黃 浩 謝 斌 張玉敏 趙現(xiàn)偉 陳杰能

食管癌是原發(fā)于食管的惡性腫瘤，其典型癥狀為進行性吞咽困難、胸骨疼痛，好發(fā)于中老年男性群體，農村地區(qū)的發(fā)病率高于城市，且具有明顯的地域差異，發(fā)病情況與生活習慣關系密切[1］。食管癌主要根據患者個體情況、病理類型及侵犯范圍來制定治療方案，化療聯(lián)合抗血管生成治療是目前臨床常用的治療方案。腫瘤細胞增殖、轉移均受血管生成情況影響，若腫瘤內血管生成豐富，可為腫瘤生長提供所需營養(yǎng)[2］。但目前評估腫瘤血管生成多依賴免疫組化，該方法檢測周期較長，重復性較差。超聲造影（contrastenhanced ultrasound，CEUS）是在二維超聲的基礎上注入造影劑，經血液循環(huán)將造影劑微氣泡遞送至靶器官，有助于清晰顯示病灶血流分布和灌注情況，觀察病灶與周圍組織器官的關系，提高了超聲對疾病的診斷和鑒別診斷能力[3］。時間-強度曲線（time-intensity curve，TIC）定量參數(shù)已用于評估膀胱癌分期[4］和前列腺增生患者前列腺動脈栓塞療效[5］。本實驗通過建立裸鼠食管癌移植瘤模型，旨在探討CEUS 對裸鼠食管癌移植瘤血管生成情況的評估價值。

材料與方法

一、實驗動物和細胞

6 周齡雌性裸鼠18 只（購自華中科技大學動物實驗中心），體質量18～22 g，平均（20.0±1.0）g，于恒溫（25～27℃）、恒濕（45%～50%）的清潔級半屏障系統(tǒng)環(huán)境下飼養(yǎng)，飼養(yǎng)期間水、飼料均行滅菌處理。人食管癌細胞株Eca-109（上海酶研生物科技有限公司），細胞復蘇后置于含有10%胎牛血清的細胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境為37℃、5%CO2的恒溫細胞培養(yǎng)箱，待細胞生長至90%時進行細胞傳代。

二、主要儀器與試劑

1.主要儀器：Philips iU22彩色多普勒超聲診斷儀，L12-4 探頭，頻率6～15 MHz；冷凍離心機（CR22N，德國Eppendorf 公司）；石蠟切片機（HM325，美國Thermo Fisher Scientific 公司）；光學顯微鏡（DM3000，德國Leica公司）。

2.主要試劑：血管內皮生長因子（VEGF，美國Abbiotec 公司）；細胞培養(yǎng)液、胎牛血清、山羊抗兔二抗、DAB 顯色液（美國Sigma 公司）；Fac-Ⅷ抗體（上?；钌锟萍加邢薰荆籋E 染色試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；免疫組化試劑盒（YDDEF001，上海羽哚生物科技有限公司）；枸櫞酸鈉緩沖液（愛必信上海生物科技有限公司）；超聲造影劑SonoVue（意大利Bracco公司），按說明書配制成混懸液備用。

三、實驗方法

1.食管癌移植瘤模型建立：培養(yǎng)人食管癌細胞株Eca-109 生長至對數(shù)期時，收集并制成細胞懸液，調整濃度為1×107個/L，參考Guan 等[6］方法制備裸鼠食管癌移植瘤，對裸鼠右側背部進行酒精消毒，使用無菌注射器抽取0.2 ml 食管癌細胞懸液皮下注射，待移植瘤生長至直徑約0.5 cm視為建模成功。

2.超聲檢查及圖像分析：分別于移植后4、6、8周隨機選取6只裸鼠，先行二維超聲檢查，觀察移植瘤回聲、形態(tài)和邊界；然后行CEUS 檢查，于裸鼠尾靜脈注射配制好的造影劑混懸液（劑量2.5 μl/g，2～4 s 注射完成），隨即使用生理鹽水沖管，觀察移植瘤血流灌注情況。使用Qlab 6.0 定量分析軟件對移植瘤CEUS 圖像進行TIC 分析，獲取峰值強度（PI）、達峰時間（TTP）、平均通過時間（MTT）、曲線下流入面積（AWI）、曲線下流出面積（AWO）。以上操作均由同一具有5年以上工作經驗的超聲醫(yī)師完成，所有參數(shù)均重復測量3次取平均值。

3.病理學檢查：①HE染色觀察移植瘤細胞結構和組織形態(tài)。于移植后4、6、8 周麻醉并處死裸鼠，將移植瘤固定于4%多聚甲醛溶液，進行脫水、透明、浸蠟和石蠟包埋，使用石蠟切片機對包埋蠟塊進行切片（厚度約4 μm），切片脫水、透明后封片，于光學顯微鏡下觀察移植瘤細胞結構和組織形態(tài)；②免疫組化觀察移植瘤VEGF 蛋白表達和MVD。取移植瘤切片進行脫蠟、復水，將其置于枸櫞酸鈉緩沖液（pH值6.0）中加熱5 min，冷卻后使用磷酸緩沖液洗滌3次，每次5 min，加入3%H2O2室溫孵育10 min，加入VEGF、Fac-Ⅷ抗體4℃孵育過夜，加入山羊抗兔二抗，再于室溫孵育1 h，加入DAB 顯色液室溫顯色，蘇木素復染1 min，脫水、透明后封片，于光學顯微鏡下觀察VEGF、Fac-Ⅷ蛋白表達。計算腫瘤內微血管密度（MVD），以Fac-Ⅷ蛋白表達免疫組化陽性染色評估MVD，使用Weidender 計數(shù)標準計算移植瘤內著色微血管，單個內皮細胞計為1 個血管，于光學顯微鏡（×200）下獲取5 個不重疊視野中的血管計數(shù)，取其均值作為單個視野下MVD。

四、統(tǒng)計學處理

應用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件，計量資料以±s表示，多組比較采用單因素方差分析，兩組比較采用SNK 法。采用Pearson 相關性分析法分析TIC 定量參數(shù)與移植瘤VEGF 蛋白表達、MVD 的相關性。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

所有裸鼠食管癌移植瘤模型均成功建立，未出現(xiàn)死亡。

一、二維超聲檢查結果

移植后4周，移植瘤表現(xiàn)為類橢圓形低回聲腫塊，邊界清晰，內部回聲不均勻；移植后6 周，移植瘤表現(xiàn)為腫塊邊界欠清晰，內部回聲不均勻；移植后8 周，移植瘤表現(xiàn)為腫塊邊界不清晰，內部回聲不均勻。見圖1。

二、CEUS檢查結果

1.移植后4 周，移植瘤內部呈均勻高增強；移植后6 周，移植瘤內部呈不均勻高增強；移植后8周，移植瘤內部出現(xiàn)灌注缺損。見圖2。

圖2 不同時間裸鼠食管癌移植瘤CEUS圖

2.TIC 顯示，移植后4、6、8 周移植瘤PI、AWI 及AWO 比較，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；與移植后4 周比較，移植后6、8 周移植瘤PI、AWI 及AWO 均升高（均P＜0.05）；與移植后6 周比較，移植后8 周移植瘤PI 和AWO 均升高（均P＜0.05）。移植后4、6、8 周移植瘤TTP 和MTT 比較，差異均無統(tǒng)計學意義。見圖3和表1。

表1 不同時間裸鼠食管癌移植瘤TIC定量參數(shù)比較（±s）

表1 不同時間裸鼠食管癌移植瘤TIC定量參數(shù)比較（±s）

與移植后4周比較，*P＜0.05；與移植后6周比較，#P＜0.05。PI：峰值強度；TTP：達峰時間；MTT：平均通過時間；AWI：曲線下流入面積；AWO：曲線下流出面積

AWO（dB）118.32±46.54 445.21±285.45*987.21±192.21*#28.770＜0.001時間移植后4周移植后6周移植后8周F值P值PI（dB）3.04±1.68 10.47±2.97*18.40±8.37*#12.999＜0.001 TTP（s）24.85±10.15 40.14±18.45 38.54±19.97 1.509 0.253 MTT（s）49.62±12.78 68.54±30.58 90.58±51.32 2.027 0.166 AWI（dB）41.11±18.98 211.35±125.11*318.25±125.31*11.088 0.001

圖3 不同時間裸鼠食管癌移植瘤TIC圖

三、病理學檢查結果

1.HE 染色顯示，移植后4 周，移植瘤見角化珠且細胞間見細胞間橋；移植后6 周，移植瘤角化珠、細胞間橋均稍減少，毛細血管增多；移植后8 周，移植瘤角化珠、細胞間橋均明顯減少，毛細血管增多，可見病理性核裂變。見圖4。

圖4 不同時間裸鼠食管癌移植瘤病理圖（HE染色，×200）

2.免疫組化顯示，移植后4、6、8 周MVD 和VEGF蛋白表達比較，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；與移植后4 周比較，移植后6、8 周MVD 均升高，移植后8 周VEGF 蛋白表達升高，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。見表2和圖5。

表2 不同時間裸鼠食管癌移植瘤MVD和VEGF蛋白表達比較（±s）

表2 不同時間裸鼠食管癌移植瘤MVD和VEGF蛋白表達比較（±s）

與移植后4周比較，*P＜0.05；與移植后6周比較，#P＜0.05。MVD：微血管密度；VEGF：血管內皮生長因子

VEGF蛋白表達2.14±1.01 3.98±2.45 5.87±2.34*5.010 0.022時間移植后4周移植后6周移植后8周F值P值MVD（條）8.41±1.87 12.12±2.98*13.54±2.54*6.707 0.008

四、相關性分析

裸鼠食管癌移植瘤PI、AWI、AWO 與MVD、VEGF蛋白表達均呈正相關（均P＜0.001）。見表3。

討 論

食管癌患者主要臨床表現(xiàn)為吞咽困難、哽噎感、胸骨后異物感，隨著病情進展會出現(xiàn)進食、飲水困難，嚴重影響其生活質量和生命安全[7］。因此，及早診斷和治療是改善食管癌患者預后的關鍵。影像學檢查是臨床診斷組織病變的常用檢查方式，常規(guī)超聲檢查可以明確病變位置、大小等基本情況[8］，但不能顯示腫瘤內部血管生成。腫瘤病變組織具有惡性增殖的特點，其血流分布情況直接影響臨床治療方案的制定，臨床一般采用病理學檢查評估組織內部血管生成情況，但其結果易受樣本采集部位的影響，且重復性較差[9］。CEUS 可彌補上述不足，本實驗通過建立裸鼠食管癌移植瘤模型，探討CEUS對移植瘤血管生成的評估價值。

本實驗通過皮下注射人食管癌細胞株Eca-109成功建立裸鼠食管癌移植瘤模型，通過觀察不同時間移植瘤影像學變化發(fā)現(xiàn)，移植后4 周裸鼠移植瘤二維超聲表現(xiàn)為類橢圓形低回聲腫塊、邊界清晰、內部回聲不均勻，CEUS 表現(xiàn)為移植瘤內部呈均勻高增強；移植后6、8周，移植瘤二維超聲表現(xiàn)為內部回聲仍不均勻，且腫瘤邊界由欠清晰轉變?yōu)椴磺逦珻EUS 表現(xiàn)為移植瘤內部由不均勻高增強轉變?yōu)楣嘧⑷睋p，說明移植后4周移植瘤周圍已經存在血流分布，隨著其生長，瘤內血流信號更豐富。移植后6、8 周CEUS 表現(xiàn)由不均勻高增強轉變?yōu)楣嘧⑷睋p，分析原因可能為腫瘤組織生長過快，瘤內血管供養(yǎng)出現(xiàn)不足，導致缺氧壞死，從而出現(xiàn)灌注缺損。表明隨著移植瘤的生長，其內血流灌注逐漸增多，CEUS 能為評估病灶內血流灌注情況提供更多信息[10-11］。本實驗還發(fā)現(xiàn)，移植后6、8 周，移植瘤PI、AWI和AWO均高于移植后4周，且移植后8周移植瘤PI和AWO均高于移植后6周，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；與文獻[12］報道結果相似。TIC 定量參數(shù)包括PI、TTP 和曲線下面積等，組織內血管越多，血流量越大，造影劑進入量越多，PI越高，AWI和AWO也越高，因此能準確反映病變組織內血流灌注情況[13-14］；TTP、MTT 分別反映病灶組織內超聲造影劑濃度達到最高時的時間和平均通過時間，其由組織內微循環(huán)血流灌注速度決定；本實驗結果顯示不同時間移植瘤TTP、MTT比較差異均無統(tǒng)計意義，分析原因可能與成瘤時間較短有關。

本實驗通過觀察移植瘤的病理學變化發(fā)現(xiàn)，移植后4 周見角化珠和細胞間橋；移植后6 周移植瘤角化珠和細胞間橋均稍減少，且瘤內毛細血管增多；移植后8周除了角化珠和細胞間橋均明顯減少和毛細血管增多外，還可見明顯的病理性核裂變，表明隨著移植瘤的生長，腫瘤惡性程度也增加。研究[15］顯示，造影劑微泡濃度越高表示病灶血流灌注量越大，組織內血流灌注量與其血管生成情況直接相關，即血管生成密度越高其血流灌注越大；VEGF 對腫瘤組織血管重建有很強的促進作用，其表達升高能反映MVD升高。既往實驗[16］發(fā)現(xiàn)裸鼠乳腺癌移植瘤MVD、VEGF 蛋白表達均升高，本實驗結果顯示，移植后6、8周移植瘤MVD較移植后4周升高，且移植后8周移植瘤VEGF蛋白表達均高于移植后4、6周，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；與其結果一致。本實驗相關性分析顯示，裸鼠食管癌移植瘤PI、AWI、AWO 與MVD、VEGF 蛋白表達均呈正相關（均P＜0.001），與文獻[17］報道結果相似，表明隨著移植瘤的生長其血管生成越豐富，CEUS 能夠很好地評估裸鼠食管癌移植瘤的血管生成情況。

綜上所述，CEUS能夠有效觀察裸鼠食管癌移植瘤內部血流灌注情況，TIC定量參數(shù)PI、AWI、AWO隨著移植瘤的生長而逐漸升高，其與移植瘤MVD、VEGF蛋白表達均呈正相關，可以較好地評估移植瘤血管生成情況。