譚 寧,李巴侖,韓 苗,李琛琛,景遠(yuǎn)翔,寇 正,李 娜,彭 莎,趙獻(xiàn)軍,2,華進(jìn)聯(lián)*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 陜西省干細(xì)胞工程技術(shù)研究中心,楊凌 712100;2.百歐派(天津)生物技術(shù)有限公司,天津 300350)

糖尿病(diabetes mellitus,DM)是一種由于遺傳、生活方式及外界刺激等多種因素導(dǎo)致胰島β細(xì)胞受損無(wú)法正常產(chǎn)生胰島素,或者靶組織細(xì)胞對(duì)胰島素敏感性降低而引發(fā)系列代謝紊亂的綜合征,通常表現(xiàn)為機(jī)體血糖水平升高且無(wú)法自行恢復(fù)[1]。隨著人們物質(zhì)和精神需求的日益增長(zhǎng),犬、貓等伴侶動(dòng)物已經(jīng)成為許多家庭的重要“成員”,且因?yàn)槿?、貓等的生存環(huán)境、飼養(yǎng)方式及生活模式也頗為“擬人化”,完全按照人類(lèi)慣用的模式進(jìn)行,所以犬、貓等伴侶動(dòng)物中糖尿病的患病率、發(fā)病率及死亡率也在逐年增加。作為一種臨床常見(jiàn)、容易誘導(dǎo)并發(fā)癥的內(nèi)分泌代謝類(lèi)疾病,犬糖尿病的常用治療方式與人類(lèi)相似,多為胰島素注射搭配降糖藥物口服,但是存在操作難度大、無(wú)法給予有效反饋、治療效果無(wú)法穩(wěn)定維持、降糖藥物存在一定毒性等問(wèn)題,無(wú)法對(duì)犬類(lèi)糖尿病起到很好的控制或者從根本上治療等作用。所以尋找一種安全、方便且高效的治療方式可謂是迫在眉睫。

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是一類(lèi)組織來(lái)源十分廣泛的成體干細(xì)胞,具有干細(xì)胞的所有共性,即自我更新和多向分化能力,且增殖能力強(qiáng)、免疫原性小,極具臨床應(yīng)用價(jià)值。在臨床中,MSCs在血液系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng),內(nèi)分泌代謝系統(tǒng)等多方面的疾病治療中發(fā)揮極大的潛力[2-4]。對(duì)于糖尿病及其相關(guān)疾病,MSCs能夠通過(guò)多種途徑起到良好的治療作用,其途徑主要包括:緩解胰島素抵抗[5-7]、促進(jìn)胰島再生[8-11]、減輕炎癥[12-14]、分泌營(yíng)養(yǎng)因子[15-17]、減少細(xì)胞凋亡[18-20]。但是MSCs仍存在體外培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)易衰老、移植到體內(nèi)后作用時(shí)間短等問(wèn)題,所以探索一種能夠提高ADMSCs治療效果的新方法十分必要。

米托蒽醌甲磺酸鹽(mitoquinone mesylate,MitoQ)是由劍橋大學(xué)和奧塔哥大學(xué)的科學(xué)家于2000年最先發(fā)現(xiàn)的一種泛醌衍生物,其由三苯基磷陽(yáng)離子(triarylphosphines,TPP+)與輔酶Q 10(CoQ 10)的苯醌部分通過(guò)1個(gè)十碳脂肪鏈共價(jià)結(jié)合構(gòu)成[21-22]。MitoQ的分子式是C37H46O4PBr,其分子量為665.65[23]。CoQ 10作為一種內(nèi)源性合成的脂溶性抗氧化劑,是組成呼吸鏈的必需成分,在線粒體內(nèi)參與機(jī)體所有細(xì)胞產(chǎn)生能量的過(guò)程,保護(hù)細(xì)胞免受自由基的氧化損傷[24]。MitoQ作為一種強(qiáng)大的抗氧化劑,在前期研究中已被證明能夠有效減輕氧化應(yīng)激,應(yīng)用潛力大,能夠?qū)?xì)胞損傷、組織損傷及各類(lèi)疾病起到很好的治療和恢復(fù)作用[25-30]。然而其研究尚缺乏一些關(guān)鍵的體內(nèi)模型試驗(yàn)以及特異性的關(guān)鍵作用通路,針對(duì)MitoQ進(jìn)行進(jìn)一步探索,可以為由于氧化應(yīng)激和線粒體功能障礙而導(dǎo)致的各類(lèi)疾病治療提供科學(xué)依據(jù),同時(shí),為各種重大疾病提供有效的防控措施?？傊?MitoQ的相關(guān)研究已經(jīng)證明了它的強(qiáng)大應(yīng)用前景,將MitoQ與間充質(zhì)干細(xì)胞相結(jié)合,可能極大促進(jìn)臨床中的應(yīng)用,為疾病治療提供新對(duì)策和新方案。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞復(fù)蘇傳代

取出ADMSCs,置于15 mL離心管中,1 500 r·min-1離心5 min,棄上清,加入新鮮配置的α-MEM+培養(yǎng)液,移入培養(yǎng)皿,“十”字法混勻,置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

鏡下觀察,待細(xì)胞貼壁培養(yǎng)增殖至80%時(shí),加入胰蛋白酶,37 ℃恒溫培養(yǎng)箱靜置5 min,待ADMSCs形狀變圓且飄起時(shí),終止消化,1 500 r·min-1離心3 min,觀察到細(xì)胞團(tuán)塊后,棄上清,按照所需接種比例轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)皿中,并按照不同培養(yǎng)皿的規(guī)格添加不同劑量的培養(yǎng)液,繼續(xù)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。

本試驗(yàn)中,MitoQ-ADMSCs為P3代ADMSCs,經(jīng)正常復(fù)蘇后,待培養(yǎng)至80%時(shí),按照1∶6比例傳代至新的培養(yǎng)基中,并使用含MitoQ的α-MEM+培養(yǎng)基進(jìn)行后續(xù)培養(yǎng),MitoQ在培養(yǎng)基中的濃度為1 μmol·L-1。

1.2 姬姆薩(Giemsa)染色

去除培養(yǎng)液,使用PBS清洗2次;加入新鮮的甲醇固定5 min;取Giemsa原液與PBS按照1∶9比例進(jìn)行充分混合,作為工作液備用,待固定后,棄甲醇,加入Giemsa工作液,染色20 min;使用PBS清洗,鏡下觀察拍照,正常可見(jiàn)細(xì)胞核被染成紫紅色或藍(lán)紫色,細(xì)胞質(zhì)則被染成淺紅色。

1.3 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線繪制

取正常培養(yǎng)的ADMSCs和MitoQ-ADMSCs,使用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化,后取細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù),將ADMSCs和MitoQ-ADMSCs以每孔5×103個(gè)的密度接種于24孔板進(jìn)行培養(yǎng),每24 h隨機(jī)抽取2孔細(xì)胞進(jìn)行消化、離心、重懸、計(jì)數(shù),每孔重復(fù)2次,連續(xù)7 d。細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果以培養(yǎng)時(shí)間為橫軸,細(xì)胞數(shù)為縱軸,描繪后連成曲線即為兩種細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。

1.4 乙基脫氧尿苷(EdU)染色

取正常培養(yǎng)的ADMSCs和MitoQ-ADMSCs,吸取1×105個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中;EdU溶液稀釋后,進(jìn)行染色,孵育2 h,PBS清洗;細(xì)胞固定液孵育30 min,清洗后加入2 mg·mL-1甘氨酸,孵育5 min,PBS清洗;加入Apollo染色液,避光孵育30 min,棄液;加入滲透劑清洗,棄液;按照100∶1的比例稀釋Hoechst 33342避光孵育1 h,PBS清洗;觀察、拍照、數(shù)據(jù)分析。

1.5 細(xì)胞遷移試驗(yàn)

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的ADMSCs和MitoQ-ADMSCs,接種于6孔板中培養(yǎng)至正常生長(zhǎng)狀態(tài);觀察細(xì)胞增殖至90%左右時(shí),進(jìn)行劃痕制作確保劃到底壁,PBS洗滌,確保劃痕區(qū)域無(wú)殘留;繼續(xù)培養(yǎng),分別在12和24 h進(jìn)行顯微鏡下拍照記錄。

1.6 細(xì)胞總RNA提取、cDNA合成及real-time PCR

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的ADMSCs和MitoQ-ADMSCs,用Trozol法進(jìn)行細(xì)胞RNA的提取。吸棄細(xì)胞中的α-MEM+培養(yǎng)基,加入1 mL Trizol后立刻進(jìn)行混勻;吸取200 μL三氯甲烷充分混合,靜置5 min,4 ℃、12 000 r·min-1離心15 min,吸取無(wú)色上清;加入異丙醇,上下翻轉(zhuǎn)后靜置10 min,4 ℃、12 000 r·min-1離心10 min,吸棄上層液體,保留下層沉淀;加入75%乙醇,4 ℃、7 500 r·min-1離心5 min,去除殘存液體;RNA干燥后,加入DEPC水,進(jìn)行濃度檢測(cè),測(cè)定結(jié)果濃度偏高且無(wú)RNA降解時(shí)置于-80 ℃冰箱保存;按照cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒得到cDNA,-20 ℃冰箱中保存。qRT-PCR體系按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行配制,相關(guān)引物見(jiàn)表1。

表1 qRT-PCR引物

1.7 活性氧(ROS)檢測(cè)

根據(jù)試劑說(shuō)明書(shū),稀釋活性氧熒光探針(2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate, DCFH-DA),并加入到培養(yǎng)基中,細(xì)胞濃度為1×106·mL-1,37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min。每隔3～5 min吹打混勻1次。洗滌3次后,熒光顯微鏡下觀察、拍照。

1.8 動(dòng)物試驗(yàn)及處理

選用48只8周齡雄性昆明(KM)小鼠及12只中華田園犬。經(jīng)1周適應(yīng)性飼喂后,對(duì)所有小鼠及犬進(jìn)行隨機(jī)分組:1)正常對(duì)照組(NC組);2)糖尿病模型組(Diabetes組);3)ADMSCs單獨(dú)治療組(ADMSCs組);4)MitoQ-ADMSCs聯(lián)合治療組(MitoQ-ADMSCs組)。每組12只小鼠或3只犬。NC組全程使用普通飼料飼喂,其他三組均改用高糖高脂飼料進(jìn)行為期3周的飼喂,后對(duì)其進(jìn)行為期16 h的禁食,并注射鏈脲佐菌素(streptozotin,STZ),其中小鼠腹腔注射劑量為40 mg·kg-1,1次·周-1,連續(xù)3周;犬皮下注射劑量為20 mg·kg-1,1次·d-1,連續(xù)3 d。注射1周后,對(duì)動(dòng)物血糖水平進(jìn)行為期3 d的連續(xù)監(jiān)測(cè),3次空腹血糖測(cè)量值均高于7.6 mmol·L-1,隨機(jī)血糖測(cè)量值高于11.1 mmol·L-1,視為糖尿病動(dòng)物模型成功建立,若未成功建立,重復(fù)STZ注射,直至成功建立。后進(jìn)行細(xì)胞移植治療,ADMSCs及MitoQ-ADMSCs聯(lián)合治療組(MitoQ處理ADSMCs劑量為1 μmol·L-1)注射劑量:小鼠尾靜脈注射2×106個(gè),犬前肢靜脈注射1×107個(gè)。NC組和Diabetes組則注射同等劑量的PBS,連續(xù)治療3周。詳見(jiàn)表2。在此過(guò)程中,持續(xù)監(jiān)測(cè)動(dòng)物模型精神狀態(tài)、體重、采食量、飲水量、血糖水平、葡萄糖耐量等變化。治療結(jié)束1周后,禁食16 h,使用鹽酸賽拉嗪注射液對(duì)犬進(jìn)行肌肉注射麻醉、采血、靜推氯化鉀注射處死、采集樣本。

表2 動(dòng)物試驗(yàn)

1.9 血糖監(jiān)測(cè)

在動(dòng)物糖尿病模型的制作過(guò)程及細(xì)胞移植治療期間,使用血糖儀對(duì)血糖水平進(jìn)行監(jiān)測(cè)。

葡萄糖耐量(OGTT)試驗(yàn)可以正確反映動(dòng)物對(duì)血糖的調(diào)節(jié)能力,經(jīng)12 h禁食,在葡萄糖水溶液灌注前進(jìn)行空腹血糖檢測(cè),記為0 h血糖水平,之后對(duì)小鼠進(jìn)行葡萄糖水溶液的灌胃,對(duì)犬進(jìn)行誘導(dǎo)使其主動(dòng)喝下,在2 h內(nèi)進(jìn)行4次檢測(cè),繪制OGTT曲線。

1.10 體重監(jiān)測(cè)

在動(dòng)物糖尿病模型的制作過(guò)程及細(xì)胞移植治療期間,對(duì)小鼠和犬的體重進(jìn)行持續(xù)監(jiān)測(cè),小鼠使用高精準(zhǔn)度克重量器,犬使用小型臺(tái)稱(chēng),由人保定進(jìn)行稱(chēng)量。

1.11 采血與血清分離

小鼠摘除眼球采血;犬后心采血,收集血清備用。

1.12 肝和脂質(zhì)代謝及氧化應(yīng)激指標(biāo)測(cè)定

按照南京建成公司生化檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明書(shū)步驟,分別測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品及血清樣品在試劑盒對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)下的吸光度OD值,首先按照標(biāo)準(zhǔn)品的結(jié)果制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,后將樣品的OD值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計(jì)算,從而計(jì)算樣品的實(shí)際濃度。血清肝代謝指標(biāo)測(cè)定包括天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT);脂質(zhì)代謝指標(biāo)包括總膽固醇(TC)和甘油三酯(TG);胰腺組織氧化應(yīng)激指標(biāo)包括過(guò)氧化氫(H2O2)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、過(guò)氧化氫酶(CAT)。

1.13 組織樣采集、石蠟切片制備與HE染色

所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在試驗(yàn)結(jié)束1 周后處死,小鼠使用頸部脫臼方式,犬通過(guò)靜脈注射氯化鉀方式安樂(lè)死,采集胰腺、肝、腎、腹部皮下脂肪組織,置于4%多聚甲醛溶液(4% PFA)中固定,留存?zhèn)溆?。固定好的組織塊標(biāo)記,送至西安依科生物技術(shù)有限公司包埋,切成5 μm厚度的組織切片。

進(jìn)行常規(guī)HE組織染色。

1.14 免疫熒光染色

通風(fēng)櫥內(nèi),石蠟切片常規(guī)脫蠟至水;微波爐中使用pH 9.0的抗原修復(fù)液修復(fù);1%牛血清白蛋白(1% BSA)室溫孵育2 h;胰島素抗體,按照1∶100比例用1% BSA進(jìn)行稀釋4 ℃孵育過(guò)夜,PBS清洗;熒光二抗37 ℃避光孵育1 h,PBS洗滌(5 min×3次);Hoechst33342適量處理,熒光顯微鏡下觀察、拍照。

1.15 免疫組化染色

通風(fēng)櫥內(nèi),石蠟切片常規(guī)脫蠟至水;微波爐中使用pH 9.0的抗原修復(fù)液修復(fù);內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷劑處理;滴加適量一抗,放置于37 ℃恒溫條件下孵育1 h,PBS洗滌(5 min×3次);滴加增強(qiáng)酶標(biāo)羊抗小鼠/兔lgG聚合物于組織表面,室溫條件下孵育;PBS洗滌(5 min×3次);新鮮配制DAB顯色液孵育5～10 min;蘇木素染色液,分化2 min、沖洗返藍(lán);二甲苯Ⅱ和二甲苯Ⅰ分別浸泡2 min;風(fēng)干,中性樹(shù)脂封片,拍照。

1.16 過(guò)碘酸雪夫(PAS)染色

通風(fēng)櫥內(nèi),石蠟切片常規(guī)脫蠟至水;將過(guò)碘酸溶液平衡至室溫,吸取過(guò)碘酸溶液滴加于組織上,避光反應(yīng)8 min,轉(zhuǎn)移至蒸餾水中洗滌10 min;擦拭掉多余的液體,吸取Schiff試劑滴加在組織上,置于37 ℃黑暗環(huán)境中1 h,去除染色液,浸泡于蒸餾水中并置于搖床洗滌5 min;取出切片,滴加100 μL蘇木素染色液,待顏色發(fā)生變化時(shí)用自來(lái)水進(jìn)行沖洗;將切片按照與水化階段完全相反的順序進(jìn)行浸泡,每個(gè)濃度3 min后,在二甲苯Ⅱ和二甲苯Ⅰ分別浸泡2 min;風(fēng)干,中性樹(shù)脂封片,拍照。

1.17 馬松(Masson)染色

石蠟切片常規(guī)脫蠟至水;Weigert氏鐵蘇木素染5 min,自來(lái)水沖洗;1%鹽酸酒精分化;麗春紅酸性復(fù)紅染色液 8 min;0.2%冰醋酸溶液2 min,甩干重復(fù)3次;適量的磷鉬酸水溶液2 min;冰醋酸水溶液處理,觀察切片;將切片按照與水化階段完全相反的順序進(jìn)行浸泡,每個(gè)濃度3 min,二甲苯Ⅱ和二甲苯Ⅰ分別浸泡2 min;風(fēng)干切片,中性樹(shù)脂封片,拍照。

1.18 代謝組學(xué)檢測(cè)

收集犬NC組、Diabetes組、ADMSCs組和MitoQ-ADMSCs組血清,送至上海中科新生命生物科技有限公司進(jìn)行代謝組學(xué)檢測(cè),數(shù)據(jù)分析使用XCMS軟件。

1.19 數(shù)據(jù)處理

選用GraphPad Prism 9軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理、分析,顯著性差異分析選用T檢驗(yàn),各數(shù)據(jù)結(jié)果均為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”,差異顯著性表示:*.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001,ns表示無(wú)顯著差異。

2 結(jié) 果

2.1 MitoQ-ADMSCs和ADMSCs形態(tài)、生長(zhǎng)、增殖及遷移能力差異

與同時(shí)復(fù)蘇的ADMSCs相比,MitoQ-ADMSCs形態(tài)未發(fā)生明顯變化,均為立體的梭狀結(jié)構(gòu),且細(xì)胞邊緣清晰可見(jiàn)(圖1a);對(duì)ADMSCs和MitoQ-ADMSCs進(jìn)行為期7 d的細(xì)胞計(jì)數(shù),結(jié)果顯示,MitoQ-ADMSCs的生長(zhǎng)速度顯著優(yōu)于ADMSCs,MitoQ-ADMSCs的群體倍增時(shí)間短于ADMSCs,且兩種細(xì)胞增長(zhǎng)速度的差異在第3～5天最為明顯(圖1b);通過(guò)EdU細(xì)胞增殖試驗(yàn)觀察到MitoQ-ADMSCs的增殖速率遠(yuǎn)高于ADMSCs,可以看到同面積內(nèi)MitoQ-ADMSCs處于增殖階段的細(xì)胞(紅色)更多(圖1c);此外,對(duì)二組在24 h內(nèi)的遷移速度進(jìn)行觀察,發(fā)現(xiàn)MitoQ-ADMSCs遷移速度顯著快于ADMSCs,尤其在12 h時(shí)最為明顯,MitoQ-ADMSCs具有明顯的遷移優(yōu)勢(shì)(圖1d)。

A. Giemsa染色; b.細(xì)胞生長(zhǎng)曲線; c.EdU染色; d.細(xì)胞遷移試驗(yàn)。*.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001,ns.P>0.05a. Giemsa staining; b. Cell growth curve; c. EdU staining; d. Cell migration test.*.P<0.05, **.P<0.01, ***.P<0.001, ns.P>0.05

A. qRT-PCR試驗(yàn); b. ROS染色。*.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001,ns.P>0.05a. qRT-PCR experiment; b.ROS staining. *.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001, ns.P>0.05

2.2 MitoQ-ADMSCs和ADMSCs抗氧化、抗衰老能力差異

qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)MitoQ-ADMSCs和ADMSCs中SOD1、SOD2、MDA、GSH-Px的相對(duì)表達(dá)量發(fā)現(xiàn):MitoQ-ADMSCs與ADMSCs相比,抗氧化相關(guān)的超氧化物歧化酶(SOD1、SOD2)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶GSH-Px轉(zhuǎn)錄量顯著升高,氧化損傷相關(guān)的丙二醛(MDA)轉(zhuǎn)錄量顯著下降,提示MitoQ預(yù)處理提升了ADMSCs在體外培養(yǎng)過(guò)程中的抗氧化能力(圖2a);利用熒光探針DCFH-DA對(duì)MitoQ-ADMSCs和ADMSCs進(jìn)行檢測(cè),活性氧可以氧化DCFH變成有熒光的DCF,觀察可見(jiàn)同一視野中ADMSCs的熒光量顯著多于MitoQ-ADMSCs,證明ADMSCs中的活性氧水平更高,提示MitoQ處理減少了ADMSCs活性氧水平,抗氧化能力顯著提升(圖2b)。

2.3 小鼠糖尿病模型的建立及治療期間臨床指標(biāo)變化

對(duì)8周齡昆明(KM)小鼠進(jìn)行1周適應(yīng)性飼喂后,除NC組外的所有小鼠均改用高糖高脂飼料進(jìn)行為期3周的飼喂,觀察到小鼠體重顯著上升,但血糖水平?jīng)]有明顯的變化,后對(duì)達(dá)到40 g以上的小鼠使用STZ連續(xù)3周注射,1次·周-1,在此過(guò)程中可觀察到小鼠的體重水平呈現(xiàn)出明顯的下降趨勢(shì),血糖水平則呈現(xiàn)出明顯的上升趨勢(shì),且多飲多食現(xiàn)象逐漸加劇,被毛也變得粗糙凌亂,墊料中尿液和糞便味道極大,甚至有幾只出現(xiàn)了便血,注射結(jié)束后1周,即在第7周時(shí)對(duì)小鼠進(jìn)行了再次的檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)造模的小鼠空腹血糖水平穩(wěn)定維持在11.1 mmol·L-1以上,表明成功建立小鼠糖尿病模型。在第8周時(shí),對(duì)ADMSCs組和MitoQ-ADMSCs小鼠進(jìn)行細(xì)胞移植治療,連續(xù)3周,1次·周-1在治療過(guò)程后,發(fā)現(xiàn)經(jīng)細(xì)胞移植的小鼠血糖水平顯著下降,采食和飲水量也有所下降,體重水平則有所回升,且MitoQ-ADMSCs的細(xì)胞移植效果要優(yōu)于ADMSCs移植組(圖3a～d),可見(jiàn)MitoQ促進(jìn)了ADMSCs對(duì)小鼠糖尿病臨床癥狀的恢復(fù)作用。為檢查小鼠機(jī)體血糖調(diào)節(jié)能力是否有所恢復(fù),在治療的第1、3 周分別對(duì)小鼠進(jìn)行了葡萄糖耐量的檢測(cè),發(fā)現(xiàn)NC組的小鼠在葡萄糖灌注后的2 h內(nèi)血糖雖然升高,但是不顯著;而Diabetes組小鼠的血糖水平顯著升高,在30 min時(shí)甚至達(dá)到了20 mmol·L-1;ADMSCs移植治療的小鼠血糖水平雖然沒(méi)有恢復(fù)到正常情況,但是相較于模型組小鼠其下降效果明顯,且MitoQ-ADMSCs組小鼠的血糖變化幅度低于ADMSCs組,說(shuō)明MitoQ可能促進(jìn)了糖尿病小鼠胰島β細(xì)胞功能和機(jī)體血糖調(diào)節(jié)能力的恢復(fù)(圖3e、f)。

A.體重變化;b.空腹血糖變化;c.采食量變化;d.飲水量變化;e.治療第1周葡萄糖耐量;f.治療第3周葡萄糖耐量。*.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001,ns表示無(wú)顯著差異a. Weight change; b. Changes in fasting blood glucose; c. Changes in food intake; d. Changes in water consumption; e. Glucose tolerance in the first week of treatment; f. Glucose tolerance at the third week of treatment. *.P<0.05,**.P<0.01,***P<0.001, ns.P>0.05

2.4 MitoQ預(yù)處理ADMSCs對(duì)糖尿病小鼠胰腺組織損傷的影響

對(duì)NC組、Diabetes組、ADMSCs組、MitoQ-ADMSCs組小鼠進(jìn)行胰腺組織取樣后,HE染色,結(jié)果表明,NC組的胰島邊界清晰可見(jiàn),而Diabetes組小鼠胰腺中胰島結(jié)構(gòu)受損,呈現(xiàn)出破損狀態(tài);經(jīng)ADMSCs和MitoQ-ADMSCs移植治療后,胰島結(jié)構(gòu)有所恢復(fù),除小部分胰島因破壞嚴(yán)重較難修復(fù)外,有正常結(jié)構(gòu)、邊界清晰的胰島結(jié)構(gòu)存在(圖4a);對(duì)小鼠的胰腺進(jìn)行胰島素的免疫熒光染色,可見(jiàn)NC組小鼠的胰島能夠正常分泌胰島素,Diabetes組小鼠胰島結(jié)構(gòu)內(nèi)胰島素?zé)晒庵荒茉谛〔糠炙槠囊葝u結(jié)構(gòu)中觀察到,而ADMSCs和MitoQ-ADMSCs則明顯改善了這一效果,可見(jiàn)胰島結(jié)構(gòu)胰島素的分泌量增加,且MitoQ-ADMSCs胰島素分泌基本恢復(fù)到正常水平,揭示ADMSCs能夠促進(jìn)胰島結(jié)構(gòu)中β細(xì)胞的功能恢復(fù),且MitoQ能夠促進(jìn)ADMSCs的這一效果(圖4b、c)。

A.胰腺HE染色(20×);b.胰腺組織胰島素免疫熒光染色(10×);c.胰腺組織胰島素免疫熒光染色(20×)a. HE staining of pancreas (20×); b. Pancreatic tissue Insulin immunofluorescence staining (10×); c. Pancreatic tissue Insulin immunofluorescence staining (20×)

A.丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶;b.天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶;c.總膽固醇; d.甘油三酯。*.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001,ns.P>0.05a. ALT; b. AST; c. TC; d.TG. *.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001, ns.P>0.05

A. HE染色(10×);b. PAS染色(10×);c. Masson染色(20×)a. HE staining (10×); b. PAS staining (10×); c. Masson staining (20×)

2.5 MitoQ預(yù)處理ADMSCs對(duì)糖尿病小鼠肝和脂質(zhì)代謝的影響

作為機(jī)體內(nèi)調(diào)節(jié)血糖的有效器官,肝在葡萄糖的吸收、儲(chǔ)存、生產(chǎn)和代謝方面起重要作用,當(dāng)糖尿病發(fā)生時(shí),葡萄糖代謝紊亂會(huì)導(dǎo)致繼發(fā)性肝損害。相關(guān)血清學(xué)檢測(cè)顯示,Diabetes組小鼠的血清ALT和AST明顯高于NC組,經(jīng)細(xì)胞移植治療后,ALT和AST的檢測(cè)結(jié)果均有所下降,且MitoQ顯著促進(jìn)ADMSCs降低AST和ALT水平的能力,結(jié)果顯示,ADMSCs具有減輕肝代謝障礙的作用,而MitoQ能夠進(jìn)一步增強(qiáng)這一效果(圖5 a、b);當(dāng)糖尿病發(fā)生時(shí),脂肪的分解和代謝會(huì)明顯快于正常水平,加重肝等的負(fù)擔(dān),使脂質(zhì)代謝相關(guān)的指標(biāo)有所上升,對(duì)小鼠TC和TG水平進(jìn)行檢測(cè)后,可見(jiàn)ADMSCs移植促進(jìn)了血清中TC和TG水平的恢復(fù),MitoQ-ADMSCs則進(jìn)一步增強(qiáng)了這一作用,證明ADMSCs能夠減輕因糖尿病造成的高脂血癥,而MitoQ能夠進(jìn)一步促進(jìn)ADMSCs的治療效果(圖5c、d)。

2.6 MitoQ預(yù)處理ADMSCs對(duì)糖尿病小鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

為了進(jìn)一步驗(yàn)證MitoQ和ADMSCs聯(lián)合治療對(duì)糖尿病小鼠氧化應(yīng)激代謝指標(biāo)的影響,作者進(jìn)行了相關(guān)試驗(yàn)。發(fā)現(xiàn)Diabetes組小鼠的MDA和H2O2水平遠(yuǎn)高于NC組,而CAT和SOD水平明顯低于NC組,ADMSCs雖然在一定程度上恢復(fù)因糖尿病導(dǎo)致的機(jī)體抗氧化能力的下降及氧化應(yīng)激損傷,但是效果十分有限,而MitoQ則能夠進(jìn)一步提高機(jī)體的抗氧化能力,使其基本恢復(fù)到正常水平,避免因氧化應(yīng)激導(dǎo)致疾病的進(jìn)一步加重(圖6 a～d)。綜上所述,ADMSCs可以一定程度恢復(fù)因糖尿病導(dǎo)致的氧化損傷,而MitoQ能夠極大促進(jìn)ADMSCs對(duì)糖尿病小鼠的氧化損傷修復(fù)作用,使得機(jī)體的抗氧化能力基本恢復(fù)到正常水平。

2.7 MitoQ預(yù)處理ADMSCs對(duì)糖尿病小鼠肝組織損傷的影響

肝組織H&E結(jié)果顯示,NC組肝組織細(xì)胞索結(jié)構(gòu)排列較為規(guī)整,形態(tài)完整且清晰,Diabetes組小鼠的肝則呈現(xiàn)出明顯的壞死,可見(jiàn)組織呈現(xiàn)出彌漫性出血、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及較大面積肝細(xì)胞呈現(xiàn)空泡化變性,經(jīng)細(xì)胞移植后,可見(jiàn)細(xì)胞空泡化情況顯著減少、組織彌漫性出血減少,形態(tài)結(jié)構(gòu)有所恢復(fù),且MitoQ-ADMSCs相比于ADMSCs組肝細(xì)胞排列更加整齊,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度減輕(圖7 a);除此之外,為檢測(cè)肝組織糖原積累、纖維化程度,進(jìn)行系列染色,包括PAS染色和Masson染色,肝經(jīng)PAS染色后糖原呈紫紅色,經(jīng)Masson染色肌纖維呈紅色、膠原纖維為藍(lán)色,結(jié)果顯示,ADMSCs組移植恢復(fù)了糖尿病誘發(fā)的糖原合成障礙,降低了肝纖維化程度,而MitoQ能夠進(jìn)一步促進(jìn)這些治療作用的提升(圖7 b、c)。這些結(jié)果表明,ADMSCs可減輕糖尿病引起的肝纖維化,減輕糖原合成障礙,而MitoQ可以更好地促進(jìn)相關(guān)指標(biāo)的改進(jìn)。MitoQ預(yù)處理ADSMCs可通過(guò)減輕糖原合成障礙和肝纖維化,從而為維持血糖平衡提供有效支持。

2.8 MitoQ預(yù)處理ADMSCs對(duì)糖尿病犬臨床癥狀的影響

經(jīng)過(guò)1周適應(yīng)性飼喂后,開(kāi)始相關(guān)試驗(yàn),NC組試驗(yàn)犬全程使用普通飼料飼喂,其他三組選用普通犬糧搭配饅頭、米飯等含糖量較高的食物飼喂3周,禁食16 h后進(jìn)行STZ注射,20 mg·kg-1,1次·d-1,連續(xù)3 d,1 周后,也就是試驗(yàn)的第31天時(shí)進(jìn)行血糖水平的檢測(cè),犬出現(xiàn)嘔吐、被毛粗糙、精神沉郁和個(gè)別體重下降的情況,但是血糖水平變化不明顯,未達(dá)到造模標(biāo)準(zhǔn),所以繼續(xù)進(jìn)行為期3 d的STZ注射,1周后,即第42天,再次進(jìn)行血糖水平的檢測(cè),隨機(jī)血糖水平基本維持在11.1 mmol·L-1以上,且各組的體重水平均呈現(xiàn)出明顯的下降趨勢(shì),視為成功建立糖尿病模型;后對(duì)犬進(jìn)行為期3周的細(xì)胞移植,移植劑量為1×107·只-1,可見(jiàn)血糖水平隨著細(xì)胞移植時(shí)間的延長(zhǎng),呈現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì),其中,MitoQ-ADMSCs組犬的血糖水平基本恢復(fù)到糖尿病初期的水平,且體重水平也隨著細(xì)胞移植治療有所恢復(fù),糖尿病相關(guān)的臨床癥狀有所恢復(fù),犬在治療期間生命體征平穩(wěn),未出現(xiàn)死亡、暈厥及精神沉郁狀況,結(jié)果表明,細(xì)胞移植后,犬的臨床癥狀得到改善,體重和血糖水平也得到恢復(fù),特別是經(jīng)MitoQ預(yù)處理的ADMSCs進(jìn)一步促進(jìn)了治療效果(圖8 a、b);對(duì)治療后第1、3周犬的葡萄糖耐量水平進(jìn)行檢測(cè),可見(jiàn)細(xì)胞移植后葡萄糖耐量的變化幅度有所下降,但是ADMSCs和MitoQ-ADMSCs之間的差異不是很明顯(圖8 c、d)。

A.體重變化;b.隨機(jī)血糖變化;c.治療第1周葡萄糖耐量;d.治療第3周葡萄糖耐量。*.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001,ns.P>0.05a. Weight change; b. Changes in blood glucose; c. Glucose tolerance in the first week of treatment; d. Glucose tolerance at week 3 of treatment. *.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001, ns.P>0.05

2.9 MitoQ預(yù)處理ADMSCs對(duì)糖尿病犬胰腺及肝組織的影響

對(duì)NC組、Diabetes組、ADMSCs組、MitoQ-ADMSCs組犬進(jìn)行胰腺組織取樣后,進(jìn)行了HE染色,可見(jiàn)NC組胰腺結(jié)構(gòu)十分健全,胰島可見(jiàn),Diabetes組犬的胰腺觀察到組織受損、胰島破碎、炎癥浸潤(rùn)及彌漫性出血,ADMSCs移植后可以觀察到胰島出現(xiàn)重建跡象,但是受損嚴(yán)重的胰島修復(fù)效果不明顯,而MitoQ-ADMSCs對(duì)于胰島結(jié)構(gòu)修復(fù)效果較好,除小部分胰島因破壞嚴(yán)重修復(fù)較難外,可以看見(jiàn)有正常結(jié)構(gòu)、邊界清晰的胰島結(jié)構(gòu)存在(圖9 a);除此之外,還進(jìn)行了胰島素的免疫熒光染色,可見(jiàn)NC組犬的胰島能夠正常分泌胰島素,Diabetes組犬的胰島素?zé)晒庵荒茉谛〔糠炙槠囊葝u結(jié)構(gòu)中觀察到,而ADMSCs和MitoQ-ADMSCs則改善了這一效果,可見(jiàn)到胰島結(jié)構(gòu)中胰島素的分泌量增加,且MitoQ-ADMSCs組胰島素分泌基本恢復(fù)到正常水平,揭示ADMSCs能夠促進(jìn)胰島結(jié)構(gòu)中β細(xì)胞的功能恢復(fù),且MitoQ能夠促進(jìn)ADMSCs的這一效果(圖9 b)。肝組織HE染色結(jié)果顯示,NC組肝組織細(xì)胞索結(jié)構(gòu)排列較為規(guī)整,形態(tài)完整且清晰,Diabetes組的肝則呈現(xiàn)出明顯的壞死,可見(jiàn)組織呈現(xiàn)出彌漫性出血、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及較大面積肝細(xì)胞呈現(xiàn)空泡化變性,經(jīng)ADMSCs移植后,可見(jiàn)彌漫性出血情況雖然有所改善,但是空泡化情況改善并不明顯,而MitoQ-ADMSCs顯著提升了這一修復(fù)作用;除此之外,為檢測(cè)肝組織糖原積累、纖維化程度,進(jìn)行了系列染色,包括PAS染色、Masson染色,結(jié)果顯示,ADMSCs移植雖然在一定程度上恢復(fù)了糖尿病引起的糖原合成障礙,降低了肝纖維化程度,促進(jìn)了血糖平衡的維持,但是治療效果不明顯,而MitoQ-ADMSCs治療效果極大提升(圖9 c～e)。這些結(jié)果表明,ADMSCs可減輕糖尿病引起的肝損傷,增強(qiáng)肝的糖代謝和脂質(zhì)代謝功能,而MitoQ可以更好地促進(jìn)相關(guān)指標(biāo)的改善。MitoQ預(yù)處理ADSMCs可通過(guò)修復(fù)肝損傷,有效減少糖脂代謝紊亂,從而為維持血糖平衡提供有效支持。

2.10 MitoQ預(yù)處理ADMSCs對(duì)糖尿病犬肝、脂質(zhì)代謝及氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

糖尿病發(fā)生時(shí),除胰腺組織的結(jié)構(gòu)和功能會(huì)受損外,對(duì)其他靶組織也會(huì)造成損傷,尤其肝損傷較為嚴(yán)重。對(duì)血清學(xué)中與肝臟和脂質(zhì)代謝相關(guān)的指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示,Diabetes組犬血清的ALT和AST水平明顯高于NC組,經(jīng)細(xì)胞移植治療后,ALT和AST的檢測(cè)結(jié)果均有所下降,且MitoQ進(jìn)一步促進(jìn)了ADMSCs降低AST和ALT水平的能力(圖10 a、b);除此之外,對(duì)犬脂質(zhì)代謝相關(guān)的指標(biāo)TC和TG水平進(jìn)行檢測(cè),可見(jiàn)ADMSCs移植促進(jìn)了血清中TC和TG水平的恢復(fù),MitoQ則進(jìn)一步增強(qiáng)了這一作用,證明ADMSCs能夠有效減輕因糖尿病造成的肝和脂質(zhì)代謝障礙,恢復(fù)肝組織對(duì)葡萄糖調(diào)節(jié)的協(xié)助作用,而MitoQ能夠進(jìn)一步促進(jìn)ADMSCs的治療作用,以達(dá)到更好的治療效果(圖10 c、d);對(duì)糖尿病的靶組織胰腺中的氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè),可見(jiàn)Diabetes組犬的MDA和H2O2的水平遠(yuǎn)高于NC組,而SOD水平明顯低于NC組,ADMSCs在一定程度上恢復(fù)因糖尿病導(dǎo)致的機(jī)體抗氧化能力的下降及氧化應(yīng)激損傷,但MitoQ能夠更進(jìn)一步減輕機(jī)體的氧化應(yīng)激,使得幾項(xiàng)指標(biāo)基本恢復(fù)到正常水平,并且避免因氧化應(yīng)激導(dǎo)致疾病的進(jìn)一步加重(圖10 e～g)。綜上所述,MitoQ預(yù)處理ADMSCs可減輕糖尿病引起的肝損傷和脂質(zhì)代謝紊亂,有效保護(hù)機(jī)體免受氧化應(yīng)激損傷。

A.丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶;b.天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶;c.總膽固醇;d.甘油三酯;e.超氧化物歧化酶;f.過(guò)氧化氫;g.丙二醛。*.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001,ns.P>0.05a. ALT; b. AST; c.TC; d. TG; e. SOD; f. H2O2; g. MDA. *.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001, ns.P>0.05

2.11 MitoQ預(yù)處理ADMSCs治療犬糖尿病的代謝組學(xué)分析

對(duì)12個(gè)血清樣本和QC樣本進(jìn)行PCA分析,可見(jiàn)正、負(fù)離子模式下QC樣本均呈聚集狀態(tài),證明各試驗(yàn)組內(nèi)差異較小,結(jié)果可靠(圖11 a、b);針對(duì)差異代謝物的化學(xué)分類(lèi)進(jìn)行了分析并制成餅圖,共13個(gè)分類(lèi),其中,脂質(zhì)分子類(lèi)別占比最多(圖11 e);針對(duì)正負(fù)離子模式下篩選到的各組之間差異代謝物的重疊情況,進(jìn)行了Venn圖展示,可觀察到不同對(duì)比組之間顯著性差異代謝物的變化(圖11 c、d);對(duì)各組間的差異代謝物進(jìn)行對(duì)比后,觀察到其中有10個(gè)顯著變化的代謝物與氧化應(yīng)激存在較大關(guān)聯(lián),分別是琥珀酸鹽(succinate)、帽柱木堿(mitragynine)、肌酸(creatine)、N-乙酰-L-亮氨酸(L-leucine,n-acetyl)、尿囊素(allantoin)、奧昔嘌醇(oxypurinol)、海藻糖(trehalose)、龍膽苦苷(gentiopicroside)、環(huán)鳥(niǎo)甘酸(3′,5′-cyclic inosine monophosphate)、蓖麻油酸(ricinoleic acid),除琥珀酸鹽外,其余代謝物均與氧化損傷減少、抗氧化能力加強(qiáng)相關(guān),在MitoQ-ADMSCs組和NC組中表現(xiàn)出相似水平,而Diabetes組犬血清中相關(guān)代謝物則呈現(xiàn)出顯著下調(diào)的趨勢(shì),且ADMSCs治療并未對(duì)相關(guān)指標(biāo)產(chǎn)生明顯的上調(diào)影響,所以MitoQ促進(jìn)ADMSCs對(duì)糖尿病治療效果的提升可能是促進(jìn)了ADMSCs抗氧化能力的提升,使得機(jī)體中的相關(guān)代謝物能夠恢復(fù)到正常水平,從而有效減少疾病發(fā)展過(guò)程中因氧化應(yīng)激造成的損傷。

A.正離子模式總體樣本PCA分析;b.負(fù)離子模式總體樣本PCA分析;c.正離子模式Venn圖;d.負(fù)離子模式Venn圖;e.鑒定的代謝物在各化學(xué)分類(lèi)的數(shù)量占比;f.差異代謝物聚類(lèi)熱圖a. PCA analysis of positive ion mode population samples; b. PCA analysis of negative ion mode population samples; c. Positive ion mode Venn diagram; d. Negative ion mode Venn diagram; e. The proportion of identified metabolites in each chemical classification; f. Differential metabolite clustering heat map

3 討 論

糖尿病在犬等伴侶動(dòng)物中的發(fā)生率逐年上升,對(duì)犬的健康造成極大威脅,有時(shí)還會(huì)因?yàn)閲?yán)重的并發(fā)癥導(dǎo)致重度疾病的發(fā)生,甚至死亡。究其原因,目前認(rèn)為犬糖尿病的發(fā)生原因主要包括1)畜主的不正確飼喂方式,在飼養(yǎng)過(guò)程中給予過(guò)多高糖高脂食物;2)犬本身就存在糖脂代謝障礙等方面的疾病,先天出生時(shí)就缺乏胰島素的生成能力[31]。雖然目前寵物糖尿病的診斷技術(shù)發(fā)展十分迅速,當(dāng)犬出現(xiàn)癥狀時(shí)能夠及時(shí)判定并進(jìn)行干預(yù)治療,但是治療方式仍較為局限,主要還是胰島素注射配以常規(guī)降糖藥物,然而這些治療方式無(wú)法起到控制疾病發(fā)展或者根治的效果,除此之外,多數(shù)降糖藥物還會(huì)對(duì)肝、腎等器官造成負(fù)擔(dān)。

干細(xì)胞療法已成為當(dāng)今醫(yī)學(xué)領(lǐng)域備受關(guān)注的研究?jī)?nèi)容,并被廣泛應(yīng)用于臨床治療。MSCs是目前應(yīng)用最為廣泛的干細(xì)胞,除了具備多向分化和自我更新等共同特征外,還具有造血支持、免疫調(diào)節(jié)等特性。間充質(zhì)干細(xì)胞的來(lái)源十分廣泛,臨床試驗(yàn)中常用的多為臍帶、骨髓、脂肪等組織來(lái)源的細(xì)胞,在使用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells, BMSCs)進(jìn)行治療時(shí),發(fā)現(xiàn)外源性因素對(duì)細(xì)胞形態(tài)影響很大,導(dǎo)致細(xì)胞在體外培養(yǎng)階段易發(fā)生變形、衰老和死亡。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilical cord mesenchymal stem cells,UCMSCs)雖然在體外培養(yǎng)狀態(tài)較穩(wěn)定,但是存在一定的倫理和法律糾紛。而ADMSCs,相對(duì)于其他組織來(lái)源的成體干細(xì)胞來(lái)說(shuō),分離方式極其方便,不會(huì)對(duì)動(dòng)物機(jī)體造成很大損傷,且定向分化和恢復(fù)能力強(qiáng)、免疫原性低,無(wú)社會(huì)倫理問(wèn)題等優(yōu)點(diǎn)使得其成為MSCs臨床試驗(yàn)中最為常見(jiàn)的類(lèi)型[32-33]。

然而ADMSCs在臨床治療中仍存在一些不足,如在體外培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí),仍舊會(huì)發(fā)生形態(tài)改變、結(jié)構(gòu)受損、衰老和凋亡情況的發(fā)生,細(xì)胞移植到機(jī)體內(nèi)后無(wú)法保持長(zhǎng)期有效的治療作用,探索提高ADMSCs對(duì)糖尿病治療潛力的方式十分重要。MitoQ作為一種強(qiáng)有用的抗氧化劑,已被大量試驗(yàn)證明可以延緩細(xì)胞衰老,減輕細(xì)胞氧化應(yīng)激造成的損傷。所以探究MitoQ是否能夠通過(guò)增強(qiáng)ADSMCs的抗氧化能力從而更好地治療糖尿病十分重要。

本研究選用MitoQ對(duì)ADMSCs進(jìn)行預(yù)處理,并進(jìn)行細(xì)胞移植,在試驗(yàn)期間對(duì)動(dòng)物模型的臨床癥狀、肝脂質(zhì)代謝水平、氧化應(yīng)激指標(biāo)、組織學(xué)水平、代謝組水平等進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明,MitoQ-ADMSCs與ADMSCs無(wú)顯著形態(tài)差異,但MitoQ能夠促進(jìn)ADMSCs的生長(zhǎng)速度、增殖效率及遷移能力的提升,并且能夠提高ADMSCs的抗氧化和抗衰老能力,減緩細(xì)胞衰老;ADMSCs能夠降低血糖、恢復(fù)體重、減少采食量和飲水量,恢復(fù)精神狀態(tài),且MitoQ能夠進(jìn)一步促進(jìn)ADMSCs的治療效果;MitoQ預(yù)處理ADMSCs能夠有效恢復(fù)機(jī)體的血糖調(diào)節(jié)能力,促進(jìn)胰島素分泌量的增加;ADMSCs和MitoQ-ADMSCs均具有改善糖尿病相關(guān)肝和脂質(zhì)代謝指標(biāo)的作用,且MitoQ-ADMSCs的效果更勝一籌;針對(duì)胰腺氧化應(yīng)激指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè),可見(jiàn)抗氧化能力在MitoQ-ADMSCs組顯著增加,且氧化損傷顯著減輕;細(xì)胞移植后因糖尿病導(dǎo)致的組織損傷、胰島結(jié)構(gòu)破壞、肝纖維化等均有所恢復(fù),且MitoQ能夠進(jìn)一步促進(jìn)ADMSCs的治療作用;代謝組學(xué)分析結(jié)果顯示,MitoQ能夠進(jìn)一步促進(jìn)ADMSCs治療效果與抗氧化能力提升有關(guān)。因此,將MitoQ-ADMSCs可能會(huì)是寵物臨床治療的可靠手段和新制劑。

4 結(jié) 論

米托蒽醌甲磺酸鹽能夠通過(guò)提高脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的抗氧化能力、加速組織損傷修復(fù),從而更好地治療小鼠及犬糖尿病。