王 鑫,聶 桐,李阿群,馬 雋,2*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,哈爾濱 150030;2.黑龍江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,哈爾濱 150030)

高脂飲食極易誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的產(chǎn)生[1-2],氧化應(yīng)激在許多慢性肝疾病如非酒精性脂肪肝(NAFLD)、病毒性肝炎、肝纖維化和肝硬化的發(fā)生發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用[3-6]。在正常動(dòng)物機(jī)體中,肝組織的氧化和抗氧化系統(tǒng)處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài),當(dāng)機(jī)體遭受各種有害刺激時(shí),肝細(xì)胞內(nèi)自由基產(chǎn)生和抗氧化反應(yīng)之間穩(wěn)態(tài)被打破,導(dǎo)致活性氧(ROS)水平升高,ROS過量會(huì)攻擊肝細(xì)胞蛋白、脂質(zhì)和核酸,導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙從而誘發(fā)細(xì)胞病理變化引起各種疾病[7-9]。

氧化磷酸化(OXPHOS)是一種酶機(jī)器,線粒體通過其內(nèi)膜上的NADH-輔酶Q還原酶(線粒體電子傳遞鏈復(fù)合物Ⅰ)、琥珀酸-輔酶Q還原酶(線粒體電子傳遞鏈復(fù)合物Ⅱ)、細(xì)胞色素C還原酶(線粒體電子傳遞鏈復(fù)合物Ⅲ)、細(xì)胞色素C氧化酶(線粒體電子傳遞鏈復(fù)合物Ⅳ)和ATP合酶(線粒體電子傳遞鏈復(fù)合物Ⅴ)這5個(gè)多聚體酶復(fù)合物構(gòu)成的電子傳遞鏈(ETC)轉(zhuǎn)移氫和電子,消耗氧氣(O2)并產(chǎn)生ATP以供機(jī)體能量代謝[10]。細(xì)胞內(nèi)的ROS主要由ETC產(chǎn)生,在基礎(chǔ)水平上,ROS作為信號(hào)分子調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化等生物學(xué)過程,但當(dāng)ROS超過細(xì)胞可承受范圍時(shí),ROS就會(huì)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激[11]。

橙皮苷(hesperidin,HDN),是一種在柑橘類水果中含量很高的類黃酮[12-13],是天然酚類化合物,具有廣泛的生物活性,如抗炎、抗氧化、抗癌,降低膽固醇水平和血壓,抗肥胖活性[14]。相關(guān)研究表明,HDN可以上調(diào)谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、錳超氧化物歧化酶等抗氧化酶的表達(dá)發(fā)揮抗氧化作用[10,15],但其作用機(jī)制鮮有報(bào)道。

轉(zhuǎn)錄組分析可以提供大量信息,已經(jīng)有許多研究使用轉(zhuǎn)錄組分析來篩選差異表達(dá)的基因以及藥物作用的相關(guān)機(jī)制[16-18]。在畜禽養(yǎng)殖過程中動(dòng)物可能會(huì)由于受到飼料營養(yǎng)水平及環(huán)境條件改變等應(yīng)激因素的刺激,在機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生過量的ROS,誘發(fā)氧化應(yīng)激,從而使動(dòng)物產(chǎn)能下降影響經(jīng)濟(jì)效益。因此,本研究對C57BL/6小鼠進(jìn)行高脂飲食飼喂從而誘導(dǎo)肝氧化應(yīng)激,之后通過轉(zhuǎn)錄組分析探究HDN對肝氧化應(yīng)激影響的作用途徑并進(jìn)行驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

HDN(含量≥ 98%)購自上海源葉生物科技有限公司(B20182);小鼠常規(guī)飼料和高脂飼料購自小黍有泰(北京)生物科技有限公司(D12450B、D12492);羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)購自默克化工技術(shù)(上海)有限公司(C5678);BCA蛋白定量/濃度測定試劑盒購自大連美侖生物技術(shù)有限公司(MA0082-2);總超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、總抗氧化能力(T-AOC)、丙二醛(MDA)試劑盒、ATP含量測試試劑盒購自南京建成生物工程研究所(A001-1-2、A005-1-1、A015-2-1、A003-1-2、A095-1-1);RT cDNA第一鏈合成試劑盒、Real-Time PCR試劑盒(SYBR Green)購自杭州博日科技有限公司(R233-01、BSB33 M1);Cox6a2(1∶1 000,TD10096)、Ndufb8(1∶1 000,T58290)、Ndufb10(1∶1 000,PHQ9642)、Atp6v0d2(1∶1 000,MG502166)購于艾比瑪特生物醫(yī)藥有限公司;血液/細(xì)胞/組織DNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司(DP304)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)動(dòng)物分組及處理 18只體重20～23 g SPF級雄性C57BL/6小鼠購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司,預(yù)飼1周后開始試驗(yàn)。在試驗(yàn)期間所有小鼠處于相同的環(huán)境。小鼠隨機(jī)分成3組(n=6),分別為control組、HFD組、HFD+HDN組。control組小鼠飼喂常規(guī)飼料(脂肪含量10%、碳水化合物含量70%、蛋白質(zhì)含量20%)。HFD組小鼠飼喂高脂飼料(脂肪含量60%、碳水化合物含量20%、蛋白質(zhì)含量20%)。HFD+HDN組在飼喂高脂飼料的同時(shí)每天灌胃給藥HDN 300 mg·kg-1(HDN溶于0.5% CMC-Na中)。

各組在相應(yīng)條件下飼喂16周,試驗(yàn)結(jié)束時(shí)腹腔注射3%戊巴比妥鈉(60 mg·kg-1)麻醉小鼠后進(jìn)行眼球采血,采血完畢后脫頸處死,解剖后取肝組織。血液離心取血清進(jìn)行ALT和AST活性檢測。肝組織液氮速凍后置于-80 ℃冰箱儲(chǔ)存,用于后續(xù)試劑盒檢測、RNA的提取以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)試驗(yàn)。

1.2.2 肝功能和氧化應(yīng)激標(biāo)志物的測定 將血液于4 ℃、3 000 r·min-1離心10 min后取上清,使用全自動(dòng)生化分析儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)檢測ALT和AST活性。

按照試劑盒說明書要求測定小鼠肝組織中MDA、T-SOD、T-AOC和GSH-Px水平。

1.2.3 總RNA提取、轉(zhuǎn)錄組文庫的建立、質(zhì)檢及測序 采用TRIzol法分別提取樣品總RNA,通過Agilent 2100 bioanalyzer,檢測RNA完整性和濃度,將一部分RNA保存用于后續(xù)qRT-PCR試驗(yàn),將另一部分RNA交于北京諾禾致源科技股份有限公司構(gòu)建文庫,基于邊合成邊測序(Sequencing by Synthesis, SBS)的原理進(jìn)行測序從而獲得原始測序數(shù)據(jù)。去除原始測序數(shù)據(jù)中的低質(zhì)量、未知堿基N含量過高以及接頭污染的序列以獲得高質(zhì)量序列數(shù)據(jù)。

1.2.4 差異表達(dá)基因的篩選 將高質(zhì)量序列數(shù)據(jù)與參考基因組序列進(jìn)行比對,使用DESeq 2軟件(1.20.0)進(jìn)行兩個(gè)比較組合之間的差異表達(dá)分析。使用Benjamini和Hochberg的方法來調(diào)整所得P值以控制錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率。以P≤0.05 &|log2(foldchange)|≥1為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行顯著差異表達(dá)基因的篩選。

1.2.5 差異表達(dá)基因的KEGG富集分析 用ClusterProfile軟件對HFD+HDN組與HFD組的差異表達(dá)基因集進(jìn)行KEGG通路富集分析,以P<0.05作為顯著性富集的閾值,篩選出HDN影響最顯著的信號(hào)通路。

1.2.6 qRT-PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組結(jié)果 使用qRT-PCR對轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證,使用RT cDNA第一鏈合成試劑盒和Real-Time PCR試劑盒對細(xì)胞的總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和熒光定量分析。用于定量的引物由生工生物技術(shù)(上海)股份有限公司設(shè)計(jì),以β-actin作為內(nèi)參對照基因。mRNA引物序列見表1。根據(jù)2-△△Ct法計(jì)算mRNA的相對表達(dá)量。

表1 mRNA 引物序列

1.2.7 肝組織蛋白提取及免疫蛋白印跡分析 肝組織稱重后,每50 mg加入1 mL RIPA裂解液,組織研磨儀充分研磨,研磨液置于冰上裂解,4 ℃,12 000 r·min-1離心15 min后取上清液,BCA試劑盒測定蛋白濃度,調(diào)整樣品終濃度,變性煮沸,冷卻后分裝,-80 ℃保存。SDS-聚丙酰胺凝膠電泳分離目的蛋白,將目的蛋白轉(zhuǎn)膜到NC膜上,封閉,一抗孵育,4 ℃過夜,二抗孵育,ECL發(fā)光液顯影,曝光得到相應(yīng)的蛋白條帶。Image J軟件量化蛋白條帶。

1.2.8 mtDNA相對含量測定 將肝組織打碎,形成細(xì)胞懸液,10 000 r·min-1離心1 min后,倒盡上清,加入200 μL緩沖液GA搖蕩。根據(jù)組織線粒體DNA提取試劑盒說明書提取,并計(jì)算DNA的純度和濃度,選取mtDNA的Ctyb為目的基因,核基因28S為內(nèi)參,mRNA引物序列見表1,進(jìn)行qRT-PCR檢測,并計(jì)算各組Ct值,根據(jù)2-△△Ct法計(jì)算mtDNA相對含量。

1.2.9 肝組織ATP含量測定 使用ATP檢測試劑盒檢測肝組織ATP含量,按照說明書操作,稱取肝組織,制成10%的勻漿液,再置于沸水浴中煮10 min,混勻,3 500 r·min-1離心10 min,取上清液進(jìn)行測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用GraphPad Prism 8.0進(jìn)行數(shù)據(jù)差異性分析,數(shù)據(jù)采用單因素分析Tukey檢驗(yàn),均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)”表示,P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié) 果

2.1 HDN改善高脂飼喂誘導(dǎo)的小鼠肝功能及氧化應(yīng)激水平

根據(jù)肝功能檢測結(jié)果顯示,與control組相比,HFD組小鼠血清ALT和AST活性顯著升高(P<0.000 1);與HFD組相比,HFD+HDN組小鼠血清ALT和AST活性顯著降低(P<0.01,圖1A、1B)。根據(jù)氧化應(yīng)激標(biāo)志物的測定結(jié)果顯示,與control組相比,HFD組小鼠肝組織MDA含量顯著升高(P<0.001,圖1C),T-SOD、GSH-Px和T-AOC水平顯著降低(P<0.001,圖1D～1F);與HFD組相比,HFD+HDN組小鼠肝組織MDA含量顯著降低(P<0.01,圖1C),T-SOD、GSH-Px和T-AOC水平顯著升高(P<0.05,圖1D～1F)。這些結(jié)果表明,HDN能夠減輕高脂飼喂誘導(dǎo)的小鼠肝功能障礙和肝氧化應(yīng)激。

2.2 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)質(zhì)量分析

本次轉(zhuǎn)錄組測序3組9個(gè)樣品共獲得58.55 Gb高質(zhì)量序列數(shù)據(jù)用于后續(xù)分析,所有樣本的樣本測序數(shù)據(jù)質(zhì)量匯總?cè)绫?所示,每個(gè)樣本平均產(chǎn)生數(shù)據(jù)約6.51 GB,高質(zhì)量reads數(shù)目占比均在99%以上,Q 20和Q 30平均值分別為97.94%和94.20%,GC含量平均為47.89%,過濾后堿基數(shù)穩(wěn)定,AT堿基與GC堿基數(shù)量基本相同,以上結(jié)果表明測序獲得的數(shù)據(jù)質(zhì)量較高,數(shù)據(jù)可靠,滿足后續(xù)生物信息學(xué)分析的條件。

表2 樣本測序數(shù)據(jù)質(zhì)量匯總

2.3 差異表達(dá)基因分析

根據(jù)差異基因柱狀圖(圖2A)和火山圖(圖2B、C)可以發(fā)現(xiàn),HFD組與control組相比,一共有3 011個(gè)基因的表達(dá)出現(xiàn)顯著變化(P<0.05),其中1 536個(gè)基因呈上調(diào)表達(dá)(P<0.05),1 475個(gè)基因呈下調(diào)表達(dá)(P<0.05);HFD+HDN組與HFD組相比,共有1 294個(gè)基因的表達(dá)出現(xiàn)顯著變化(P<0.05),其中889個(gè)基因呈上調(diào)表達(dá)(P<0.05),405個(gè)基因呈下調(diào)表達(dá)(P<0.05)。

A.差異表達(dá)基因數(shù)量柱狀圖;B.HFD 組vs. control組基因表達(dá)分布的火山圖;C.HFD+HDN組 vs. HFD組基因表達(dá)分布的火山圖A. Histogram of the number of differentially expressed genes; B. Volcano map of HFD group vs. control group gene expression distribution; C. Volcano map of HFD+HDN group vs. HFD group gene expression distribution

A.富集顯著性排名前20的信號(hào)通路;B. OXPHOS途徑差異表達(dá)基因熱圖(紅色表示基因上調(diào),藍(lán)色表示基因的下調(diào))A. The top 20 signalling pathways in terms of enrichment significance; B. Heat map of differentially expressed genes in the oxidative phosphorylation pathway (red indicates up-regulation of genes, blue indicates down-regulation of genes)

2.4 KEGG信號(hào)通路富集分析

對HFD+HDN組與HFD組的差異基因集進(jìn)行KEGG信號(hào)通路富集分析,富集顯著性排名前20的信號(hào)通路如圖3A所示。結(jié)果顯示,OXPHOS途徑最顯著上調(diào)(P<0.000 1)。在OXPHOS途徑顯著上調(diào)或下調(diào)的基因中(圖3B),復(fù)合物I中有21個(gè)基因顯著上調(diào)(mt-Nd41、Gm28438、Ndufv3、Ndufb7、Ndufa5,Ndufb10、Ndufa11、Gm10222、Ndufs5、Ndufa12、Ndufa6、Ndufb8、mt-Nd1、Ndufb4c、Ndufc2、Ndufb3、mt-Nd5、BC002163、Ndufb6、Ndufa13、Ndufa1,P<0.05);復(fù)合物III中有4個(gè)基因顯著上調(diào)(mt-Cytb、Uqcrq、Uqcrb、Uqcr10,P<0.05);復(fù)合物IV中8個(gè)基因顯著上調(diào)(Cox6a2、Cox8b、Gm11273、Cox6b1、Cox7a1、Gm28437、mt-Co1、Cox4i1,P<0.05),1個(gè)基因顯著下調(diào)(Cox6c2,P<0.05);復(fù)合物V中5個(gè)基因顯著上調(diào)(Gm10231、mt-Atp8、Atp5g2、Atp5o、Atp5e,P<0.05);1個(gè)基因顯著下調(diào)(Atp6v0d2,P<0.05)。

2.5 qRT-PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組結(jié)果

通過qRT-PCR進(jìn)一步證實(shí)轉(zhuǎn)錄組分析觀察到的基因表達(dá)的變化,使用與上述轉(zhuǎn)錄組測序中相同的小鼠肝組織樣品。使用qRT-PCR對轉(zhuǎn)錄組結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。從OXPHOS途徑中選取10個(gè)具有顯著差異的基因,進(jìn)行mRNA水平分析。由圖4可知,HFD組與control組相比,Cox8b、Cox6a2、Gm10231、mt-Atp8、mt-Nd4 l、Gm11237、Ndufb8、Ndufb10的mRNA相對表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.05),Atp6v0d2、Cox6c2的mRNA的相對表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.05);HFD+HDN組與HFD組相比,Cox8b、Cox6a2、Gm10231、mt-Atp8、mt-Nd4 l、Gm11237、Ndufb8、Ndufb10的mRNA相對表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.05),Atp6v0d2、Cox6c2的mRNA的相對表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.05)。qRT-PCR分析表明,基因表達(dá)量與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果在表達(dá)差異的方向和程度方面一致,驗(yàn)證了轉(zhuǎn)錄組分析的可靠性。

圖4 RT-PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組結(jié)果Fig.4 RT-PCR validation of transcriptome results

2.6 免疫蛋白印跡驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組結(jié)果

通過免疫蛋白印跡證實(shí)轉(zhuǎn)錄組結(jié)果。由圖5可知,HFD組與control組相比,Cox6a2、Ndufb8、Ndufb10蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.01),Atp6v0d2d蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.000 1);HFD+HDN組與HFD組相比,Cox6a2、Ndufb8、Ndufb10蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.05),Atp6v0d2d蛋白表達(dá)量表達(dá)量顯著降低(P<0.001)。蛋白表達(dá)量與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果在表達(dá)差異的方向和程度方面一致,進(jìn)一步驗(yàn)證了轉(zhuǎn)錄組分析的可靠性。

A. Cox6a2、Ndufb8、Ndufb10、Atp6v0d2蛋白免疫印跡條帶;B. Cox6a2蛋白相對表達(dá)量;C. Ndufb8蛋白相對表達(dá)量;D. Ndufb10蛋白相對表達(dá)量;E. Atp6v0d2蛋白相對表達(dá)量A. Immunoblot of Cox6a2,Ndufb8,Ndufb10,Atp6v0d2; B. The protein expression of Cox6a2; C. The protein expression of Cox6a2; D. The protein expression of Ndufb8; E. The protein expression of Ndufb10; F. The protein expression of Atp6v0d2

2.7 線粒體數(shù)量變化

由圖6可知,通過蛋白免疫印跡檢測發(fā)現(xiàn),HFD組與control組相比,線體體外膜蛋白TOMM20表達(dá)量明顯降低(P<0.000 1),HFD+HDN組與HFD組相比,TOMM20蛋白表達(dá)量明顯升高(P<0.05);通過qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn),HFD組與control組相比,mtDNA 相對含量顯著降低(P<0.001);HFD+HDN組與HFD組相比,mtDNA相對含量顯著升高(P<0.05)。

A.TOMM20蛋白免疫印跡條帶;B.TOMM20蛋白相對表達(dá)量;C.mtDNA相對含量A.Immunoblot of TOMM20;B.The protein expression of TOMM20;C.Folf chenges of mtDNA

2.8 肝組織ATP含量變化

由圖7可知,HFD組與control組相比,ATP含量顯著降低(P<0.01),HFD+HDN組與HFD組相比,ATP含量顯著升高(P<0.05)。

圖7 肝組織ATP含量Fig.7 ATP content of liver

3 討 論

已有證據(jù)表明,高脂飲食會(huì)導(dǎo)致ROS水平增加,從而誘導(dǎo)氧化應(yīng)激[19]。抑制肝氧化應(yīng)激是慢性肝疾病預(yù)防和治療的關(guān)鍵[20-22]。因此,增強(qiáng)機(jī)體抗氧化防衛(wèi)系統(tǒng)來保護(hù)細(xì)胞免受自由基侵害,緩解肝氧化應(yīng)激是治療和預(yù)防慢性肝疾病的重要途徑。本研究基于轉(zhuǎn)錄組學(xué),探究HDN對肝氧化應(yīng)激影響的作用途徑并進(jìn)行驗(yàn)證。

很多研究已經(jīng)表明,各種天然黃酮類化合物,如黃芩甙、漢黃芩素、楊梅素和白楊素可以通過提高抗氧化蛋白的表達(dá)和活性來改善肝氧化應(yīng)激[23-27]。機(jī)體通過抗氧化系統(tǒng)(酶促和非酶促系統(tǒng))來保護(hù)動(dòng)物機(jī)體免受ROS的影響。酶系統(tǒng)包括SOD和GSH-Px等;非酶系統(tǒng)涵蓋了廣泛的分子,如谷胱甘肽(GSH),硫氧還蛋白、尿酸、維生素E等。這些非酶分子的總濃度稱為T-AOC[28]。SOD作為對抗氧化應(yīng)激的第一道防線,將超氧陰離子自由基轉(zhuǎn)化為過氧化氫(H2O2)和O2。GSH-Px通過消耗GSH清除過量的H2O2。當(dāng)自由基產(chǎn)生和抗氧化反應(yīng)之間的平衡被打破時(shí),自由基過度產(chǎn)生,就會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化從而改變細(xì)胞膜完整性,引起組織損傷。MDA作為脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物,其含量反映氧化應(yīng)激受損程度[29]。本研究顯示,HDN能顯著降低高脂飲食誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激模型小鼠血清中ALT和AST酶活性,改善肝功能,肝MDA含量顯著減少,抗氧化系統(tǒng)酶活性顯著升高(GSH-Px和T-SOD),T-AOC顯著升高,這與先前的研究一致[30],表明HDN可有效減輕高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠的肝功能障礙和肝氧化應(yīng)激。

線粒體調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝,是ROS的重要來源,在線粒體OXPHOS過程中,O2作為ETC的終端電子受體,在參與OXPHOS反應(yīng)生成ATP以維持機(jī)體能量代謝的同時(shí),還會(huì)有部分O2被還原,形成ROS[23]。ROS過量會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙從而誘發(fā)細(xì)胞病理變化引起各種疾病。肝作為體內(nèi)代謝的核心器官,有著豐富的線粒體,由于其代謝活性,使其對氧化應(yīng)激特別敏感。先前有研究表明,與未患NAFLD的小鼠相比,患有NAFLD小鼠OXPHOS復(fù)合物活性均有所降低,ETC功能受損,ATP生成減少,ROS形成增加[31]。本研究使用轉(zhuǎn)錄組學(xué)中KEGG信號(hào)通路富集分析方法探索HDN減輕肝氧化應(yīng)激的作用機(jī)制。結(jié)果顯示,HFD+HDN組和HFD組之間存在著大量差異表達(dá)的基因。線粒體OXPHOS通路是HDN干預(yù)后最顯著上調(diào)的信號(hào)通路,該通路是一條重要的能量代謝通路,參與OXPHOS的體系主要以復(fù)合物(I-V)形式分布于線粒體的內(nèi)膜上,構(gòu)成ETC,而ETC驅(qū)動(dòng)ATP的產(chǎn)生。因此,OXPHOS通路所涉及的相關(guān)基因也也主要與這些復(fù)合物相關(guān)。本研究結(jié)果顯示,HFD組control組相比,復(fù)合物I中有21個(gè)基因顯著下調(diào);復(fù)合物III中有4個(gè)基因顯著下調(diào);復(fù)合物IV中8個(gè)基因顯著下調(diào),1個(gè)基因顯著上調(diào);復(fù)合物V中5個(gè)基因顯著下調(diào);1個(gè)基因顯著上調(diào)。HDN干預(yù)后,與HFD組相比,這些基因上調(diào)、下調(diào)的程度明顯改善。之后從OXPHOS途徑差異表達(dá)基因的結(jié)果中,隨機(jī)選取10個(gè)關(guān)鍵基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證,隨機(jī)選取4個(gè)關(guān)鍵基因?qū)?yīng)編碼的蛋白進(jìn)行蛋白免疫印跡分析,結(jié)果均與轉(zhuǎn)錄組學(xué)結(jié)果一致,表明分析結(jié)果準(zhǔn)確可信。

線粒體是除細(xì)胞核外唯一具有自身遺傳信息的細(xì)胞器。線粒體基因組為小型環(huán)狀DNA,每個(gè)線粒體中含有多個(gè)拷貝的大約16.6 kb的環(huán)狀mtDNA,平均每個(gè)線粒體含有大約2～10個(gè)拷貝數(shù)的mtDNA,因此mtDNA的拷貝數(shù)與線粒體數(shù)量呈正比[32]。ETC驅(qū)動(dòng)ATP的產(chǎn)生,然后用作幾乎所有細(xì)胞過程中的主要能量載體[33],線粒體數(shù)量減少、ETC損傷會(huì)使線粒體合成ATP的功能發(fā)生障礙,OXPHOS功能受損,在本研究中,經(jīng)HDN干預(yù)后,TOMM20蛋白表達(dá)量顯著升高,mtDNA相對含量顯著升高(P<0.05),肝中ATP含量顯著升高,以上結(jié)果說表明與HFD組相比,HDN干預(yù)后使高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠線粒體數(shù)量增多,OXPHOS水平升高。

綜上所述,本研究表明,HDN通過改變線粒體呼吸鏈復(fù)合物上相關(guān)基因的表達(dá),調(diào)節(jié)線粒體OXPHOS途徑,從而減輕了高脂飼喂誘導(dǎo)的小鼠的肝氧化應(yīng)激。

4 結(jié) 論

HDN通過調(diào)節(jié)線粒體OXPHOS途徑,減輕高脂飼喂誘導(dǎo)的小鼠的氧化應(yīng)激。