鐘朱夏,胡修忠,向 敏,余 婕,劉辰暉,趙勝蘭,萬(wàn)平民,王定發(fā),周 源,程 蕾

(武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,武漢 430208)

盡早確定母畜妊娠與否以及診斷并預(yù)測(cè)妊娠過(guò)程中胚胎丟失,以盡快對(duì)未孕母畜進(jìn)行再授精,可提高母畜繁殖效率,縮短母畜產(chǎn)犢-受孕間隔,對(duì)于提高養(yǎng)殖農(nóng)場(chǎng)的經(jīng)濟(jì)效益至關(guān)重要。妊娠相關(guān)糖蛋白(pregnancy associated glycoproteins,PAGs)是胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞合成和分泌的一類龐大的糖蛋白家族,屬于天冬氨酸蛋白酶家族成員[1-2]。在妊娠期間,反芻動(dòng)物胎兒胎盤單核滋養(yǎng)層細(xì)胞以無(wú)細(xì)胞分裂的連續(xù)核分裂形成雙核滋養(yǎng)層細(xì)胞,向母體子宮上皮細(xì)胞遷移、融合形成三核細(xì)胞所替代,并通過(guò)胞吐作用釋放包括PAGs等顆粒物質(zhì)傳遞到母體血液循環(huán)中[3-4],常作為早期妊娠診斷的生物標(biāo)志物[5-6]。目前,PAGs在妊娠期間的功能尚不清楚。因此,本文主要綜述PAGs的生物學(xué)功能及其在家畜生產(chǎn)中的應(yīng)用研究進(jìn)展,為進(jìn)一步深入研究PAGs功能和開發(fā)推廣PAGs在畜牧生產(chǎn)中應(yīng)用提供參考。

1 PAGs家族起源及特征

Butler等[7]在1982年利用免疫電泳法首次從妊娠牛胎盤中分離純化得到分子量大小為47～53 ku,等電點(diǎn)為4.0～4.4的妊娠特異性蛋白,并將其命名為妊娠特異性蛋白B(pregnancy specific protein B,PSPB)。隨后,1991年Zoli等[8]從妊娠2～6月齡的牛胎盤子葉中分離純化出分子量大小為67 ku的蛋白,命名為PAG1。PAGs屬于天冬氨酸蛋白酶超家族(aspartic proteinases superfamily,AP)的一類糖蛋白[1],其特征是識(shí)別位點(diǎn)周圍存在天冬氨酸殘基,具有典型的兩個(gè)雙葉的三級(jí)結(jié)構(gòu)(酶催化中心位于該結(jié)構(gòu)內(nèi)),與胃蛋白酶、腎素、組織蛋白酶D、組織蛋白酶E和凝乳酶氨基酸序列相似性達(dá)50%以上[9-10]。Hughes等[11]根據(jù)PAGs出現(xiàn)時(shí)間將其分為“古代組”和“現(xiàn)代組”兩個(gè)類群,“古代組”起源于8 700萬(wàn)年前,經(jīng)進(jìn)化在5 200萬(wàn)年前形成“現(xiàn)代組”。但是,“現(xiàn)代組”中大多數(shù)PAGs的酶催化中心關(guān)鍵堿基發(fā)生突變,使其失去了催化活性,如boPAG1中甘氨酸被丙氨酸所取代而不具有酶活性[12-13];“古代組”PAGs保留了酶催化中心的關(guān)鍵堿基,可能仍具有酶活性[14-15],而PAGs在母胎界面的蛋白水解酶活性在妊娠期間的功能仍不清楚,值得進(jìn)一步深入挖掘。

Green等[16]發(fā)現(xiàn),“古代組”PAGs在整個(gè)滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞和子宮內(nèi)膜的連接處表達(dá)包括oPAG-2、bPAG-2、bPAG-8、bPAG-10和bPAG-11,同時(shí)發(fā)現(xiàn)bPAG-1,bPAG-6和bPAG-7在妊娠中期至晚期都存在,而bPAG-4、bPAG-5和bPAG-9在妊娠第25天開始表達(dá),但不存在于妊娠晚期,而“現(xiàn)代組”PAGs表達(dá)局限于雙核滋養(yǎng)層巨細(xì)胞,表明PAGs在妊娠期間存在時(shí)空表達(dá)特異性。在反芻動(dòng)物中,PAGs基因家族數(shù)量龐大且復(fù)雜。在牛、綿羊、山羊、鹿和水牛中分別鑒定出22個(gè)boPAG[1,16-18]、11個(gè)ovPAG[13-17]、12個(gè)caPAG[18-19]、10個(gè)cePAG[20]和20個(gè)wtPAG成員[6,21],可能存在更多的PAGs基因有待進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)。

2 PAGs的生物學(xué)功能

2.1 免疫調(diào)節(jié)作用

“古代組”PAGs主要在母胎界面微絨毛連接處表達(dá),能夠促進(jìn)胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞和子宮上皮細(xì)胞相連接,建立免疫屏障;“現(xiàn)代組”PAGs主要在滋養(yǎng)外胚層巨細(xì)胞中表達(dá),具有調(diào)節(jié)母體免疫系統(tǒng)的作用[22]。研究發(fā)現(xiàn),使用濃度為2 400 ng·mL-1的bPAG處理骨髓祖細(xì)胞能夠抑制其增殖[23]。Roberts等[10]研究表明,PAGs可能能夠與肽競(jìng)爭(zhēng)性被主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex,MHC)識(shí)別和結(jié)合以抑制T淋巴細(xì)胞的激活從而在母胎界面發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。有研究表明,PAGs在體外能夠與綿羊子宮絲氨酸蛋白酶抑制劑(ovine uterine serpin,ovUS-1)結(jié)合,可能發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)活性[24]。Telugu等[14-15]發(fā)現(xiàn)重組表達(dá)的poPAG-1和poPAG-2具有蛋白水解活性,可能參與刺激局部生長(zhǎng)因子的生成[25-26]。Austin等[27]研究發(fā)現(xiàn),PSPB可以誘導(dǎo)牛子宮內(nèi)膜細(xì)胞中嗜中性粒細(xì)胞趨化蛋白2(granulocyte chemotactic protein-2,GCP-2)的分泌,可能參與早期植入過(guò)程中胚胎黏附、炎癥反應(yīng)和血管生成。Barbato等[28]利用RT-qPCR研究發(fā)現(xiàn),PAG-2 mRNA在人工授精后18 d妊娠牛外周血單核細(xì)胞和粒細(xì)胞中表達(dá),并且人工授精后14、18、28和40 d妊娠牛外周血單核細(xì)胞和粒細(xì)胞中PAG-2 mRNA表達(dá)水平高于空懷牛,且妊娠牛粒細(xì)胞中PAG-2 mRNA表達(dá)水平高于外周血單核細(xì)胞。Casano等[29]發(fā)現(xiàn),在圍著床期直至妊娠40 d水牛外周血單核細(xì)胞和多形核白細(xì)胞中IFN-τ和干擾素刺激基因(OAS1、MX2和ISG15)mRNA表達(dá)水平高于未妊娠水牛,且與外周血漿中PAGs的濃度呈顯著正相關(guān),說(shuō)明PAGs可能發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用參與妊娠識(shí)別與建立過(guò)程。Wallace等[30]從妊娠150 d牛胎盤子葉組織中分離出PAG-4、PAG-6和PAG-9蛋白分別處理人工授精后18 d的妊娠和空懷牛子宮外植體,發(fā)現(xiàn)未妊娠和妊娠牛子宮外植體中子宮重塑相關(guān)基因(EMMPRIN、MMP1、MMP3、MMP7、MMP9、PLAU和TIMP2)和干擾素刺激基因(IFI6和ISG15)mRNA表達(dá)水平在PAGs處理24或96 h后上調(diào)表達(dá),同樣地,CXCL5和PTGES基因mRNA也上調(diào)表達(dá),與Austin等[27]的研究結(jié)果相一致,說(shuō)明PAGs通過(guò)影響子宮內(nèi)膜中細(xì)胞外基質(zhì)周轉(zhuǎn)參與子宮重塑和胎兒侵襲從而形成一個(gè)有利于胎盤形成的微環(huán)境。Hooshmandabbasi等[31]研究發(fā)現(xiàn),與胎盤正常娩出的奶牛相比,胎盤滯留奶牛個(gè)體中PAGs陽(yáng)性雙核滋養(yǎng)層細(xì)胞數(shù)量和“現(xiàn)代組”PAGsmRNA表達(dá)水平更高,而在血清中無(wú)顯著差異,可能沉積在母體間隔基質(zhì)中的“現(xiàn)代組”PAGs發(fā)揮局部的免疫抑制作用進(jìn)而延遲胎盤的脫落進(jìn)程。以上研究表明PAGs可能參與妊娠的識(shí)別與建立、妊娠維持以及產(chǎn)犢前后免疫功能的抑制。

2.2 促黃體生成作用

研究顯示,反芻動(dòng)物妊娠期間孕酮的來(lái)源是黃體和胎盤,前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)發(fā)揮著抗黃體溶解和促黃體生成的作用[32]。Del Vecchio等[33]用PSPB或與催產(chǎn)素一起對(duì)發(fā)情周期第16天的子宮內(nèi)膜外植體進(jìn)行處理,發(fā)現(xiàn)前列腺素E2和前列腺素F2α(prostaglandin F2α,PGF2α)的分泌增加[34],同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)用PSPB處理牛黃體細(xì)胞后不影響催產(chǎn)素的產(chǎn)生,但會(huì)促進(jìn)孕酮和PGE2的分泌,PGF2α分泌量也升高[35]。Weems等[36]也發(fā)現(xiàn),PSPB處理妊娠88～90 d綿羊黃體細(xì)胞顯著提高PGE2和孕酮的分泌,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)PSPB可能通過(guò)刺激卵巢黃體、胎盤和子宮肉阜組織中PGE2分泌來(lái)調(diào)節(jié)妊娠50～90 d黃體中孕酮分泌[37-39]。上述結(jié)果表明,PSPB作為一種促黃體生成因子通過(guò)刺激胎盤/子宮肉阜中PGE2分泌進(jìn)而調(diào)節(jié)黃體中孕酮的合成以維持妊娠。

綜上所述,PAGs可能參與母胎界面的免疫調(diào)節(jié)以保護(hù)胎兒免受免疫排斥以及妊娠終止時(shí)胎兒的及時(shí)娩出,同時(shí)也參與妊娠相關(guān)激素的合成來(lái)為胚胎提供成功著床的條件和穩(wěn)定發(fā)育的環(huán)境。

3 PAGs在家畜生產(chǎn)中的應(yīng)用

3.1 診斷妊娠與否

在規(guī)?；?、現(xiàn)代化牧場(chǎng)的飼養(yǎng)管理中,提高母畜產(chǎn)犢率、保持理想的產(chǎn)犢間隔決定著養(yǎng)殖企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。母畜配種后,及時(shí)且準(zhǔn)確的妊娠診斷可以有效縮短配種期進(jìn)而保證較短的空懷周期,從而有效地提高繁殖效率。即使由經(jīng)驗(yàn)豐富的技術(shù)人員進(jìn)行直腸觸診,而直至人工授精后35～40 d仍難以準(zhǔn)確判斷妊娠與否。

近年以來(lái),由于分子生物學(xué)方法的快速發(fā)展,已有許多學(xué)者嘗試鑒定牛羊等妊娠的生物標(biāo)志物。PAGs一直是主要的研究對(duì)象,且商業(yè)化的妊娠診斷試劑盒已經(jīng)應(yīng)用于牛羊等早期妊娠診斷[40-42],目前,美國(guó)IDEXX和BioTracking公司均有基于PAGs或PSPB的ELISA商品化試劑盒,均能在配種28 d后檢測(cè)奶牛是否妊娠。Commun等[43]利用基于2種妊娠相關(guān)糖蛋白的ELISA方法對(duì)人工授精后16、30、41和53 d奶牛血清、血漿和牛奶進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)人工授精后30～53 d檢測(cè)妊娠準(zhǔn)確度較高。Barbato等[44]利用RT-qPCR對(duì)水牛人工授精后0、18、28、40和75 d血細(xì)胞中PAG-2 mRNA進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)PAG-2 mRNA在妊娠18 d、D28(+)D40(-)和D28(-)D40(-)組中表達(dá),但其水平低于D28(+)D40(+)組,且與PAG-1相比更早地在外周血細(xì)胞中被檢測(cè)到,可用于研究早期妊娠和胚胎死亡。據(jù)報(bào)道,PAG-1在母體血清中表現(xiàn)出較長(zhǎng)的半衰期,可在產(chǎn)后80～100 d檢測(cè)到,從而使在產(chǎn)后60 d內(nèi)配種的動(dòng)物中產(chǎn)生假陽(yáng)性[45]。Lu等[46]利用血清輔助的指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)獲得ovPAG7特異性結(jié)合的DNA單鏈適配體,將其用于人工授精后22和28 d母羊血清檢測(cè)發(fā)現(xiàn)診斷靈敏度、特異性和準(zhǔn)確性較高,是檢測(cè)母羊妊娠的有效方法。李志明等[47-48]通過(guò)原核表達(dá)方式獲得PAG-6蛋白制備了多克隆抗體,建立了一種牛妊娠相關(guān)糖蛋白6快速檢測(cè)試紙條方法,用于奶牛早期妊娠診斷效果良好。

3.2 預(yù)測(cè)和診斷胚胎附著、胚胎丟失、胚胎數(shù)量以及性別

研究顯示,在胚胎附植至妊娠期間胎盤雙核滋養(yǎng)層細(xì)胞約占所有滋養(yǎng)層細(xì)胞數(shù)量的20%,而在妊娠末期數(shù)量降低[49]。胎盤發(fā)育因胎兒的數(shù)量、性別、大小和體重而異,胎盤雙核滋養(yǎng)層細(xì)胞的數(shù)量隨著胎盤質(zhì)量和胎兒數(shù)量的增加而增加。Middleton等[50]使用BioPRYN ELISA試劑盒對(duì)人工授精后15～35 d的小母牛和泌乳奶牛血清中PSPB進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)與泌乳奶牛相比,小母牛的PSPB濃度增加時(shí)間更早,循環(huán)濃度更高,以血清PSPB的OD水平從基線開始升高≥10%且隨后2 d從基線繼續(xù)升高≥10%的那一天作為胚胎附著的標(biāo)志,與初產(chǎn)或經(jīng)產(chǎn)奶牛相比,未生育小母牛的胚胎附著時(shí)間更早。El Amiri等[51]使用放射免疫系統(tǒng)對(duì)人工授精后0～49 d母羊血漿和羊奶中PAGs濃度進(jìn)行測(cè)定,發(fā)現(xiàn)在人工授精后20 d的妊娠母羊血漿和羊奶中可檢測(cè)到PAGs存在且雙胎妊娠血漿和羊奶中PAGs濃度顯著高于單胎妊娠。Alkan等[52]利用IDEXX試劑盒對(duì)179頭妊娠40～60 d母羊進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)在妊娠早期40～50 d雙胎妊娠母羊PAGs濃度高于單胎妊娠母羊,而在不同妊娠時(shí)間攜帶雄性和雌性胎兒的母羊中PAGs濃度之間無(wú)顯著差異,可能是雙胎妊娠具有多個(gè)附植部位,胎盤體積增大,雙核滋養(yǎng)層細(xì)胞數(shù)量增加,導(dǎo)致PAGs分泌量增加。Ranilla等[53]發(fā)現(xiàn),在懷孕第19、20和21周雄性胎兒的母羊的PAGs濃度高于攜帶雌性胎兒的母羊,與Alkan等[52]的研究結(jié)果不一致,可能與不同的妊娠時(shí)期有關(guān)。

在妊娠期間,胚胎死亡可能發(fā)生在早期或晚期,被認(rèn)為是造成繁殖失敗的主要原因[54]。研究顯示,在接受胚胎移植和人工授精后28～30 d妊娠成功建立并維持妊娠至60～72 d的奶牛血清中bPAGs濃度顯著高于同一時(shí)間妊娠成功建立但未維持妊娠[55]。Pohler等[56]利用邏輯回歸模型發(fā)現(xiàn),在肉牛妊娠28 d血清中bPAGs濃度大于7.9或低于0.72 ng·mL-1時(shí)預(yù)測(cè)胚胎維持至第95天存活或死亡的準(zhǔn)確率高達(dá)95%以上,可作為牛晚期胚胎死亡的標(biāo)志物。Peixoto等[57]發(fā)現(xiàn),人工授精后37 d雙胎妊娠和胚胎丟失荷斯坦奶牛血漿PAGs的濃度無(wú)明顯變化且其不能有效地預(yù)測(cè)荷斯坦奶牛胚胎丟失和雙胎妊娠的閾值。以上研究表明,不同的抗體組合能夠識(shí)別不同的PAGs或不同數(shù)量的PAGs異構(gòu)體,檢測(cè)方法不同和抗體特異性差異可能會(huì)影響妊娠丟失診斷的準(zhǔn)確性。此外,Panasiewicz等[58]對(duì)雜交母豬pPAG2-Ls基因研究共發(fā)現(xiàn)196個(gè)SNPs,包括9個(gè)外顯子和8個(gè)(A～H)內(nèi)含子,其中位于第6外顯子雙倍型(657C>T/749G>C)導(dǎo)致多肽前體中氨基酸替換(Asp220→Asn和Ser250→Thr)與產(chǎn)活仔豬數(shù)量增加有關(guān),內(nèi)含子F中504G>A與產(chǎn)活仔豬數(shù)和斷奶仔豬數(shù)增加有關(guān),可為豬選種選育提供重要參考。

3.3 監(jiān)測(cè)胎兒的生長(zhǎng)發(fā)育和胎盤功能

PAGs除了作為妊娠診斷的生物標(biāo)志物外,也可用于監(jiān)測(cè)胎兒的生長(zhǎng)發(fā)育和胎盤的功能。Lpez-Gatius等[59]研究發(fā)現(xiàn),感染犬新孢子蟲發(fā)生流產(chǎn)和木乃伊胎兒的奶牛血清中PAG-1濃度較低或無(wú)法檢測(cè),說(shuō)明PAG-1可能是評(píng)估胎兒-胎盤狀態(tài)的有效指征。García-Ispierto等[60]發(fā)現(xiàn),妊娠120 d荷斯坦奶牛血漿PAG-2濃度可以作為感染犬新孢子蟲流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)的指標(biāo),當(dāng)數(shù)值<4.5 ng·mL-1表明慢性感染的動(dòng)物流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)高。Mur-Novales等[61-62]對(duì)妊娠110 d懷孕母牛感染犬新孢子蟲進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)未流產(chǎn)母牛在感染14 d內(nèi)血漿PAG-1和PAG-2水平呈現(xiàn)下降,感染42 d單核和雙核滋養(yǎng)層細(xì)胞比例減少以及胎兒羊水和尿囊中PAG-1和PAG-2濃度顯著高于未感染胎兒,且受感染流產(chǎn)母牛血漿中PAGs濃度急劇降低,說(shuō)明PAGs可能與感染后不同程度的胎盤損傷和無(wú)法維持的妊娠有關(guān)。此外,Lear等[63]對(duì)妊娠65 d母羊接種非細(xì)胞病變性牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)株1b,發(fā)現(xiàn)妊娠80 d感染BVDV的母羊和胎兒血清中PAG-1濃度明顯降低以及滋養(yǎng)細(xì)胞損傷,表明PAG-1濃度可作為BVDV感染期間評(píng)估胎盤功能的指標(biāo)。越來(lái)越多的研究表明,PAGs濃度變化與胎兒存活和胎盤健康有關(guān),但仍需進(jìn)一步研究母體-胎兒不良妊娠結(jié)局與PAGs產(chǎn)生及功能改變之間的關(guān)系進(jìn)而闡明PAGs作為評(píng)估母胎單位的生物標(biāo)志物。

4 展 望

PAGs是偶蹄目動(dòng)物胎盤產(chǎn)生的特異性糖蛋白家族,其作為妊娠診斷的生物標(biāo)志物具有妊娠早期特異性表達(dá)和能夠進(jìn)入母體血液循環(huán)等特點(diǎn),近年來(lái)被廣泛研究。雖然PAGs在胎盤-子宮界面發(fā)揮多種生物學(xué)功能,但是大多數(shù)PAGs家族成員在妊娠期間的表達(dá)表現(xiàn)為復(fù)雜的時(shí)間和空間表達(dá)模式,并且釋放到母體血液中為作用于靶組織和靶細(xì)胞提供了眾多的可能性,并且提純單一PAGs家族成員難度較大。目前已有多種PAGs分子診斷試劑被開發(fā),但因面臨其靈敏度、準(zhǔn)確性和特異性不強(qiáng)等問題,制約了PAGs在畜牧生產(chǎn)中的發(fā)展應(yīng)用。針對(duì)這一問題,可通過(guò)對(duì)妊娠不同時(shí)期表達(dá)的PAGs進(jìn)行天然提純,制備并篩選單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞以獲得不同PAGs成員抗體或核酸適配體,對(duì)不同PAGs成員抗體或核酸適配體進(jìn)行組裝實(shí)現(xiàn)對(duì)母畜妊娠診斷和監(jiān)測(cè)胎兒生長(zhǎng)發(fā)育。隨著生物技術(shù)的不斷創(chuàng)新與發(fā)展,可利用基因組、蛋白組、代謝組等多組學(xué)技術(shù)對(duì)雙核或多核滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行研究以鑒定新的妊娠診斷標(biāo)志物;可利用生物信息學(xué)等技術(shù)豐富PAGs分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)以及探究PAGs家族在妊娠維持和胎盤發(fā)育中的功能,這將對(duì)于畜牧業(yè)的長(zhǎng)遠(yuǎn)發(fā)展具有十分深遠(yuǎn)的意義。