趙 亮，王新葉，羅貞標(biāo)，江 璐，吳福勇，鐘艷霞，王相勇

（茅臺(tái)學(xué)院釀酒工程系，貴州 遵義 564507）

大曲作為白酒釀造的起始發(fā)酵劑，可為酒醅提供充足的酶系，如各類(lèi)糖化酶、蛋白酶、纖維素酶等；另外還可引入種類(lèi)多樣的功能性微生物。醬香型大曲以小麥作為唯一原料，經(jīng)人工踩制成曲磚后，轉(zhuǎn)入曲倉(cāng)進(jìn)行為期40 d的開(kāi)放式發(fā)酵，發(fā)酵完成后再經(jīng)3～6 個(gè)月的儲(chǔ)存老熟方可投入使用[1]。近年來(lái)，利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)大曲發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行多方面研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)原料和場(chǎng)地環(huán)境是大曲微生物的主要來(lái)源。此外，在發(fā)酵過(guò)程中，微生物新陳代謝產(chǎn)生的內(nèi)源生物熱、大曲水分含量和酸度的變化，推動(dòng)微生物間相互作用。在此過(guò)程中一些雜菌被消亡殆盡，而一些對(duì)釀酒有作用的微生物在大曲中被富集保留，最終形成穩(wěn)定的功能微生物區(qū)系[2-5]。這些微生物區(qū)系在發(fā)酵過(guò)程中經(jīng)自身代謝產(chǎn)生多種酶系、風(fēng)味及其風(fēng)味前體物質(zhì)。其中產(chǎn)出的酶系具有糖化力、液化力、酯化力和蛋白質(zhì)分解能力。可以將大曲原料中的大分子淀粉和蛋白質(zhì)分解成小分子的還原糖和氨基酸，為微生物生長(zhǎng)繁殖提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并通過(guò)微生物代謝產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)[6-8]。因此，大曲中微生物區(qū)系的組成和豐度水平對(duì)下游釀酒環(huán)節(jié)的代謝物形成及豐富度影響顯著。

茶葉是我國(guó)傳統(tǒng)飲品，具有多種保健功效，也是貴州省重要的經(jīng)濟(jì)作物。鮮茶葉中有機(jī)成分主要包括纖維素、果膠質(zhì)、蛋白質(zhì)、咖啡堿、多元酚類(lèi)、兒茶素、有機(jī)酸等[9]。茶葉經(jīng)過(guò)發(fā)酵后，酚氨比降低，芳香類(lèi)物質(zhì)增加，能溶入許多微生物代謝活性物質(zhì)以及微生物菌體，茶葉品質(zhì)得以改善，例如普洱茶和黑茶。因此，茶葉的感官特性和化學(xué)成分和大曲類(lèi)似，與微生物發(fā)酵密不可分。同時(shí)，大曲中發(fā)現(xiàn)的優(yōu)勢(shì)微生物菌群與茶葉發(fā)酵過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)微生物菌群也有眾多相同之處[10-15]。在大曲原料中添加天然植物成分的代表是董香型白酒的小曲和大曲，曲中130余種天然植物的添加為成曲過(guò)程培養(yǎng)了大量有益微生物，并衍生出許多能夠強(qiáng)身健體的化合物和呈香、呈味物質(zhì)，賦予了董酒神奇的綜合養(yǎng)生功能和幽雅舒適的天然香味?；谶@個(gè)理念，白蕊[16]在清香型白酒的大曲原料中加入茶樹(shù)花，并進(jìn)行相關(guān)研究，在加入茶樹(shù)花的成曲中檢測(cè)到茶樹(shù)花的一些特征香氣成分苯乙酮和α-苯乙醇等風(fēng)味物質(zhì)，豐富了清香型大曲的風(fēng)味成分。因此，對(duì)于添茶曲的研究可為多原料制曲和茶葉在白酒釀造方面的應(yīng)用提供理論依據(jù)和工藝指導(dǎo)。

綜上所述，本研究向醬香型大曲原料中加入一定比例的貴州綠茶，進(jìn)行為期40 d的發(fā)酵，在此過(guò)程中對(duì)添加不同比例綠茶的大曲進(jìn)行微生物群落和內(nèi)源理化指標(biāo)的綜合分析，旨在揭示發(fā)酵過(guò)程中：1）不同比例添茶曲理化因素和群落多樣性變化特征；2）茶葉添加比例對(duì)群落結(jié)構(gòu)和演替的影響；3）驅(qū)動(dòng)各添茶曲理化特征變化的重要菌群。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

硬質(zhì)小麥來(lái)自貴州仁懷市有機(jī)小麥，綠茶為貴州省湄潭縣綠茶。

DNA提取試劑盒MP FastDNA?SPIN kit for soil美國(guó)MP Biochemicals公司；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）、TBE（Tris-硼酸-乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA））緩沖液、異丙醇（分析純）、瓊脂糖 北京索萊寶科技有限公司；引物合成 北京百邁客生物科技有限公司；鹽酸、碘化鉀、五水合硫酸銅、三水合六氰鐵酸鉀、三水合乙酸鈉、硫酸、冰乙酸 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉、次甲基藍(lán)、葡萄糖、碘、酒石酸鉀鈉、可溶性淀粉 天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Sigma 公司；Gene Amp?9700型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國(guó)ABI公司；DYY-8C型電泳儀北京六一儀器廠；SW-CJ-1F型超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 國(guó)華電器有限公司；Illumina MiSeq PE300測(cè)序平臺(tái) 北京百邁客生物科技有限公司；MDF-U54V醫(yī)用低溫箱 松下健康醫(yī)療器械株式會(huì)社；PHS-3C pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；DK-98-1電子萬(wàn)用爐 天津市泰斯特儀器有限公司；FA2004N電子天平 上海菁海儀器有限公司；WP-CP-GHS-30微量分析型超純水機(jī) 四川沃特爾水處理設(shè)備有限公司；DGG-9140AD電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州潤(rùn)華電器有限公司；CL-2磁力加熱攪拌器 北京科偉永興儀器有限公司；ZNHW智能控溫電熱套 上海力辰邦西儀器科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 曲塊制備

以硬質(zhì)小麥、綠茶為原料，如流程圖1A所示，按照傳統(tǒng)醬香大曲加工工藝（潤(rùn)料、粉碎、拌料、成型、入倉(cāng)發(fā)酵）[17]，制成原曲（純小麥，不添加綠茶）、10%（按曲塊質(zhì)量的10%添加綠茶）添茶曲、20%添茶曲（按曲塊質(zhì)量的20%添加綠茶）和30%添茶曲（按曲塊質(zhì)量的30%添加綠茶），共4 類(lèi)曲，每類(lèi)曲制作4 個(gè)曲塊。每個(gè)曲塊質(zhì)量為1500 g，拌料加水675 g（水占曲塊總質(zhì)量45%），母曲用量150 g（10%）。曲塊壓制好后，放入紙箱，模擬曲倉(cāng)發(fā)酵。具體制備過(guò)程如圖1B所示，準(zhǔn)備好原料綠茶和小麥，磨碎后（a～c）與母曲和水按比例拌合，拌合時(shí)根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求的茶葉添加量（0%、10%、20%和30%）制備曲塊拌料（d～e）。拌料結(jié)束后，將拌好的曲料放入模具手工壓制定型，制成四周緊、中間松的龜背形曲塊（f～i）。準(zhǔn)備一紙箱用來(lái)模擬曲倉(cāng)，箱底鋪滿(mǎn)稻草（作用同曲倉(cāng)中的底草），曲塊用稻草包裹，采取平放的方式在箱中從下到上放置4 層，每層4 個(gè)曲塊，每層間再用鋪平的稻草相隔（j～k）。曲塊放置好后，箱口合攏，箱子側(cè)邊打孔，并從側(cè)孔置入溫度計(jì)，插入到曲塊中，用于監(jiān)測(cè)曲塊溫度（l），開(kāi)始為期40 d的發(fā)酵。

圖1 大曲制備流程（A）及制作過(guò)程（B）圖Fig.1 Flow chart of Daqu preparation process (A) and production procedures (B)

1.3.2 曲樣收集

4 類(lèi)曲塊分別在入倉(cāng)發(fā)酵的第1天（Day 1）、第6天（Day 6）、第12天（Day 12）、第15天（Day 15）、第30天（Day 30）和第40天（Day 40）進(jìn)行取樣。取樣時(shí)分別在曲塊的上表面（隆起面向內(nèi)1 cm）、下表面（曲底面向內(nèi)1 cm）和曲心（曲塊中央）各取1 個(gè)部位的樣品，3 個(gè)部位樣品混合后作為對(duì)應(yīng)時(shí)段的一個(gè)曲樣，每個(gè)時(shí)段收集3 個(gè)曲樣，最終獲得72 個(gè)（4 種類(lèi)型曲×6 個(gè)時(shí)段×3 個(gè)曲樣）大曲樣品。

1.3.3 理化指標(biāo)檢測(cè)

曲塊溫度從插入曲塊的溫度計(jì)直接讀取獲得。酸度、糖化力、淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)和水分含量按照QB/T 4257—2011《釀酒大曲通用分析方法》進(jìn)行測(cè)定[18]。

1.3.4 曲塊中微生物總DNA提取

參照戴奕杰等[19]方法對(duì)大曲樣品進(jìn)行預(yù)處理。預(yù)處理后得到的細(xì)胞沉淀使用DNA提取試劑盒MP FastDNA?SPIN kit for soil，按說(shuō)明書(shū)提示，提取大曲樣品中微生物細(xì)胞總DNA。

1.3.5 細(xì)菌16S rRNA基因擴(kuò)增

使用引物319F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）[20]對(duì)細(xì)菌16S rRNA基因V3～V4可變區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增程序：98 ℃預(yù)變性30 s，35 個(gè)循環(huán)（98 ℃變性10 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s），72 ℃終延伸10 min。凝膠電泳：2%瓊脂糖凝膠，核酸染料（GenGreen），電壓90 V，電泳時(shí)間30 min。

1.3.6 Illumina MiSeq測(cè)序

采用Illumina二代測(cè)序技術(shù)，基于Illumina MiSeq PE300測(cè)序平臺(tái)，由北京百邁客生物科技有限公司完成測(cè)序。

1.3.7 測(cè)序數(shù)據(jù)處理

PE300雙端測(cè)序reads使用FLASH拼接，根據(jù)Barcode區(qū)分序列樣本來(lái)源。使用Trimmomatic v0.33軟件，對(duì)測(cè)序得到的Raw Reads進(jìn)行過(guò)濾。Cutadapt 1.9.1軟件進(jìn)行引物序列的識(shí)別與去除，得到不包含引物序列的Clean Reads。使用Usearch v10軟件，通過(guò)overlap對(duì)每個(gè)樣品的Clean Reads 進(jìn)行拼接，然后根據(jù)不同區(qū)域的長(zhǎng)度范圍對(duì)拼接后數(shù)據(jù)進(jìn)行長(zhǎng)度過(guò)濾。使用QIIME2中的DATA2插件進(jìn)行去噪，雙端序列拼接并去除嵌合體序列，得到最終有效數(shù)據(jù)（Effective Reads），并獲得擴(kuò)增子序列變異體（amplicon sequence variants，ASVs）。從每個(gè)ASV中選取質(zhì)量最好的序列作為對(duì)應(yīng)ASV的代表序列，以Silva（release 132）為參考數(shù)據(jù)庫(kù)使用樸素貝葉斯分類(lèi)器對(duì)代表序列進(jìn)行分類(lèi)學(xué)注釋。生成的ASVs_table文件除去總序列數(shù)小于5的低豐度ASVs，并利用R軟件對(duì)ASVs序列數(shù)進(jìn)行重抽樣，保證每個(gè)樣品的總序列數(shù)完全一致，最終獲得用于統(tǒng)計(jì)分析ASVs_table文件。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

理化指標(biāo)組間差異性檢驗(yàn)使用方差分析，組間兩兩比較使用最小顯著差異（least significant difference，LSD）法；α多樣性基于5 種指數(shù)，分別從群落成分（Shannon指數(shù)）、物種豐富度（Richness指數(shù)和Chao1指數(shù)）和系統(tǒng)進(jìn)化多樣性（群落內(nèi)的物種與其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最近的物種間的距離（mean nearest taxon distance，MNTD）和最近親緣指數(shù)（nearest taxon index，NTI））[21-22]3 個(gè)角度來(lái)衡量。α多樣性指數(shù)組間差異性檢驗(yàn)使用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，組間兩兩比較使用Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)。理化指標(biāo)與α多樣性之間相關(guān)性使用Spearman相關(guān)性檢驗(yàn)進(jìn)行分析。β多樣性基于表征系統(tǒng)進(jìn)化演替的GUniFrac距離[23]和群落成分演替的Bray-Curtis距離衡量。β多樣性在組間的差異性分析基于非參數(shù)多元方差分析（Adonis）和相似性檢驗(yàn)（Anosim），Adonis和Anosim模型顯著性均基于9999 次置換檢驗(yàn)獲得。使用Bioenv[24]分析法篩選對(duì)系統(tǒng)進(jìn)化演替存在顯著相關(guān)的理化指標(biāo)，并將篩選出的指標(biāo)整體轉(zhuǎn)化成歐氏距離，以表示大曲理化特征變化。使用隨機(jī)森林模型推斷驅(qū)動(dòng)大曲理化特征變化的優(yōu)勢(shì)屬。

上述所有統(tǒng)計(jì)、多樣性指數(shù)計(jì)算及相關(guān)作圖均使用R語(yǔ)言完成，涉及的主要軟件有BiodiversityR[25]、Vegan[26]、RAM[27]、OTUtable[28]、ggplot2[29]、agricolae[30]、picante[31]、A3[32]和rfPermute[33]。

2 結(jié)果與分析

2.1 理化指標(biāo)變化趨勢(shì)

糖化力、溫度、淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)、酸度和水分含量5 種指標(biāo)的變化趨勢(shì)如圖2A（具體數(shù)值見(jiàn)表1），4 種曲雖然呈現(xiàn)出大致相似的變化趨勢(shì)，但在不同時(shí)段的高低水平存在顯著差異。4 種曲的糖化力從Day 1逐漸降至Day 12，且此階段始終原曲＞10%添茶曲＞20%添茶曲＞30%添茶曲（P＜0.001）。表明大曲中的耗氧微生物大量繁殖，致使溫度和酸度升高，曲塊中的微生物多樣性和數(shù)量減少，導(dǎo)致糖化力逐步下降；此外，茶葉添加量從10%至30%依次增多，致使各曲中淀粉比例相對(duì)減少，進(jìn)而降低了淀粉中原有糖化酶含量，因此糖化力在Day 1至Day 12這個(gè)階段（即前緩期和中挺期），始終維持原曲＞10%添茶曲＞20%添茶曲＞30%添茶曲的高低模式。Day 12至Day 40（即后緩落期），酸度和溫度逐漸下降，微生物在歷經(jīng)曲內(nèi)高溫和高酸后重啟生長(zhǎng)，糖化力隨之回升，發(fā)酵結(jié)束的Day 40，糖化力表現(xiàn)出20%添茶曲＞30%添茶曲＞10%添茶曲＞原曲的模式，且差異極顯著（P＜0.001）。這個(gè)結(jié)果表明，在發(fā)酵的前緩和中挺期，大曲中淀粉的相對(duì)比例可能主導(dǎo)各時(shí)段的糖化力高低。一旦進(jìn)入后緩落期，曲中經(jīng)高酸和高溫篩選的微生物類(lèi)群開(kāi)始因茶葉比例的不同，在不同曲塊中形成特定群，進(jìn)而主導(dǎo)各時(shí)段糖化力的高低。水分含量從Day 1至Day 40始終呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，且從Day 6至Day 40均表現(xiàn)出20%添茶曲＞10%添茶曲＞30%添茶曲＞原曲的模式，說(shuō)明添加茶葉可以提高大曲的持水性，且20%的添茶比例對(duì)大曲的持水作用最強(qiáng)。酸度在起始發(fā)酵Day 1時(shí)30%添茶曲＞20%添茶曲＞10%添茶曲＞原曲，雖發(fā)酵過(guò)程4 類(lèi)曲酸度高低有變動(dòng)，但發(fā)酵結(jié)束時(shí)4 類(lèi)曲的酸度仍恢復(fù)到起始時(shí)的水平，這可能與茶葉中本身的有機(jī)酸含量有關(guān)，即添茶比例越高，酸度隨之增高。4 類(lèi)曲溫度變化趨勢(shì)相同，且各階段沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的溫度區(qū)別。

表1 各類(lèi)曲理化指標(biāo)Table 1 Physicochemical indicators of Daqu during fermentation

圖2 各類(lèi)曲理化指標(biāo)（A）和α多樣性指數(shù)（B）變化趨勢(shì)圖Fig.2 Trends of physicochemical parameters (A) and α diversity indices (B) of Daqu during fermentation

2.2 群落多樣性

2.2.1α多樣性分析

如圖2B所示（具體數(shù)值見(jiàn)表2），4 類(lèi)大曲在5 種多樣性指數(shù)上的變化趨勢(shì)均表現(xiàn)出一定的不同，并且利用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Shannon、Chao1、MNTD、Richness和NTI各指數(shù)分別在Day 1、Day 6、Day 30和Day 40這4 個(gè)時(shí)段展現(xiàn)出不同的差異變化，說(shuō)明大曲原料中加入茶葉可改變曲中微生物的群落演替特征，且這種變化與原料中加入茶葉的相對(duì)含量有關(guān)。不同曲間Shannon和NTI兩種指數(shù)在Day 1存在顯著性差異（P＜0.05），10%添茶曲的Shannon指數(shù)最高，并顯著高于原曲（P＜0.05，Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)）；20%添茶曲的NTI最高，并顯著高于原曲（P＜0.05）；原曲的Shannon指數(shù)和NTI最低。這些結(jié)果表明茶葉的加入可引入更豐富的微生物成分，提供群落組成多樣性，并同時(shí)減弱近緣物種的聚集程度，從群落組成和譜系豐富度兩方面提高曲中群落多樣性。此外還發(fā)現(xiàn)，原料中茶葉的加入量并不與多樣性呈比例關(guān)系，如Day 1時(shí)，10%添茶曲的Shannon指數(shù)最高（4.18±0.50），其次為30%添茶曲（3.73±0.52），以及20%添茶曲（3.47±0.58）；Day 6時(shí)，20%添茶曲和原曲的Richness均顯著高于10%和30%添茶曲。這說(shuō)明大曲中微生物多樣性的高低與大曲中小麥和茶葉的相對(duì)比例關(guān)系緊密。綜合上述結(jié)果可以說(shuō)明，原料中加入茶葉可以改變大曲起始發(fā)酵時(shí)的群落結(jié)構(gòu)，且加入茶葉的比例不同，會(huì)出現(xiàn)不同水平的群落多樣性，并使發(fā)酵全過(guò)程群落演替規(guī)律出現(xiàn)不同的趨勢(shì)。在先前研究中，曾在小麥中摻入其他淀粉類(lèi)原料，如青稞、紫小麥等，可以提高大曲中群落多樣性水平[17]。類(lèi)似地，曾橋等[10]利用不同原料在同一加工條件下發(fā)現(xiàn)茯磚茶活性成分和微生物多樣性呈顯著差異。本研究使用茶葉這種非淀粉類(lèi)原料進(jìn)行研究，同樣發(fā)現(xiàn)可改變大曲中微生物多樣性水平，表明無(wú)論是淀粉類(lèi)或是茶葉這種纖維素類(lèi)原料，與小麥進(jìn)行多原料制曲，都對(duì)微生物群落多樣性和發(fā)酵演替規(guī)律影響顯著。

表2 各類(lèi)曲α多樣性指數(shù)Table 2 α Diversity indices of Daqu at different fermentation times

2.2.2 理化指標(biāo)與α多樣性相關(guān)性

理化指標(biāo)與5 種多樣性指數(shù)間Spearman相關(guān)性如圖3所示。除溫度外，其他理化指標(biāo)與Shannon、Richness、NTI和MNTD各指數(shù)在4 種曲中存在不同程度的相關(guān)性，說(shuō)明溫度不是影響各4 類(lèi)曲群落多樣性特征的決定因素。此外，表征群落內(nèi)個(gè)體間譜系距離的MNTD在4 類(lèi)曲中均存在顯著相關(guān)，表明各類(lèi)曲中特有的微生物系統(tǒng)進(jìn)化結(jié)構(gòu)是影響大曲理化特征變化的主要因素。MNTD與酸度僅在添茶曲中存在顯著相關(guān)，且為正相關(guān)（r＝0.60～0.66，P＜0.05），表明添茶曲的酸度變化可能除了與茶葉本身引入的有機(jī)酸有關(guān)外，還與茶葉引入的特定微生物區(qū)系有關(guān)，且微生物個(gè)體間譜系越遠(yuǎn)緣，酸度越高。從而隨著MNTD的升高，添茶量較多的20%和30%添茶曲中的糖化力顯著降低（r＝-0.55～-0.52，P＜0.05）。表征群落譜系聚集程度的NTI同時(shí)與原曲和10%添茶曲的淀粉和水分含量呈顯著負(fù)相關(guān)（r＝-0.55～-0.49，P＜0.05）。NTI越高則群落譜系聚集程度越弱，相反會(huì)使曲內(nèi)的淀粉和水分含量降低，表明群落譜系聚集程度的減弱可能會(huì)增加發(fā)酵過(guò)程淀粉消耗量和水分散失。

圖3 各類(lèi)曲理化指標(biāo)與α多樣性指數(shù)間Spearman相關(guān)性熱圖Fig.3 Heatmaps showing Spearman correlations between physicochemical parameters and α-diversity indices of Daqu

2.2.3β多樣性

Adonis多元方差分析對(duì)整個(gè)數(shù)據(jù)集檢驗(yàn)結(jié)果顯示，大曲類(lèi)型（GUniFrac：R2＝0.06，P＝0.012；Bray-Curtis：R2＝0.13，P＜0.001）、發(fā)酵時(shí)段（GUniFrac：R2＝0.33，P＜0.001；Bray-Curtis：R2＝0.34，P＜0.001），以及兩者交互效應(yīng)（GUniFrac：R2＝0.19，P＝0.020；Bray-Curtis：R2＝0.20，P＜0.001）對(duì)β多樣性均存在顯著性貢獻(xiàn)，表明不同大曲在發(fā)酵過(guò)程中可形成特定的群落結(jié)構(gòu)。按發(fā)酵時(shí)段對(duì)整個(gè)數(shù)據(jù)集分割，使用Adonis多元方差分析和相似性檢驗(yàn)（Anosim）進(jìn)一步分析各時(shí)段不同大曲間群落結(jié)構(gòu)差異（表3），發(fā)現(xiàn)在Day 6、Day 12和Day 40這3 個(gè)時(shí)段兩類(lèi)距離矩陣都呈現(xiàn)顯著性差異，且Bray-Curtis距離矩陣在Day 15也出現(xiàn)顯著性差異。這個(gè)結(jié)果進(jìn)一步體現(xiàn)，在發(fā)酵的中挺期和后緩落階段，不同大曲間的群落會(huì)發(fā)生顯著分化。

表3 各類(lèi)曲在不同時(shí)段群落結(jié)構(gòu)差異性分析Table 3 Analysis of difference in community structure between different Daqu samples at fermentation time

2.3 群落結(jié)構(gòu)與演替

2.3.1 群落結(jié)構(gòu)特征

4 類(lèi)曲中共有4 種相對(duì)豐度＞1%的優(yōu)勢(shì)門(mén)，分別為變形桿菌門(mén)（Proteobacteria；各類(lèi)曲中總占比48.0%～59.7%）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes；32.4%～44.8%）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidota；2.6%～4.1%）和放線(xiàn)菌門(mén)（Actinobacteriota；2.0%～2.6%），這些優(yōu)勢(shì)門(mén)在先前針對(duì)多原料制曲[17]、茶葉發(fā)酵[10]，以及酒醅[34]的研究中也被發(fā)現(xiàn)是重要的優(yōu)勢(shì)菌群，表明無(wú)論是原曲、添茶曲，甚至是酒醅中，優(yōu)勢(shì)門(mén)相似。然而，它們?cè)诟髑胸S度變化趨勢(shì)明顯不同（圖4）。以厚壁菌門(mén)為例，在原曲中Day 1時(shí)相對(duì)豐度最低，僅占5.4%，到Day 6升至全時(shí)段最高60.5%，從Day 12到Day 40變化幅度不明顯，維持在41.0%～49.5%之間；在10%添茶曲中，Day 1時(shí)相對(duì)豐度最低（17.5%），之后逐漸上升，Day 6至Day 15維持在60.8%～61.7%，之后從Day 30的72.5%升至Day 40的84.9%。其他各門(mén)類(lèi)菌群，在不同曲間也同樣表現(xiàn)出演替趨勢(shì)的不同。這些結(jié)果說(shuō)明，雖然各類(lèi)曲優(yōu)勢(shì)門(mén)相同，但茶葉添加量的不同，會(huì)促使起初引入的微生物“種子”隨發(fā)酵推進(jìn)出現(xiàn)演化。此外，茶葉添加量的不同會(huì)使各類(lèi)曲初始理化特征出現(xiàn)顯著區(qū)別，并在發(fā)酵進(jìn)程中與微生物相互作用，促使理化特征進(jìn)一步分化，最終使各類(lèi)曲之間群落多樣性和理化特征出現(xiàn)顯著區(qū)別。

圖4 各類(lèi)曲發(fā)酵過(guò)程中優(yōu)勢(shì)門(mén)相對(duì)豐度圖Fig.4 Relative abundance of dominant phyla in Daqu during fermentation

2.3.2 驅(qū)動(dòng)大曲群落演替及理化特征變化的菌群因素

為確定驅(qū)動(dòng)群落演替的主要菌群，利用Mantel相關(guān)性檢驗(yàn)分析各優(yōu)勢(shì)門(mén)對(duì)群落系統(tǒng)進(jìn)化演替（GUniFrac距離）的影響。結(jié)果如表4所示，4 種優(yōu)勢(shì)門(mén)對(duì)各曲中群落系統(tǒng)進(jìn)化演替均存在不同的影響。變形桿菌門(mén)對(duì)4 類(lèi)曲均有顯著影響，且對(duì)10%添茶曲影響最大（r＝0.666），而對(duì)原曲影響最?。╮＝0.345）。厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)除對(duì)10%添茶曲無(wú)顯著影響外，對(duì)其他各曲均有顯著影響，但影響程度不同。如厚壁菌門(mén)對(duì)原曲影響最大（r＝0.577），其次為30%和20%添茶曲；擬桿菌門(mén)對(duì)30%添茶曲影響最大（r＝0.750），其次為20%添茶曲和原曲。放線(xiàn)菌門(mén)僅對(duì)10%添茶曲有顯著影響（r＝0.739），對(duì)其他曲無(wú)顯著影響。這些結(jié)果表明，驅(qū)動(dòng)10%添茶曲群落演替的菌群明顯區(qū)別于其他3 類(lèi)曲。此外，雖然原曲、20%和30%添茶曲在驅(qū)動(dòng)菌群上相同（均為變形桿菌門(mén)、厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)），但受到的影響卻存在區(qū)別。這些結(jié)果說(shuō)明在大曲發(fā)酵過(guò)程中，因茶葉添加量的不同，促使曲內(nèi)群落結(jié)構(gòu)出現(xiàn)分化，且驅(qū)動(dòng)各類(lèi)曲群落演替的細(xì)菌區(qū)系有一定的獨(dú)特性，從而推動(dòng)大曲理化特征產(chǎn)生特定的變化。

表4 各類(lèi)曲中優(yōu)勢(shì)門(mén)與群落系統(tǒng)進(jìn)化演替間Mantel相關(guān)性檢驗(yàn)Table 4 Mantel correlation between difference in relative abundances of dominant phyla and GUniFrac distances for each Daqu

為探索驅(qū)動(dòng)大曲理化特征變化特定菌群，針對(duì)各曲抽取上述Mantel檢驗(yàn)中存在顯著影響的分類(lèi)門(mén)中的優(yōu)勢(shì)屬（相對(duì)豐度＞0.5%），形成各優(yōu)勢(shì)屬的豐度差異性矩陣；其次，利用Bioenv分析法篩選各曲中與系統(tǒng)進(jìn)化演替存在顯著相關(guān)的理化指標(biāo)，并將這些指標(biāo)轉(zhuǎn)化成歐氏距離，以表征理化特征變化；最終使用隨機(jī)森林模型確定對(duì)大曲理化特征變化存在顯著貢獻(xiàn)的優(yōu)勢(shì)屬。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，共有18 個(gè)優(yōu)勢(shì)屬分別在不同曲中存在顯著貢獻(xiàn)，且在各類(lèi)曲中貢獻(xiàn)程度也不盡相同（圖5）。在原曲中，有12 個(gè)類(lèi)群對(duì)理化特征變化有顯著貢獻(xiàn)，其中Pseudomonas（假單胞菌，61.6%）、unclassified_Erwiniaceae（埃文氏菌科未鑒定屬，60.8%）和Bacillus（芽孢桿菌，60.1%）相對(duì)重要度較高，是最主要的貢獻(xiàn)菌群。10%添茶曲中，有5 個(gè)類(lèi)群有顯著貢獻(xiàn)，其中假單胞菌（66.1%）和Sphingomonas（鞘氨醇單胞菌，51.2%）是最主要的貢獻(xiàn)菌群。20%添茶曲中，有13 個(gè)類(lèi)群有顯著貢獻(xiàn)，其中乳酸菌Weissella（魏斯氏菌，89.8%）和Pediococcus（片球菌，51.4%）是最主要的貢獻(xiàn)菌群。30%添茶曲中，有9 個(gè)類(lèi)群存在顯著貢獻(xiàn)，其中芽孢桿菌（69.8%）相對(duì)重要度明顯高于其他類(lèi)群，是最主要的貢獻(xiàn)菌群。這些有顯著貢獻(xiàn)的菌群，除Vibrio（弧菌）外，在先前關(guān)于大曲和茶葉的報(bào)道中均有發(fā)現(xiàn)[10-16]，表明原曲和添茶曲的優(yōu)勢(shì)屬有相似之處，但茶葉添加比例的差異使驅(qū)動(dòng)曲塊理化性質(zhì)的優(yōu)勢(shì)菌群存在較大區(qū)別。在以后的研究中，可進(jìn)一步分析這些高貢獻(xiàn)菌群與茶曲之間的代謝作用關(guān)系，明確其中隱藏的機(jī)理，為添茶曲的工藝優(yōu)化，甚至是多原料制曲提供理論基礎(chǔ)。

圖5 隨機(jī)森林模型呈現(xiàn)各類(lèi)曲中驅(qū)動(dòng)理化特征變化的優(yōu)勢(shì)屬Fig.5 Random forest models displaying the potential drivers of variation in physicochemical properties of each Daqu

3 結(jié)論

本研究利用高通量測(cè)序技術(shù)結(jié)合大曲理化指標(biāo)測(cè)定，通過(guò)一定數(shù)理統(tǒng)計(jì)手段系統(tǒng)揭示了添加不同比例綠茶對(duì)大曲發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌多樣性及演替、大曲理化特征及群落結(jié)構(gòu)變化的影響，并得出相應(yīng)結(jié)論。在制曲過(guò)程中添加茶葉可以顯著增加大曲發(fā)酵后的糖化力、水分含量和酸度水平。特別是添加20%茶葉可以使大曲發(fā)酵后的糖化力和水分含量達(dá)到最高水平，而30%茶葉則使大曲發(fā)酵后的酸度達(dá)到最高水平。茶葉的添加可以提高曲中細(xì)菌多樣性水平，并改變?nèi)郝涞难萏嬉?guī)律。然而，茶葉添加比例與群落多樣性的高低并不呈比例關(guān)系。曲中特有的微生物系統(tǒng)演化結(jié)構(gòu)是影響大曲發(fā)酵過(guò)程理化特征變化的主要因素，尤其對(duì)于添茶曲的酸度變化具有顯著影響。中挺期原曲和添茶曲開(kāi)始出現(xiàn)群落結(jié)構(gòu)分化，并且在發(fā)酵結(jié)束時(shí)形成各自獨(dú)特的群落區(qū)系。變形桿菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)和放線(xiàn)菌門(mén)對(duì)不同類(lèi)別曲的群落結(jié)構(gòu)演替存在不同程度的影響，而驅(qū)動(dòng)10%添茶曲群落演替的菌群與其他3 類(lèi)曲明顯不同。驅(qū)動(dòng)大曲理化特征變化的菌群在4 個(gè)類(lèi)別之間存在較大差異。其中，假單胞菌是原曲和10%添茶曲中的重要驅(qū)動(dòng)菌群，魏斯氏菌和片球菌兩類(lèi)乳酸菌是20%添茶曲的重要驅(qū)動(dòng)菌群，芽孢桿菌則是30%添茶曲的重要驅(qū)動(dòng)菌群。