王 賀,郭志廷,李建喜,張景艷,王 磊,張 康,孫繼文,尚小粉,馬永華*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,蘭州 730070;2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,甘肅省中獸藥工程技術(shù)研究中心,蘭州 730050)

球蟲病是雞最常見的腸道寄生蟲病,對全世界養(yǎng)雞場造成巨大危害,嚴(yán)重影響雞場經(jīng)濟(jì)效益。柔嫩艾美耳球蟲作為致病力和毒性最強(qiáng)的球蟲[1-2],重癥感染病雞剖檢會發(fā)現(xiàn)一側(cè)或兩側(cè)盲腸嚴(yán)重腫大,盲腸內(nèi)充滿大量血液或帶有腸芯[3-4];柔嫩艾美耳球蟲屬于宿主特異性的胞內(nèi)寄生蟲,主要寄生在雞盲腸隱窩上皮細(xì)胞[5],可造成盲腸黏膜損傷,上皮細(xì)胞腫脹、壞死崩解和脫落[6],從而阻礙腸道對于養(yǎng)分的吸收影響機(jī)體的新陳代謝[7],導(dǎo)致血痢、體重減輕,甚至死亡。目前,在飼料中添加抗球蟲藥物是防治雞球蟲病的主要方法。其中,應(yīng)用廣泛的為一些聚醚類離子載體抗生素和化學(xué)合成藥物抗球蟲飼料添加劑[8],但是耐藥性的產(chǎn)生[7],使得這些藥物治療或預(yù)防效果降低,且存在藥物殘留影響食品安全[9]。艾美耳球蟲幾乎對所有已知的抗球蟲藥物產(chǎn)生耐藥性。由于艾美耳球蟲感染可產(chǎn)生較強(qiáng)免疫反應(yīng),疫苗接種成為預(yù)防球蟲病的有效方法之一[7-8],但疫苗可能引發(fā)嚴(yán)重的出血性反應(yīng)或吸收障礙[9-13]。中草藥具有耐藥風(fēng)險(xiǎn)低、安全、副作用小等優(yōu)勢[14-15],逐漸成為消費(fèi)者追求的主流產(chǎn)品[16]。研究表明,許多中草藥對治療雞球蟲病有效,如常山、青蒿[17]、檳榔[18]、川楝子[19]、白頭翁、肉桂[20]等。目前,市場上存在很多用于控制球蟲病中草藥復(fù)方[21]。有些中藥并不是直接作用于球蟲,而是作用于腸道,因其具有免疫調(diào)節(jié)作用、抗氧化或抗炎特性,從而幫助宿主抵抗球蟲感染[22-23]。有些中草藥提取物可以通過改變卵囊壁形成和抑制孢子形成[24-25],或通過破壞子孢子[26],對球蟲產(chǎn)生直接殺滅作用。部分中草藥提取物可以提高球蟲病后機(jī)體的恢復(fù)能力[27-28]。

研究表明,中藥常山提取物可以有效預(yù)防和治療雞球蟲病,其中的主要成分常山堿在一定程度上能夠增強(qiáng)機(jī)體的免疫力,刺激機(jī)體免疫反應(yīng)中相關(guān)免疫細(xì)胞的發(fā)育,如參與細(xì)胞免疫的淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞,同時(shí)也可以抑制球蟲在宿主腸道黏膜中的生長發(fā)育,從而減輕對宿主寄生部位的破壞和減少球蟲卵囊的形成[29]。本試驗(yàn)通過常山散對感染柔嫩艾美耳球蟲不同發(fā)育階段的雛雞生長性能、每克糞便卵囊數(shù)(OPG)、盲腸病變評分、抗球蟲指數(shù)、血清免疫球蛋白及免疫器官指數(shù)測定,研究常山散對感染雛雞抗球蟲效果和免疫功能的影響,明確最佳給藥時(shí)間,為后期常山散防治雞球蟲病提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物

1日齡白羽肉雞購自酒泉市旺苗禽業(yè)養(yǎng)殖場,前期于SPF隔離艙內(nèi)飼養(yǎng)至12日齡,后轉(zhuǎn)移至嚴(yán)格消殺且無球蟲污染的試驗(yàn)動物房,并于14日齡滴鼻接種新-傳二聯(lián)苗,飼養(yǎng)至16日齡。

1.2 球蟲卵囊

柔嫩艾美耳球蟲由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)寄生蟲病實(shí)驗(yàn)室提供。試驗(yàn)開始前,將柔嫩艾美耳球蟲卵囊重新進(jìn)行傳代,確保卵囊感染活力。將孢子化率為85%以上的球蟲卵囊于2.5%重鉻酸鉀溶液4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 藥品與試劑

常山散中試產(chǎn)品(100 g·袋-1,批號2021111501,1 g本品相當(dāng)于常山原藥材10 g;有效成分是常山生物堿,含量1.5%),石家莊正道動物藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。常山散主要生產(chǎn)工藝:利用超聲波提取技術(shù),從中藥常山中提取得到常山浸膏,干燥粉碎后,加入適量淀粉混勻即得(常山浸膏和淀粉質(zhì)量比9∶1)[30];雞新城疫-傳染性支氣管炎二聯(lián)活疫苗(La Sota株+H120株),購自乾元浩生物股份有限公司南京生物藥廠;免疫球蛋白IgG、IgA、IgM檢測試劑盒,購自北京索萊寶科技有限公司。

1.4 試驗(yàn)動物分組與給藥

試驗(yàn)開始前連續(xù)3 d進(jìn)行糞檢,確認(rèn)雛雞沒有感染球蟲。試驗(yàn)分為6大組:攻蟲前1天(15日齡)、攻蟲當(dāng)天(16日齡)、第2天(17日齡)、第3天(18日齡)、第4天(19日齡)和第5天(20日齡)給藥試驗(yàn)組,每個(gè)試驗(yàn)組又分為3個(gè)處理組,分別為Ⅰ組(健康對照組)、Ⅱ組(感染性對照組)和Ⅲ組(常山散推薦劑量組,連續(xù)給藥4 d)。每組10只雞,共180只,Ⅰ組單獨(dú)飼養(yǎng),各試驗(yàn)組開始試驗(yàn)之前均禁食12 h,正常飲水。除Ⅰ組外,其他各組試驗(yàn)雞均于16日齡按照5×104·只-1劑量人工感染柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊。各試驗(yàn)組雞分別于19、20、21、22、23和24日齡早上9:00先稱重后捕殺,采集雞盲腸內(nèi)容物檢查球蟲卵囊,觀察雞臨床癥狀和盲腸病理變化。具體分組見表1。

1.5 測定指標(biāo)和方法

1.5.1 生長性能測定 以重復(fù)組為單位,試驗(yàn)雞于試驗(yàn)前后分別稱重(稱重前均禁食12 h,不禁水),詳細(xì)記錄各組雞的采食量,計(jì)算各組雞平均日采食量(ADFI)、平均日增重(ADG)、料重比(F/G)。綜合評判常山散對感染柔嫩艾美耳球蟲不同發(fā)育階段雛雞生長性能的影響。

1.5.2 抗球蟲指數(shù)測定 抗球蟲指數(shù)(anticoccidia index,ACI)根據(jù)美國默克(Merck)公司計(jì)算公式:ACI=(存活率+相對增重率)-(病變值+卵囊值)。根據(jù)ACI值判定其抗球蟲效果:120以下為無效;120～160為差;160～180良好;180以上為優(yōu)秀[31]。

存活率=(各試驗(yàn)組結(jié)束雛雞數(shù)量/各試驗(yàn)組開始雛雞數(shù)量)×100%

相對增重率=(各試驗(yàn)處理組的平均增重/健康對照組的平均增重)×100%

試驗(yàn)結(jié)束,每組試驗(yàn)雞分別稱量,采血后捕殺,取盲腸組織并打開進(jìn)行盲腸病變計(jì)分。收集各組雞盲腸內(nèi)容物,破碎,用飽和食鹽水漂浮,紗布過濾2～3次,過濾液靜置10 min,蓋玻片蘸取濾液表面,用細(xì)胞計(jì)數(shù)板于顯微鏡下觀察并進(jìn)行卵囊計(jì)數(shù)。

病變記分參照J(rèn)ohnson和Reid(1970)的病變記分方法,兩側(cè)盲腸病變不一致者以嚴(yán)重一側(cè)為準(zhǔn)。見表2。

表2 病變記分標(biāo)準(zhǔn)

病變值=各試驗(yàn)組的平均病變記分×10。

將收集的盲腸內(nèi)容物用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)算每克糞便卵囊數(shù)(OPG值),根據(jù)卵囊比數(shù)換算成卵囊值。卵囊比數(shù)=(健康組或藥物試驗(yàn)組OPG值/攻蟲對照組OPG值)×100%。見表3。

表3 卵囊值與卵囊比數(shù)關(guān)系

1.5.3 中藥常山散對健康雛雞免疫功能的影響 分別于試驗(yàn)結(jié)束日,每組隨機(jī)抽取6只雞,稱重后心臟采血8～10 mL,室溫靜置2 h,4 500 r·min-1離心20 min,分離血清。將收集的血清置于-20 ℃保存?zhèn)溆?ELISA 法檢測血清免疫球蛋白IgG、IgA、IgM含量。采血完畢后處死,取脾和法氏囊,去除粘連的脂肪及其他組織,用吸水紙吸干表面液體后稱重,計(jì)算免疫器官指數(shù)。

臟器指數(shù)=臟器重量(mg)/體質(zhì)量(g)

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

2 結(jié) 果

2.1 常山散對雛雞感染球蟲不同發(fā)育階段生長性能的影響

由表4可知,攻蟲前1天和攻蟲當(dāng)天試驗(yàn)組中Ⅰ組和Ⅲ組的日均增重(ADG)無顯著差異(P>0.05),但與Ⅱ組相比差異顯著(P<0.05);攻蟲后第2、3、4、5天試驗(yàn)組各小組間ADG差異顯著(P<0.05),與Ⅰ組相比,Ⅱ組ADG下降明顯,Ⅲ組有所改善。隨著球蟲的不斷發(fā)育,與Ⅰ組相比,Ⅱ組和Ⅲ組的日均采食量(ADFI)呈現(xiàn)不同程度的下降,其中Ⅱ組ADFI下降較多,Ⅲ組相對較少;攻蟲后,Ⅱ、Ⅲ組料重比(F/G)逐漸增加,但與Ⅱ組相比,Ⅲ組的料重比相對較低。

表4 常山散對雛雞感染球蟲不同發(fā)育階段生長性能的影響

2.2 常山散對雛雞感染不同球蟲發(fā)育階段OPG及盲腸病變計(jì)分的影響

研究結(jié)果表明,除攻蟲前1天和攻蟲當(dāng)天試驗(yàn)組無球蟲卵囊外,隨著球蟲的發(fā)育,其他試驗(yàn)組的OPG值差異顯著(P<0.05),與Ⅱ組相比,Ⅲ組的OPG顯著降低(P<0.05);Ⅱ組和Ⅲ組的盲腸病變計(jì)分差異顯著(P<0.05),由于球蟲生長發(fā)育過程中對宿主寄生部位盲腸的不斷侵害,各試驗(yàn)組中Ⅱ組的盲腸病變計(jì)分逐漸上升,Ⅲ組雖也呈上升趨勢,但相較于Ⅱ組,病變計(jì)分均有所下降。詳見表5和圖1。

A. 健康對照組;B. 感染對照組(1～6分別為攻蟲前1天至攻蟲第5天);C. 常山散推薦劑量組(1. 攻蟲前1天給藥組;2. 攻蟲當(dāng)天給藥組;3. 攻蟲第2天給藥組;4. 攻蟲第3天給藥組;5. 攻蟲第4天給藥組;6. 攻蟲第5天給藥組)A. Healthy control group; B. Infected control group (1-6 are from 1 day before to 5 days after the attack, respectively); C. Recommended dose group of RDP (1. Dosing group 1 day before attacking worms; 2. Dosing group on the day of attacking worms; 3. Dosing group on the second day of attacking worms; 4. Dosing group on the third day of attacking worms; 5. Dosing group on the fourth day of attacking worms; 6. Dosing group on the fifth day of attacking worms)

表5 常山散對雛雞感染球蟲不同發(fā)育階段OPG及盲腸病變計(jì)分的影響

2.3 常山散對雛雞感染球蟲不同發(fā)育階段抗球蟲指數(shù)的影響

由表6 可知,各試驗(yàn)組雞存活率基本為100%。隨著球蟲的不斷發(fā)育,與Ⅰ組相比較,攻蟲后Ⅱ組和Ⅲ組的相對增重率逐漸下降,盲腸病變值差異顯著(P<0.05)并呈上升趨勢,相較于Ⅱ組,Ⅲ組的相對增重率下降不大,盲腸病變值較低。試驗(yàn)結(jié)果顯示,攻蟲前1天、攻蟲當(dāng)天和攻蟲第2天試驗(yàn)組中Ⅲ組的ACI分別為198.83、190.23和165.49,攻蟲第3、4和5天試驗(yàn)組中Ⅲ組的ACI分別為150.53、155.00和146.18。

表6 各試驗(yàn)組ACI比較

2.4 常山散對雛雞感染球蟲不同發(fā)育階段免疫功能的影響

2.4.1 對血清免疫球蛋白的影響 由表7 可知:隨著球蟲在雞體內(nèi)的不斷發(fā)育,Ⅰ組的血清免疫球蛋白IgA、IgM、IgG含量均顯著低于其他兩組(P<0.05),Ⅱ組和Ⅲ組的血清免疫球蛋白IgA、IgM、IgG含量呈不同程度的升高,差異顯著(P<0.05)。與Ⅱ組相比,Ⅲ組3種血清免疫球蛋白含量相對較高。

表7 常山散對雛雞感染球蟲不同發(fā)育階段血清免疫球蛋白的影響

2.4.2 對免疫器官指數(shù)的影響 由表8 可知:各試驗(yàn)組中Ⅰ組的脾臟指數(shù)和法氏囊指數(shù)均顯著低于其他兩組(P<0.05)。在攻蟲前1天、攻蟲當(dāng)天試驗(yàn)設(shè)計(jì)組中,Ⅱ組和Ⅲ組的脾臟指數(shù)差異不顯著(P>0.05),在攻蟲第2、3、4、5天試驗(yàn)設(shè)計(jì)組中,Ⅲ組的脾臟指數(shù)顯著高于Ⅱ組(P<0.05);在球蟲發(fā)育的各個(gè)時(shí)期,各試驗(yàn)組中Ⅲ組的法氏囊指數(shù)顯著高于(P<0.05)Ⅱ組。且隨著球蟲的不斷發(fā)育,Ⅱ組和Ⅲ組的免疫器官指數(shù)均呈不同程度的升高。

表8 常山散對雛雞感染球蟲不同發(fā)育階段免疫器官指數(shù)的影響

3 討 論

雞球蟲病為濕熱癥,治療時(shí)應(yīng)以清熱解毒、涼血止瀉,輔以補(bǔ)氣補(bǔ)虛、健胃益脾為原則[32]。本試驗(yàn)以中獸醫(yī)理論為基礎(chǔ),選擇中藥常山治療肉雞球蟲病,中藥常山具有多種藥理作用,具有分布廣、毒副作用小等特點(diǎn)。本試驗(yàn)采用超聲提取技術(shù)從中藥常山中提取常山浸膏,利用超聲波的空化效益和攪拌作用可以充分提取中藥有效成分,與傳統(tǒng)提取工藝相比提取率顯著提高,提取時(shí)間大幅縮短[33],但由于提取設(shè)備較昂貴,市場上規(guī)模化應(yīng)用較少。從中藥常山中提取得到的常山浸膏,可以制備成散劑和口服液;散劑具有生產(chǎn)工藝簡單、成本相對較低的優(yōu)點(diǎn),但規(guī)?；B(yǎng)雞中拌料不方便;口服液具有易吸收、起效快、抗球蟲療效更好的優(yōu)點(diǎn)[34],適合集約化養(yǎng)雞給藥,但生產(chǎn)成本相對較高、產(chǎn)品保質(zhì)期較短。

雛雞人工經(jīng)口灌服感染5×104·羽-1柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊,患病雛雞的發(fā)病癥狀比較明顯,病死率較低,盲腸病變明顯。隨著球蟲在雛雞體內(nèi)的不斷發(fā)育,各試驗(yàn)處理組中Ⅲ組雛雞的相對增重率、OPG、盲腸病變評分與Ⅱ組相比差異顯著(P<0.05),其中Ⅲ組雛雞的相對增重率均高于Ⅱ組,表明常山散可有效緩解病雞體重降低現(xiàn)象;OPG、盲腸病變評分均小于Ⅱ組,證明常山散能夠有效抑制球蟲的生長發(fā)育以及卵囊的排出,在一定程度上能減輕感染雛雞盲腸病變。

完整的球蟲發(fā)育史包括孢子生殖、裂殖生殖和配子生殖3個(gè)階段。本試驗(yàn)中攻蟲前1天、攻蟲當(dāng)天和攻蟲第2天試驗(yàn)組中Ⅲ組ACI分別為198.83、190.23、165.49,說明在雛雞攻蟲前和球蟲感染雞后發(fā)育到子孢子、滋養(yǎng)體階段給藥,常山散具有良好的抗球蟲效果;攻蟲第3、4和5天試驗(yàn)組中Ⅲ組ACI分別為150.53、155.00和146.18,說明球蟲感染雞后發(fā)育到裂殖體、裂殖子階段給藥,常山散的治療效果較差。張步彩等[35]研究發(fā)現(xiàn),含有常山的中藥方劑可以顯著降低感染雛雞的OPG和盲腸病變評分,改善病雞的增重減輕現(xiàn)象,這與本研究的結(jié)果一致。

雛雞感染球蟲后,機(jī)體主要產(chǎn)生黏膜免疫和細(xì)胞免疫,同時(shí)也會引起體液免疫應(yīng)答作為輔助,通過這些免疫途徑抵抗球蟲的入侵[36]。動物血液中的抗體水平是衡量機(jī)體體液免疫的一項(xiàng)重要指標(biāo),機(jī)體體液免疫主要通過成熟B淋巴細(xì)胞實(shí)現(xiàn)[37],B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體(IgG、IgM、IgA)參與體液免疫,成熟的B淋巴細(xì)胞主要存在于血液及淋巴結(jié)、脾臟等外周免疫器官中。本研究結(jié)果顯示,感染柔嫩艾美耳球蟲不同發(fā)育階段的雛雞在飼喂中藥常山散之后,雛雞血液中血清免疫球蛋白IgG、IgM、IgA含量顯著高于(P<0.05)陰性對照組,其中血清免疫球蛋白IgM升高的水平最為顯著。以上結(jié)果表明中藥常山散能夠提高感染柔嫩艾美耳球蟲雛雞機(jī)體血液中的抗體水平,提高機(jī)體的體液免疫應(yīng)答,從而增強(qiáng)機(jī)體抵抗球蟲的能力。

脾臟和法氏囊是禽類最重要的免疫器官,其免疫功能的高低取決于免疫器官的發(fā)育狀態(tài)。動物免疫器官質(zhì)量增加是由于其自身細(xì)胞生長發(fā)育和分裂增殖所致,質(zhì)量增加表明機(jī)體的免疫機(jī)能提高,所以免疫器官的重量在一定范圍內(nèi)可用于評價(jià)雛雞的免疫能力[32,38]。研究表明,中草藥可以提高禽類免疫器官的重量,促進(jìn)免疫器官的發(fā)育以提高免疫器官指數(shù)[39]。王福傳等[40]研究發(fā)現(xiàn)在飼料中添加不同劑量的中草藥免疫增強(qiáng)劑可以顯著提高雛雞的免疫器官重量。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,與Ⅰ組相比,Ⅱ組和Ⅲ組的脾指數(shù)和法氏囊指數(shù)差異顯著(P<0.05)且呈上升趨勢,說明柔嫩艾美耳球蟲對免疫器官的發(fā)育有一定的影響,其中常山散推薦劑量組的各免疫器官指數(shù)均不同程度上顯著(P<0.05)高于感染對照組,說明常山散能夠在一定程度上抑制球蟲的發(fā)育繁殖,減少其對機(jī)體的損害,促進(jìn)各免疫器官的生長發(fā)育,從而增強(qiáng)感染雛雞的免疫力。

4 結(jié) 論

對感染不同發(fā)育階段柔嫩艾美耳球蟲的雛雞在飼料中添加常山散后,在攻蟲前1天、攻蟲當(dāng)天(子孢子階段)和第2天(滋養(yǎng)體階段)進(jìn)行給藥,連續(xù)給藥4 d,常山散對球蟲生長發(fā)育具有顯著的抑制能力,抗球蟲效果良好。在攻蟲第3、4、5天給藥,即裂殖體、裂殖子階段,連續(xù)給藥4 d,常山散對球蟲的生長發(fā)育抑制能力降低,抗球蟲效果較差。但對于感染雛雞的免疫功能而言,中藥常山散的添加,提高了雞血液中免疫血球蛋白IgA、IgM、IgG的含量,提高了脾指數(shù)和法氏囊指數(shù),整體上增強(qiáng)了病雞的免疫功能。