得2019年的諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng),但其在布病上的研究較少。

只聽(tīng)張小飛大喊一聲：“教練，接好了！”他猛地飛起一腳，只見(jiàn)足球在空中翻轉(zhuǎn)了360度，又向下45度直沖過(guò)來(lái)，最后準(zhǔn)確無(wú)誤地?fù)糁辛艘幻吣昙?jí)同學(xué)的腿，那位同學(xué)疼得嗷嗷直叫，全場(chǎng)隊(duì)員卻笑得人仰馬翻。

2.4.2 參與免疫和炎癥反應(yīng)效應(yīng)階段的基因或ncRNA

2.4.2.1 免疫應(yīng)答:主要組織相容性復(fù)合物(major histocompatibility complex,MHC)主要分為MHC I、MHC II和MHC III。經(jīng)巨噬細(xì)胞處理的布菌肽段可由MHC II遞呈給CD4+T淋巴細(xì)胞中的輔助性T細(xì)胞(helper T cell,TH),促進(jìn)特異性TH的增殖及其淋巴因子(如IFN-γ)的表達(dá),IFN-γ能激活巨噬細(xì)胞的殺菌作用,在抗布菌的細(xì)胞因子中發(fā)揮首要作用;也可由MHC I遞呈給CD8+T淋巴細(xì)胞,使其活化成細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞,殺傷感染布菌的靶細(xì)胞[64]。TH細(xì)胞包含TH1亞型和TH2亞型,它們分別是介導(dǎo)布菌感染前期細(xì)胞免疫和后期體液免疫的優(yōu)勢(shì)亞群[65-66]。而控制TH細(xì)胞分化方向的關(guān)鍵是cMAF。cMAF是促進(jìn)CD4+T細(xì)胞依賴IL-4向TH2亞型分化的特異性轉(zhuǎn)錄因子[67]。在2015年,Ranzani等[68]首次發(fā)現(xiàn)linc-MAF-4可抑制cMAF活性。最近,布病患者的血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果證實(shí),過(guò)表達(dá)的linc-MAF-4調(diào)控CD4+T細(xì)胞在感染早期趨向TH1亞型分化[69]。另外,miR-155最近也被證實(shí)可調(diào)控TH細(xì)胞的發(fā)育分化來(lái)應(yīng)對(duì)布菌感染[70-71]。

2.4.2.2 NF-κB信號(hào)通路:由接頭蛋白MyD88或RIP2激活的IKK復(fù)合物促使NF-κB與抑制因子IκB解聚,暴露出核定位序列,由胞漿轉(zhuǎn)運(yùn)至核內(nèi),啟動(dòng)細(xì)胞因子表達(dá)。若阻斷NF-κB,則顯著抑制腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)的表達(dá)和分泌。同時(shí),TNF-α也是一種具有調(diào)節(jié)作用的促炎細(xì)胞因子,其與受體TNFR-1的結(jié)合能導(dǎo)致IκB泛素化,正反饋于NF-κB途徑,減少抗炎細(xì)胞因子(如IL-10),增加促炎細(xì)胞因子(如活性氧和一氧化氮)[72]。但是,由TNF-α所誘導(dǎo)表達(dá)的一種泛素編輯酶A20,也稱腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白3(tumor necrosis factor alpha-induced protein 3,TNFAIP3),它能抑制NF-κB活化,該基因座的相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)變異能增進(jìn)IL-6和IL-1β產(chǎn)生,在應(yīng)對(duì)布菌感染中發(fā)揮保護(hù)作用[73]。布菌通過(guò)影響巨噬細(xì)胞ncRNA的表達(dá)可抑制炎癥反應(yīng)的進(jìn)行。比如,上調(diào)的Gm28309(競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA)能充當(dāng)分子海綿富集miR-3068-5p,以阻止κB-Ras2蛋白的降解,抑制NF-κB的激活[74];miR-181a-5p和miR-21a-5p依賴于MyD88變化,前者上調(diào),抑制TNF-α表達(dá),后者下調(diào),導(dǎo)致抗菌的鳥(niǎo)苷酸結(jié)合蛋白5(GBP5)減少和抗炎的IL-10增加[75]。

2.4.2.3 MAPK信號(hào)通路:絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號(hào)通路包括MAPK激酶激酶(MAP kinase kinase kinase,MAP3K)、MAPK激酶(MAP kinase kinase,MAP2K)和MAPK。由接頭蛋白MyD88或RIP2激活的MAP3K逐級(jí)激活MAP2K和MAPK,MAPK家族成員包括ERK1/2、JNK和p38。MAPK級(jí)聯(lián)系統(tǒng)調(diào)控免疫和炎癥反應(yīng),或還影響B(tài)CVs的轉(zhuǎn)運(yùn)與定位。早先,在小鼠巨噬細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)布菌LPS通過(guò)限制MAPK信號(hào)通路(p38、ERK1/2和JNK)的激活,抑制TNF-α等細(xì)胞因子的合成[76]。隨后的研究指出,由TLR2誘導(dǎo)的MAPK信號(hào)通路(p38和ERK1/2)激活能抑制由TLR9介導(dǎo)的IL-12產(chǎn)生[77]。布菌在人單核細(xì)胞內(nèi)的維持與復(fù)制反而依賴于由TLR2介導(dǎo)的MAPK信號(hào)通路(p38和JNK)延遲激活[78]。MAPK信號(hào)通路可激活轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-1(activator protein-1,AP-1),有效促進(jìn)炎癥反應(yīng)清除布菌。AP-1是由原癌基因c-Fos和c-Jun所編碼的蛋白二聚體,其中,c-Fos可通過(guò)抑制促炎因子IL-10的產(chǎn)生來(lái)限制布菌的生存,但也會(huì)負(fù)調(diào)控TNF-α、IL-6和IL-10等抗炎因子,并且c-Fos還負(fù)反饋于TLR4[79]。綜上,在響應(yīng)布菌刺激時(shí),NF-κB與MAPK通路之間密切聯(lián)系,信號(hào)串?dāng)_(crosstalk)。

2.4.2.4 其他細(xì)胞因子:在布菌胞內(nèi)寄生的各環(huán)節(jié),某些炎癥因子可作用于囊泡、溶酶體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)來(lái)控制感染。例如:1)溶酶體相關(guān)細(xì)胞器生物發(fā)生復(fù)合物-1亞基1(biogenesis of lysosome-related organelles complex-1 subunit 1,BLOS1)在線粒體和溶酶體的功能行使以及囊泡和內(nèi)體的胞內(nèi)運(yùn)輸中承擔(dān)重要功能[80]。Wells等[81]發(fā)現(xiàn)BLOS1是防御布菌感染的新型免疫因子,而布菌能通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑的IRE1α-RIDD軸定向降解翻譯BLOS1的mRNA。 2)干擾素刺激基因家族(interferon-stimulated genes,ISGs)表達(dá)的干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白(IFITM3)是先天免疫的關(guān)鍵效應(yīng)器[82],可介導(dǎo)溶酶體pH降低,有效抑制布菌等多種胞內(nèi)病原體[83]。經(jīng)布菌刺激的小鼠巨噬細(xì)胞能分泌包含IFITM3的外泌體,廣泛地增強(qiáng)微環(huán)境中未感染細(xì)胞的免疫能力[84]。3)天然抗性相關(guān)巨噬蛋白1(natural resistance associated macrophage protein 1,NRAMP1)通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性消耗布菌[85-86]和分枝桿菌[87]等胞內(nèi)寄生菌繁殖所必需的鐵、鎂等二價(jià)金屬離子而發(fā)揮抗菌作用。

3 綿羊抗布病育種研究存在的問(wèn)題

目前,綿羊抗布病育種工作還處于研究階段,正面臨許多問(wèn)題,如: 1)遺傳機(jī)制復(fù)雜,易受環(huán)境因素影響,目前綿羊抗布病性狀的遺傳力及其與生產(chǎn)性狀的相關(guān)作用有待評(píng)估; 2)篩選指標(biāo)不明確,目前抗布病性狀主要用免疫指標(biāo)表征,如血清抗體滴度,但將其視作閾性狀抑或數(shù)量性狀還有待研究; 3)主效基因稀缺,目前國(guó)內(nèi)外挖掘出的抗布病候選基因均非主效基因,不足以支撐分子標(biāo)記輔助選擇工作的展開(kāi); 4)功能驗(yàn)證困難,布病為二類動(dòng)物疫病,布菌攻毒試驗(yàn)要求在三級(jí)及以上生物安全實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行,增加了候選基因下游驗(yàn)證的難度。

圖1 參與免疫和炎癥反應(yīng)的基因或ncRNA及其通路Fig.1 Genes or ncRNAs involved in immune and inflammatory responses and their pathways

4 展 望

機(jī)器學(xué)習(xí)(mechine learning,ML)是人工智能領(lǐng)域近年新興的分支,適用于數(shù)據(jù)驅(qū)動(dòng)的科學(xué),能有效處理基因組高維數(shù)據(jù)信息,在生物育種研究中展現(xiàn)出巨大潛力,為基因挖掘工作提供了全新視角?；诒O(jiān)督機(jī)器學(xué)習(xí)算法,例如決策樹(shù)(decision tree,DT)、隨機(jī)森林(random forest,RF)、支持向量機(jī)(support vector machines,SVM)和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(neural network,NN)等[90],輸入訓(xùn)練集、驗(yàn)證集和測(cè)試集數(shù)據(jù)的基因型特征與抗布病表型標(biāo)簽,建立結(jié)合年齡、性別和品種等效應(yīng)的“基因多態(tài)性-抗布病性能”預(yù)測(cè)模型,以達(dá)到根據(jù)綿羊基因分型信息預(yù)測(cè)其抗布病能力表型的目的,實(shí)現(xiàn)依據(jù)特征值貢獻(xiàn)比例篩選有效抗布病突變位點(diǎn)的目標(biāo)?？傊?隨著布病研究的深入,布菌的毒力因子作用和免疫逃避機(jī)制日漸明晰,越來(lái)越多的研究者加入抗布病位點(diǎn)基因的挖掘和驗(yàn)證工作中,相信終將培育出兼顧優(yōu)良經(jīng)濟(jì)性狀的抗布病新品種綿羊。