杜嶸宇，黃二賓，吳化雨，王 芳,2，鄧 佳,3,*

（1.西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，云南 昆明 650224；2.西南地區(qū)生物多樣性保育國家林業(yè)局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224；3.西南山地森林資源保育與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224）

葡萄柚（Citrus paradisi），蕓香科柑橘屬果實(shí)，又名西柚，為世界四大柑橘類群之一。葡萄柚果實(shí)富含維生素，具有很高的營養(yǎng)價(jià)值，由于其果肉多汁，常用于鮮食和果汁加工[1-2]。近年來隨著其經(jīng)濟(jì)價(jià)值的不斷提高，如何有效延長采后葡萄柚果實(shí)的貯藏期成為了研究的焦點(diǎn)。果實(shí)后熟軟化一直是影響果實(shí)貯藏的關(guān)鍵性問題。果實(shí)質(zhì)地的軟化不僅會(huì)直接影響到果實(shí)的口感、外觀品質(zhì)，更易使其受到病原侵染發(fā)生病害從而縮短其貯藏期[3-4]。目前對采后果實(shí)軟化過程的研究發(fā)現(xiàn)，果實(shí)軟化的主要原因是果膠、半纖維素、纖維素等構(gòu)成果實(shí)細(xì)胞壁的主要物質(zhì)在細(xì)胞壁降解酶的作用下被水解，引起細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的破壞和細(xì)胞間連接減少，導(dǎo)致細(xì)胞間黏合力下降，從而致使軟化發(fā)生[5]。研究發(fā)現(xiàn)，外源草酸處理采后李果實(shí)能有效維持果實(shí)內(nèi)細(xì)胞壁多糖含量，使果實(shí)保持較高的硬度[6]。Wang Shiyao等[7]發(fā)現(xiàn)乙烯吸收劑處理對采后藍(lán)莓果實(shí)軟化有明顯抑制作用。蘆玉佳等[8]研究發(fā)現(xiàn)，外源果糖處理采后杏果實(shí)也能有效抑制果實(shí)貯藏期間細(xì)胞壁代謝酶的活性，從而延緩果實(shí)貯藏期間的軟化進(jìn)程。

目前，生物防治以其綠色、健康的優(yōu)點(diǎn)，近年來成為了研究的熱點(diǎn)。拮抗酵母能夠有效保持貯藏期間果實(shí)的品質(zhì)，提高采后果實(shí)的抗性[9-12]。研究表明，在培養(yǎng)基中添加多糖類物質(zhì)，可以有效提高拮抗酵母的生防能力。王蕓[13]研究發(fā)現(xiàn)，添加0.5%β-葡聚糖誘導(dǎo)培養(yǎng)隱球酵母處理采后蘋果，可提高果實(shí)內(nèi)多酚氧化酶、苯丙氨酸解氨酶、過氧化物酶、過氧化氫酶等抗性相關(guān)酶的活性，顯著提高酵母防治蘋果青霉病的生防效力，并未對蘋果的貯藏品質(zhì)造成任何不良影響。黃伊寧[14]證實(shí)，添加N-乙酰氨基葡萄糖培養(yǎng)海洋紅冬孢酵母對梨果實(shí)擴(kuò)展青霉表現(xiàn)出了更好的拮抗效果。顧寧[15]同樣證實(shí)，殼聚糖誘導(dǎo)培養(yǎng)的膠紅酵母對草莓灰霉病的抑制效果明顯。羧甲基殼聚糖（carboxymethyl chitosan，CMCS）是殼聚糖的衍生物，屬于多糖物質(zhì)，其具有無毒、易溶于水且抗菌的特性，CMCS處理能有效維持采后果實(shí)貯藏品質(zhì)，增強(qiáng)果實(shí)抗病性，從而延長果實(shí)的貨架期，常被用作果品采后保鮮劑[16-20]。課題組前期研究同樣發(fā)現(xiàn)，添加CMCS誘導(dǎo)培養(yǎng)羅倫隱球酵母（Cryptococcus laurentii）（CMCS-C.laurentii）對采后葡萄柚果實(shí)青、綠霉病生防效力有明顯的促進(jìn)作用，維持果實(shí)貯藏品質(zhì)[21]。

細(xì)胞壁是植物抵御大多數(shù)病菌侵染的第一道重要結(jié)構(gòu)屏障，細(xì)胞壁的強(qiáng)度與植物抗病密切相關(guān)[22]。添加多糖物質(zhì)培養(yǎng)酵母處理可增強(qiáng)采后果實(shí)抗病能力，除誘導(dǎo)提高果實(shí)抗性防御酶活性外，誘導(dǎo)培養(yǎng)酵母對果實(shí)細(xì)胞壁代謝的報(bào)道較少。因此，本研究依據(jù)此前研究結(jié)果，以葡萄柚果實(shí)為實(shí)驗(yàn)材料，研究CMCS誘導(dǎo)培養(yǎng)羅倫隱球酵母對采后葡萄柚果實(shí)細(xì)胞壁組分含量、細(xì)胞壁降解酶活性和細(xì)胞壁微觀結(jié)構(gòu)的影響，以期明確CMCS誘導(dǎo)培養(yǎng)羅倫隱球酵母處理對葡萄柚果實(shí)細(xì)胞代謝的影響，為探究多糖誘導(dǎo)提高酵母對果實(shí)采后病害防治效力機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試材料：‘里約紅’葡萄柚，采購于佳沃（青島）果業(yè)有限公司。挑選出圓潤飽滿、大小一致、成熟度一致、無機(jī)械損傷且無病蟲害的果實(shí)，用純水洗凈晾干后，再用2%次氯酸鈉（NaClO）溶液浸泡2 min，置于經(jīng)過消毒處理的塑料筐中晾干后室溫條件（25 ℃、相對濕度85%～95%）下保存?zhèn)溆谩?/p>

羅倫隱球酵母（Cryptococcus laurentiiATCC18803），購買于廣東微生物研究所。采用YM液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，置于28 ℃、200 r/min搖床振蕩培養(yǎng)24 h，濃度為1×107CFU/mL（血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)），備用。

CMCS（羧基化度≥80%）大連美侖生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CP214電子天平 蘇州賽恩斯儀器有限公司；手持GY-2硬度計(jì) 艾德堡儀器有限公司；YXQ-LS立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；HH-B11-BS-II恒溫培養(yǎng)箱 哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；TS-2102C恒溫?fù)u床 上海天呈實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司；70型離子交換純水器 上海南華醫(yī)療器械廠；AF103商用制冰機(jī) 美國斯科茨曼公司；UV6100紫外-可見分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司；MIKRO 220R冷凍型臺(tái)式高速離心機(jī) 廣州市華粵行儀器有限公司；DK-98-IIA恒溫不銹鋼水浴鍋 蕭山永發(fā)電器有限公司；702型超低溫冰箱 美國賽默飛世爾科技公司；GZX-GF101電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；H-7650型生物透射電子顯微鏡 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 CMCS誘導(dǎo)羅倫隱球酵母（CMCS-C.laurentii）懸浮液的制備

將培養(yǎng)好的C.laurentii酵母懸浮液接種于含0.5 g/100 mL CMCS的NYDB液體培養(yǎng)基中，接種量為2%，裝液量為100/500 mL，置于28 ℃、200 r/min的搖床上培養(yǎng)24 h，濃度為1×107cells/mL（血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)），待用。

1.3.2 果實(shí)處理

本實(shí)驗(yàn)設(shè)2 個(gè)處理，對照組（CK）：用無菌水浸泡果實(shí)3 min；處理組（CMCS-C.laurentii）：用CMCS誘導(dǎo)培養(yǎng)羅倫隱球酵母（1×107cells/mL）懸浮液浸泡果實(shí)3 min。每組處理60 個(gè)果實(shí)，上述處理浸泡、自然晾干后套袋，分裝于經(jīng)過消毒處理的塑料筐內(nèi)，置于室溫條件（25 ℃、相對濕度85%～95%）貯藏75 d。每15 d取樣，每次取10 個(gè)果實(shí)進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的測定，重復(fù)3 次，共取樣6 次。

1.3.3 葡萄柚果實(shí)細(xì)胞壁代謝相關(guān)指標(biāo)測定

1.3.3.1 硬度與質(zhì)量損失率的測定

果實(shí)硬度使用手持GY-2硬度儀測量；果實(shí)質(zhì)量損失率使用CP214電子天平測定。

1.3.3.2 貯藏期間果實(shí)細(xì)胞壁多糖物質(zhì)含量測定

細(xì)胞壁多糖的提取參照蘆玉佳[8]和鄧佳[4]等的方法，分步提取細(xì)胞壁水溶性果膠（water-soluble pectin，WSP）、離子型果膠（ion bound pectin，ISP）、共價(jià)結(jié)合型果膠（covalent bound pectin，CSP）（分別用去離子水、50 mmol/L乙二胺四乙酸溶液和50 mmol/L Na2CO3溶液抽提）、緊密型半纖維素（24% KOH-soluble fraction，24KSF）和松散型半纖維素（4% KOH-soluble fraction，4KSF）（分別用24%和4% KOH溶液抽提）。果膠多糖含量采用咔唑法測定，半纖維素多糖含量采用蒽酮法測定，結(jié)果均以mg/g表示。以上細(xì)胞壁物質(zhì)含量測定3 次重復(fù)，取平均值。

1.3.3.3 貯藏期間果實(shí)細(xì)胞壁降解酶活力測定

酶液提取及測定參考Deng Yun等[23]的方法，果膠甲酯酶（pectin pectylhydrolase，PE）活力測定采用NaOH滴定法、纖維素酶（cellulase，CX）和多聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase，PG）活力測定采用DNS比色法，以葡萄糖為標(biāo)樣作標(biāo)準(zhǔn)曲線。β-半乳糖苷酶（β-galactosidase，β-Gal）和α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶（α-L-arabinofuranosidase，α-L-Af）活力測定采用比色法。上述所有酶活力的測定均重復(fù)3 次，結(jié)果取平均值。

1.3.3.4 果實(shí)細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)透射電子顯微鏡觀察

分別于處理后第0、15、30天取葡萄柚果實(shí)囊衣采用生物透射電子顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞壁超微結(jié)構(gòu)觀測參照劉峰娟[24]和Li Yaling[25]等的方法。分別于采收當(dāng)天、貯藏第15天和貯藏第30天取對照、CMCS-C.laurentii處理組葡萄柚果實(shí)囊衣樣作為樣品。將葡萄柚果肉囊衣切為1 mm×1 mm大小的方形樣品，用2.5%戊二醛固定液（0.1 mol/L磷酸緩沖液，pH 7.2）浸泡12 h，置于4 ℃下充分固定。使用磷酸緩沖液反復(fù)漂洗浸泡后的果肉組織，漂洗3 次，每次漂洗15 min。再用含有1%鋨酸固定液固定2 h后，用磷酸緩沖液再次漂洗3 次，每次15 min。分別用體積分?jǐn)?shù)為30%、50%、70%、80%、90%和純丙酮梯度脫水，每個(gè)階段洗脫20 min。使用環(huán)氧丙烷滲透，環(huán)氧樹脂包埋。在37 ℃下聚合12 h，60 ℃條件下聚合48 h。將樣品切成60 nm的超薄切片后用醋酸鈾和檸檬酸鉛染色，對樣片觀察并拍照。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

使用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，使用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異顯著，并使用Origin 2019進(jìn)行圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 CMCS、C.laurentii不同處理對果實(shí)硬度的影響

由圖1可知，4 個(gè)處理組采后葡萄柚果實(shí)硬度均呈下降趨勢。貯藏期間，CMCS-C.laurentii處理可有效維持果實(shí)硬度，效果顯著優(yōu)于其他處理組（P＜0.05），C.laurentii與CK處理無顯著差異。貯藏結(jié)束時(shí)，CMCS和CMCS-C.laurentii處理組果實(shí)的硬度顯著高于CK組（P＜0.05），分別較CK高出35.37%和70.73%，此外，CMCS-C.laurentii處理對果實(shí)硬度的維持效果顯著優(yōu)于CMCS單獨(dú)處理（P＜0.05）。在此基礎(chǔ)上，對CMCS-C.laurentii和CK處理組的細(xì)胞壁代謝相關(guān)物質(zhì)及酶活力、細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行測定分析。

圖1 CMCS、C.laurentii不同處理對果實(shí)硬度的影響Fig.1 Effects of CMCS and/or C.laurentii treatments on fruit firmness

2.2 CMCS-C.laurentii處理對果實(shí)質(zhì)量損失率的影響

如圖2所示，與CK樣品相比，CMCS-C.laurentii處理組果實(shí)在貯藏過程中的質(zhì)量損失率顯著降低（P＜0.05）。貯藏75 d后，CK組果實(shí)的質(zhì)量損失率達(dá)到24.72%，而處理組果實(shí)質(zhì)量損失率僅為22.12%。

圖2 CMCS-C.laurentii處理對果實(shí)質(zhì)量損失率的影響Fig.2 Effect of CMCS-C.laurentii treatment on fruit mass loss percentage

2.3 貯藏期間果實(shí)細(xì)胞壁多糖含量測定結(jié)果分析

如圖3A所示，葡萄柚果實(shí)在貯藏前期WSP含量變化并不明顯，貯藏30 d時(shí)果實(shí)的WSP含量大幅度升高，并在之后的貯藏階段維持較高水平。貯藏中后期（30～75 d），CMCS-C.laurentii處理明顯抑制果實(shí)WSP上升，其含量顯著低于CK組（P＜0.05）。貯藏第30、45天時(shí)，CMCS-C.laurentii處理組的WSP含量僅為CK組果實(shí)的47.65%和47.47%。

圖3 CMCS-C.laurentii處理對葡萄柚果實(shí)中的WSP（A）、ISP（B）、CSP（C）、4KSF（D）、24KSF（E）含量的影響Fig.3 Effect of CMCS-C.laurentii treatment on the contents of WSP (A),ISP (B),CSP (C),4KSF (D) and 24KSF (E) in grapefruits

如圖3B所示，貯藏期間葡萄柚果實(shí)ISP含量整體波動(dòng)上升。貯藏初期ISP含量穩(wěn)定維持在較低水平，第30天時(shí)ISP含量急劇增加，第45天略有下降，其后隨著貯藏時(shí)間的延長，果實(shí)中ISP的含量持續(xù)升高，于第75天達(dá)最大值。CMCS-C.laurentii處理抑制果實(shí)的ISP含量上升，貯藏75 d時(shí)，該處理組果實(shí)的ISP含量較CK組果實(shí)降低26.22%。

由圖3C可知，隨貯藏時(shí)間的延長，葡萄柚果實(shí)CSP的含量逐漸下降。CK組果實(shí)CSP在貯藏中后期（30～75d）持續(xù)急劇下降，貯藏75 d時(shí)僅為貯藏初期含量的7.70%。CMCS-C.laurentii處理可以較好地維持果實(shí)CSP含量。

貯藏期間，葡萄柚果實(shí)的4KSF含量變化幅度較?。▓D3D）。CMCS-C.laurentii處理組果實(shí)4KSF含量明顯低于CK組，兩者差異顯著（P＜0.05）。如圖3E所示，葡萄柚果實(shí)24KSF含量在貯藏期間呈下降變化趨勢，CMCS-C.laurentii處理抑制了果實(shí)中24KSF組分物質(zhì)的降解，有效維持了處理組果實(shí)中24KSF含量（P＜0.05）。

2.4 CMCS-C.laurentii處理對果實(shí)細(xì)胞壁代謝酶活力的影響

采后葡萄柚果實(shí)PE活力呈現(xiàn)升高的趨勢，在貯藏30 d出現(xiàn)峰值（圖4A）。CMCS-C.laurentii處理抑制了采后葡萄柚果實(shí)PE活力上升，特別在貯藏初期（15～30 d）的抑制效果較顯著（P＜0.05）。在貯藏第30天，處理組果實(shí)PE活力僅為CK組果實(shí)的64.10%。

圖4 CMCS-C.laurentii處理對葡萄柚果實(shí)PE（A）、PG（B）、CX（C）、α-L-Af（D）、β-Gal（E）活力的影響Fig.4 Effect of CMCS-C.laurentii treatment on the activities of PE (A),PG (B),CX (C),α-L-Af (D) and β-Gal (E) in grapefruits

如圖4B所示，在貯藏過程中，葡萄柚果實(shí)PG活力逐漸上升，貯藏前中期增幅不大，但在貯藏后期（60～75 d）急劇上升，CMCS-C.laurentii處理可顯著抑制果實(shí)PG活力上升（P＜0.05）。貯藏75 d時(shí)處理組PG活力為6.42 U/g，僅為CK組的80.15%。

由圖4C可知，采后葡萄柚果實(shí)CX活力較高，隨貯藏時(shí)間延長，期間波動(dòng)變化。CMCS-C.laurentii處理對葡萄柚果實(shí)CX活力有抑制作用，貯藏早期（15～30 d）、晚期（75 d），CK組果實(shí)CX活力抑制效果較顯著（P＜0.05），CX活力明顯低于CK組。

采后葡萄柚果實(shí)α-L-Af活力變化情況如圖4D所示，貯藏前期果實(shí)α-L-Af活力呈下降趨勢，在貯藏45 d達(dá)最低點(diǎn)，之后酶活力逐漸升高，于75 d達(dá)最高值。CMCS-C.laurentii處理對果實(shí)α-L-Af抑制作用明顯，在貯藏過程中，該處理果實(shí)α-L-Af活力始終維持較低水平，除第30天外，CMCS-C.laurentii處理葡萄柚果實(shí)α-L-Af活力均顯著低于CK組果實(shí)（P＜0.05）。

貯藏期間，葡萄柚果實(shí)β-Gal活力的變化趨勢與α-LAf相似（圖4E）。同樣，CMCS-C.laurentii處理明顯抑制了采后葡萄柚果實(shí)β-Gal活力的上升，整個(gè)貯藏期間，處理組果實(shí)β-Gal活力均顯著低于CK組。

2.5 貯藏期間果實(shí)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化

如圖5A、B所示，采后當(dāng)天葡萄柚果肉囊衣的細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)清晰完整致密，細(xì)胞內(nèi)液泡飽滿，質(zhì)壁結(jié)合緊密，細(xì)胞壁中膠層結(jié)構(gòu)致密光滑，細(xì)胞間隙明顯，此時(shí)果實(shí)硬度最高。圖5C～F為葡萄柚果實(shí)貯藏第15天時(shí)的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，此時(shí)CK組（圖5C、D）果實(shí)細(xì)胞間隙擴(kuò)大，中膠層區(qū)域出現(xiàn)絲狀物質(zhì)，細(xì)胞壁出現(xiàn)彎曲現(xiàn)象，結(jié)構(gòu)沒有初始階段緊密；細(xì)胞內(nèi)液泡收縮，液泡膜出現(xiàn)褶皺，有輕微質(zhì)壁分離現(xiàn)象發(fā)生。CMCS-C.laurentii處理組葡萄柚果實(shí)細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)相對完整（圖5E、F），細(xì)胞間隙并無明顯擴(kuò)大，中膠層清晰完好；細(xì)胞膜略有收縮，尚未出現(xiàn)質(zhì)壁分離現(xiàn)象，細(xì)胞器形態(tài)正常。與CK組相比，CMCS-C.laurentii處理組果實(shí)細(xì)胞結(jié)構(gòu)相對完整，其果實(shí)硬度也明顯高于CK組。圖5G～J為貯藏第30天葡萄柚果肉囊衣細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，CMCS-C.laurentii處理組與CK組果肉囊衣細(xì)胞結(jié)構(gòu)均發(fā)生不同程度的變化。此時(shí)，CK組（圖5G、H）果實(shí)的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化更為顯著，細(xì)胞質(zhì)壁分離現(xiàn)象更加明顯，細(xì)胞器有外泄情況出現(xiàn)，細(xì)胞壁降解情況嚴(yán)重，細(xì)胞邊界模糊。與CK組相比，處理組（圖5I、J）果實(shí)細(xì)胞壁中膠層也出現(xiàn)絲狀物質(zhì)，細(xì)胞間隙略有增大，三角區(qū)域出現(xiàn)部分絮狀空隙；細(xì)胞膜略有收縮質(zhì)壁分離現(xiàn)象仍不明顯，胞內(nèi)結(jié)構(gòu)相對完整，CMCS-C.laurentii處理組葡萄柚果肉囊衣細(xì)胞結(jié)構(gòu)受損程度較輕，有效維持了葡萄柚果實(shí)硬度。

圖5 貯藏期間（第0、15、30天）CK組與CMCS-C.laurentii處理組葡萄柚果肉囊衣細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)Fig.5 Cell ultrastructure of grapefruit segment membrane from the control and CMCS-C.laurentii treatment groups during storage (day 0,15 and 30)

2.6 果實(shí)硬度、質(zhì)量損失率、細(xì)胞壁降解酶活性以及細(xì)胞壁多糖物質(zhì)含量變化的相關(guān)性分析

由表1可以看出，CK與CMCS-C.laurentii處理果實(shí)的硬度與質(zhì)量損失率均呈極顯著負(fù)相關(guān)；細(xì)胞壁多糖物質(zhì)含量（除4KSF）與果實(shí)硬度也具有顯著相關(guān)性，果實(shí)硬度與WSP、ISP和4KSF含量均呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，與CSP和24KSF含量呈正相關(guān)；PG活力與CSP含量均呈極顯著負(fù)相關(guān)。經(jīng)CMCS-C.laurentii處理后PG活力與ISP含量呈現(xiàn)顯著正相關(guān)。相關(guān)性分析結(jié)果表明，在貯藏期間經(jīng)CMCS-C.laurentii處理后，果實(shí)硬度及細(xì)胞壁代謝酶與果實(shí)細(xì)胞壁多糖物質(zhì)的相關(guān)性系數(shù)發(fā)生變化，說明CMCS-C.laurentii處理對果實(shí)細(xì)胞壁代謝具有一定的調(diào)控作用。

表1 葡萄柚果實(shí)貯藏期間硬度與質(zhì)量損失率及細(xì)胞壁多糖物質(zhì)含量變化的相關(guān)性分析Table 1 Correlation analysis between fruit firmness and fruit mass loss percentage and cell wall polysaccharide contents of grapefruits during storage

3 討論

果實(shí)硬度是判斷果實(shí)品質(zhì)的關(guān)鍵指標(biāo)，也是決定果實(shí)貨架期長短的關(guān)鍵，果實(shí)采后軟化也加劇了運(yùn)輸和處理過程中造成的損害，增加了貯藏病害發(fā)生的可能性[26]。目前針對果實(shí)采后貯藏的研究顯示，果實(shí)的軟化主要與細(xì)胞壁降解有關(guān)。植物細(xì)胞壁主要由纖維素、半纖維素和果膠質(zhì)等結(jié)構(gòu)多糖，木質(zhì)素以及少量蛋白質(zhì)和礦物質(zhì)等構(gòu)成[27]。導(dǎo)致采后果實(shí)內(nèi)果膠類物質(zhì)降解，主要是PG和PE相互作用的結(jié)果[28]。而CX、α-L-Af和β-Gal活性的變化是果實(shí)是否會(huì)進(jìn)一步軟化的關(guān)鍵。

在果實(shí)采收時(shí)，果實(shí)內(nèi)細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)緊密穩(wěn)定，果實(shí)內(nèi)主要以CSP和24KSF等難溶且結(jié)構(gòu)緊密的細(xì)胞壁多糖為主，隨著貯藏期間細(xì)胞壁水解酶的作用，CSP和24KSF被解聚為更為松散WSP、ISP以及4KSF等細(xì)胞壁多糖物質(zhì)[4,8]。因此，葡萄柚果實(shí)內(nèi)WSP、ISP和4KSF等含量與果實(shí)硬度呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，而CSP和24KSF的含量則隨著果實(shí)的軟化而降低。

本研究結(jié)果表明，采用CMCS-C.laurentii酵母液對采后葡萄柚果實(shí)進(jìn)行處理能顯著維持貯藏期間果實(shí)的質(zhì)地。對貯藏期間葡萄柚果實(shí)內(nèi)果膠、半纖維素物質(zhì)的含量進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)CMCS-C.laurentii處理能延緩葡萄柚果實(shí)CSP組分降解，抑制WSP和ISP含量升高，同時(shí)，果實(shí)中緊密型半纖維素（24KSF）向松散型半纖維素（4KSF）降解轉(zhuǎn)化的過程也得到了抑制，這與此前鄧佳等[4,29]通過鈣處理采后葡萄柚果實(shí)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。貯藏期葡萄柚果實(shí)細(xì)胞壁超微結(jié)構(gòu)變化也表明，CMCS-C.laurentii處理可延緩果實(shí)細(xì)胞壁降解，細(xì)胞內(nèi)部細(xì)胞器更加完整，細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，與果實(shí)硬度變化相一致。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，與CK組相比，CMCS-C.laurentii處理可顯著抑制不同貯藏時(shí)期內(nèi)葡萄柚果實(shí)PE、PG、CX、α-L-Af和β-Gal等細(xì)胞壁降解酶的活性，有效減緩果膠和半纖維素等物質(zhì)的降解，從而維持葡萄柚果實(shí)的硬度。這一結(jié)果與盧玉佳等[8]通過外源果糖處理杏果實(shí)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，果糖處理能有效降低杏果實(shí)貯藏期間細(xì)胞壁代謝酶的活性，從而延緩果實(shí)軟化，更好地保持采后杏果實(shí)的硬度。另外，張琴等[6]通過外源草酸處理“蜂糖李”果實(shí)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，抑制果實(shí)細(xì)胞壁代謝酶的活性是延緩果實(shí)軟化的關(guān)鍵。

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，添加CMCS、羧甲基纖維素等外源多糖誘導(dǎo)培養(yǎng)羅倫隱球酵母能提高酵母的發(fā)酵速率、增殖速度和發(fā)酵產(chǎn)物（糖和有機(jī)酸）的積累，CMCS-C.laurentii處理相較單獨(dú)酵母處理，對柑橘果實(shí)貯藏期間質(zhì)地品質(zhì)的維持和抗病能力都要更優(yōu)[21,30]。CMCS-C.laurentii處理能夠在果實(shí)表面形成多糖-酵母復(fù)合膜，抑制果實(shí)貯藏期間的水分散失和呼吸氧化[11]。多糖作為植物能量貯存和結(jié)構(gòu)組成的主要物質(zhì)，具有提供前體物質(zhì)等功能，還作為信號分子涉及植物體內(nèi)的代謝過程。外源果糖處理能有效抑制細(xì)胞壁水解酶活性，延緩杏果實(shí)軟化過程[8]。外源蔗糖處理蘆筍能通過調(diào)控基因來改變細(xì)胞壁成分，抑制果膠的降解，延緩蘆筍軟化衰老[31]。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果和實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果可以推測，CMCS-C.laurentii中含有大量酵母發(fā)酵產(chǎn)物和CMCS，這些多糖類物質(zhì)可以作為外源糖抑制果實(shí)細(xì)胞壁多糖的降解，從而達(dá)到抑制軟化的效果。

綜上，CMCS-C.laurentii處理可有效抑制葡萄柚果實(shí)內(nèi)細(xì)胞壁降解酶（PG、PE、CX、α-L-Af和β-Gal）的活性，維持果實(shí)內(nèi)CSP、24KSF的含量，降低果實(shí)內(nèi)WSP、ISP以及4KSF的含量；結(jié)合細(xì)胞壁超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)，CMCS-C.laurentii處理可減緩采后葡萄柚果實(shí)細(xì)胞內(nèi)部細(xì)胞器及細(xì)胞壁的降解，較好維持細(xì)胞完整性，延緩果實(shí)軟化。本研究結(jié)果為C.laurentii在葡萄柚果實(shí)采后貯藏保鮮領(lǐng)域的商業(yè)化應(yīng)用提供了理論參考。