彭祥琳, 浦飛飛, 馮 晶△, 夏 平

1華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬武漢市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院骨科,武漢 430022 2武漢市第四醫(yī)院骨科,武漢 430033

結(jié)核病(tuberculosis,TB)是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis,MTB)引起的慢性傳染病。MTB主要寄生于巨噬細胞內(nèi),當MTB侵入宿主后,巨噬細胞可以通過多種模式識別受體識別病原相關(guān)分子模式,啟動細胞自噬、細胞凋亡、產(chǎn)生自由基、分泌炎癥因子等“滅殺”MTB[1]。細胞自噬是一種廣泛存在于人體細胞的生理過程,可直接“滅殺”巨噬細胞中的MTB,而MTB又可以通過復(fù)雜的機制逃避細胞自噬對其“滅殺”,從而在宿主細胞內(nèi)長期存活[2]。多數(shù)MTB感染者處于MTB攜帶狀態(tài),并不會表現(xiàn)出臨床癥狀,部分未接受規(guī)范化抗結(jié)核治療的患者也會轉(zhuǎn)為非活動型TB和耐藥型TB。據(jù)世界衛(wèi)生組織報道,2020年全球MTB潛伏性感染人群接近20億,這些潛伏性感染的MTB可以在機體免疫力下降時復(fù)蘇繁殖,最終引發(fā)活動性肺結(jié)核[3]。有研究提出自噬激活劑作為標準抗結(jié)核藥物的補充治療以及耐藥型結(jié)核的代替治療是一個很有潛力的治療方案[4]。近年來,隨著高通量篩選技術(shù)的廣泛應(yīng)用,大量差異性表達的非編碼RNA(non-coding RNAs,ncRNAs)及其靶基因被鑒定出來,多種ncRNAs調(diào)控MTB感染巨噬細胞自噬的分子通路也被驗證。因此,本文綜述了細胞自噬的發(fā)生過程與ncRNA的調(diào)控功能,討論了現(xiàn)階段研究中ncRNA調(diào)控MTB感染巨噬細胞自噬相關(guān)的機制,以期為闡明TB的發(fā)病機制以及研發(fā)抗結(jié)核藥物提供新的思路。

1 細胞自噬

細胞自噬又稱為Ⅱ型程序性細胞死亡,在提供細胞內(nèi)能量來源、維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)和清除無用細胞等方面發(fā)揮重要作用,也是一種針對病原體的先天免疫防御機制。巨噬細胞是MTB感染的靶細胞,可以表達多種模式識別受體識別MTB釋放的糖脂類、糖蛋白和碳水化合物等病原體相關(guān)分子模式,如Toll樣受體、NOD樣受體和C型凝集受體等[5]。經(jīng)典的自噬根據(jù)細胞內(nèi)底物運輸?shù)饺苊阁w的方式分為巨自噬、微自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬[6]。本文所討論的自噬為巨自噬,即細胞質(zhì)中可溶性大分子物質(zhì)以及變性的細胞器被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體來源的單層或雙層膜延伸包裹形成自噬體。隨后自噬體的外膜與溶酶體膜融合形成自噬溶酶體,自噬體內(nèi)的待降解物暴露于溶酶體水解酶,最終自噬體與內(nèi)部的待降解物一起被降解,降解產(chǎn)物被釋放回細胞質(zhì)供細胞使用。自噬發(fā)生過程主要包括前自噬體的形成、自噬體延伸、自噬溶酶體成熟、被包裹內(nèi)容物的降解與再利用[7]。該過程涉及的自噬相關(guān)基因在酵母菌以及人和小鼠同源基因中有不同的命名方式,本文主要以酵母菌自噬相關(guān)基因(autophagy related gene,ATG)命名方式及其對應(yīng)的蛋白即ATG蛋白進行討論。

1.1 前自噬體的形成

正常生理狀態(tài)下,細胞保持著低水平的自噬,自噬水平依賴雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1(mechanistic target of rapamycin complex 1,mTORC1)的調(diào)控。mTORC1是細胞分解與合成代謝的中心,活化的mTORC1可以抑制自噬進而抑制細胞分解代謝,當細胞在饑餓或應(yīng)激狀態(tài)下時,mTORC1的活性被抑制,導(dǎo)致ATG13去磷酸化并與ATG1、ATG17形成ATG13-ATG1-ATG17復(fù)合物進一步啟動下游的自噬體形成與延伸[8]。mTORC1受到多個通路的調(diào)控,主要有AMPK-mTORC1通路、PI3K/Akt/mTORC1通路和Ras/Raf/MEK/ERK通路[9]。前自噬體的成核過程和PI3K-Beclin-1復(fù)合物密切相關(guān),該復(fù)合物作用于膜泡的成核階段,介導(dǎo)前自噬體結(jié)構(gòu)的形成,這對于自噬體膜的延伸以及招募其他自噬相關(guān)蛋白非常重要[6]。PI3K-Beclin-1復(fù)合物可以招募ATG12-ATG5和ATG16以及LC3促進吞噬體的延伸[7]。實驗表明,多種調(diào)節(jié)蛋白可以與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與吞噬體上的PI3K和Beclin-1結(jié)合調(diào)控自噬,如UVRAG、BIF-1、Atg14和Ambra可以促進自噬,Rubicon和Blc-2可以抑制自噬[10],其中UVRAG為miRNA-125a-3p調(diào)控自噬的靶點[11]。

1.2 自噬體延伸

自噬體的延伸主要依賴于ATG12的結(jié)合過程和LC3的修飾過程,這是兩種類泛素化的系統(tǒng),需要泛素活化酶E1與E2的參與。ATG12首先被E1樣酶ATG7活化,再由E2樣酶ATG10轉(zhuǎn)運并與ATG5結(jié)合,然后和ATG16結(jié)合形成ATG12-ATG5-ATG16復(fù)合體,這個復(fù)合體定位在前自噬體的外膜表面參與自噬體膜的延伸[7]。LC3的修飾過程同樣依賴泛素化修飾過程,LC3前體被ATG4加工為可溶于胞質(zhì)的LC3-Ⅰ,然后在E1樣酶ATG7和E2樣酶ATG3的作用下,和磷脂酰乙醇胺(PE)共價連接形成脂溶性的LC3-Ⅱ。LC3-Ⅱ可以與新形成的自噬體膜結(jié)合,并定位于自噬體內(nèi)膜和外膜直到與溶酶體融合形成自噬溶酶體,因此,LC3-Ⅱ也是檢測自噬形成的標志蛋白[6,10]。

1.3 自噬體的成熟及裂解

自噬體的成熟主要是指雙膜自噬體完成延伸并關(guān)閉后與溶酶體融合進而降解其內(nèi)容物。自噬體與溶酶體首先要相互靠近,然后在SNARE復(fù)合體的介導(dǎo)下互相融合。在哺乳動物中,該復(fù)合體由STX17、SNAP29、VAMP7以及VAMP8組成[12]。此外,參與成熟階段的相關(guān)蛋白還包括:LAMP1、LAMP2、UVRAG[10,13]。自噬溶酶體的裂解是指自噬溶酶體膜的裂解及內(nèi)容物在溶酶體水解酶的作用下降解的過程,降解內(nèi)容物的目的不是單純地消除內(nèi)容物,而是作為一種動態(tài)的循環(huán)系統(tǒng)提供細胞更新和代謝所需要的能量與物質(zhì)。降解過程中產(chǎn)生的氨基酸及部分蛋白可以為細胞提供營養(yǎng)、能量或循環(huán)利用。在降解過程中也有多種自噬蛋白參與,如ATG22直接參與部分氨基酸的轉(zhuǎn)運,ATG12與ATG15參與自噬溶酶體的裂解,ATG1和ATG13參與溶酶體水解酶的轉(zhuǎn)運等[10,14]。

2 非編碼RNA調(diào)控結(jié)核分枝桿菌感染的自噬

人類基因組中絕大多數(shù)轉(zhuǎn)錄本都不編碼蛋白質(zhì),起初這些ncRNAs被視為蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄的“噪音”,但近些年的研究發(fā)現(xiàn),這些ncRNAs參與了從表觀遺傳到mRNA轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等不同水平的基因調(diào)控。根據(jù)核苷酸鏈的長度,ncRNAs主要被分為微小RNA(microRNAs,miRNAs)、長鏈非編碼RNA(long noncoding RNAs,lncRNAs)、環(huán)狀RNA(circular RNAs,circRNAs)等。miRNA是長度為19～25個核苷酸的小RNA,可以靶向結(jié)合mRNA的3′UTR互補序列,直接在蛋白質(zhì)水平上調(diào)控基因的表達[4,15]。lncRNAs是長度大于200個核苷酸的轉(zhuǎn)錄本,它可以從蛋白質(zhì)編碼基因的任何部分調(diào)控轉(zhuǎn)錄,相比于miRNAs,lncRNAs功能更為多樣復(fù)雜。研究表明,lncRNAs可以結(jié)合蛋白質(zhì)復(fù)合物、轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控基因表達,也可以互補結(jié)合反義lncRNA或作為miRNA的“海綿”調(diào)控mRNA表達[16-17]。circRNAs是一種單鏈環(huán)狀RNA分子,其5′和3′端共價連接成為環(huán)狀分子,可以與特定的蛋白結(jié)合或者作為miRNA的“海綿”靶向抑制miRNA[18-19]。早期對于ncRNA的研究主要集中在腫瘤和病毒感染等領(lǐng)域。然而近年來隨著對ncRNAs的研究逐漸深入,許多研究發(fā)現(xiàn)ncRNAs在TB的早期診斷、調(diào)控MTB感染導(dǎo)致的細胞自噬、細胞凋亡等途徑中具有重要作用[20]。

單個ncRNA可以調(diào)控多種自噬蛋白進而調(diào)控自噬的多個發(fā)生過程,例如miR-33和miR-33*通過下調(diào)ATG5、ATG12、LAMP1、LC3-Ⅱ等多個自噬基因調(diào)控自噬[21],一個自噬基因也受到多種ncRNAs的調(diào)控。miR-155可以靶向E2樣泛素活化酶ATG3的表達進而抑制自噬[22],也可以靶向細胞凋亡相關(guān)基因FOXO3調(diào)控細胞凋亡[23-24]。完善這種復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò),對于進一步發(fā)現(xiàn)MTB免疫逃逸的機制以及抗結(jié)核藥物的開發(fā)具有重要意義。

2.1 ncRNAs在自噬體形成階段調(diào)控自噬

在自噬體形成的起始階段,mTORC1活性降低進而啟動自噬,形成ATG13-ATG1-ATG17復(fù)合物誘導(dǎo)下游的自噬體成核與延伸[9]。研究發(fā)現(xiàn),在活動性結(jié)核病患者和H37Rv感染的小鼠巨噬細胞中,miR-27a的表達上調(diào),靶向下調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的Ca2+轉(zhuǎn)運體CACNA2D3,進而抑制自噬體的形成[25]。鈣離子的降低可以通過Ca2+/CaMKKβ/AMPK/ATG1通路抑制自噬[8]。Jiang等[26]還發(fā)現(xiàn),在卡介苗(Bacillus Calmette Guerin,BCG)感染的THP-1細胞中,LncRNA MIAT的表達上調(diào),而miR-665的表達呈時間依賴性下調(diào)。該研究證明了LncRNA MIAT作為miR-655的“海綿”減弱后者對AGT1的抑制,揭示了MIAT-miR-655-ATG1信號通路。

在PI3K與Beclin-1介導(dǎo)的自噬體成核階段也受到多個ncRNAs的調(diào)控,Chen等[27]發(fā)現(xiàn)在H37Rv感染的THP-1細胞中miR-30A表達上調(diào),并且miR-30A通過選擇性下調(diào)Beclin-1和ATG5的表達抑制細胞自噬,進而促進MTB在體內(nèi)存活。肺結(jié)核涂片陽性患者肺泡巨噬細胞的miR-30A濃度高于涂片陰性患者,經(jīng)過抗結(jié)核治療后的涂片陽性患者miR-30A水平顯著降低。多種調(diào)節(jié)蛋白與Beclin-1結(jié)合也可以調(diào)控自噬,上文提到的miRNA-125a-3p在H37Rv感染的小鼠巨噬細胞中表達上調(diào),并靶向抗紫外線相關(guān)基因UVRAG,從而抑制自噬的激活和巨噬細胞對MTB的抗菌作用[11]。Kumar等[28]發(fā)現(xiàn)在H37Rv感染小鼠巨噬細胞期間,miR-17-5p的表達下調(diào),并靶向Mcl-1和STAT3并增強自噬,Mcl-1是抗凋亡蛋白Bcl-2家族中的一員,其與Beclin-1結(jié)合可以抑制自噬[29]。

2.2 ncRNAs在自噬體延伸階段調(diào)控自噬

自噬體的延伸階段主要依賴的兩個類泛素化系統(tǒng),如E1樣酶ATG7、E2樣酶ATG10和ATG3,以及ATG12-ATG5-ATG16復(fù)合體、LC3、ATG4等都是ncRNAs調(diào)控的靶點。Ouimet等[21]發(fā)現(xiàn),在H37Rv感染的小鼠巨噬細胞感染期間可以誘導(dǎo)miR-33表達上調(diào),而miR-33可以下調(diào)自噬相關(guān)基因ATG5、ATG12、LAMP1和LC3-Ⅱ表達,進而抑制巨噬細胞自噬。而miR-33缺乏的小鼠具有更強的巨噬細胞自噬和抗MTB的能力。重要的是,該研究還發(fā)現(xiàn)MTB誘導(dǎo)的miR-33表達上調(diào)會減少自噬介導(dǎo)的脂滴向溶酶體的輸送和損害線粒體脂肪酸氧化,從而促進巨噬細胞脂質(zhì)儲存,這些脂質(zhì)會在慢性感染期作為營養(yǎng)源輸入到MTB中,這個現(xiàn)象在miR-33基因敲除的小鼠中觀察到相反的表現(xiàn)。脂質(zhì)豐富的環(huán)境促使MTB逃避先天免疫防御,并為其復(fù)制提供豐富的營養(yǎng),富含脂質(zhì)的MTB具有休眠桿菌的特性,包括對抗結(jié)核藥物的耐藥性等,這表明miR-33可能在非活動性TB和耐藥性TB中發(fā)揮重要作用[30-31]。Shi等[32]發(fā)現(xiàn),在MTB感染的人類肺泡巨噬細胞中,circAGFG1表達水平升高,靶向下調(diào)miR-1275,而沉默miR-1275后可以增加細胞內(nèi)LC3、LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ的水平,進而促進自噬。而該研究進一步驗證了miR-1275的靶點,發(fā)現(xiàn)miR-1275通過靶向Notch2來調(diào)控細胞自噬和凋亡,揭示了circAGFG1-miR1257-Notch2信號軸對自噬的調(diào)節(jié)作用。

部分ncRNAs以泛素樣酶為靶點調(diào)控自噬,例如miR-129-3p靶向ATG4抑制自噬[33]。Qu等[34]也發(fā)現(xiàn)H37Ra感染的小鼠巨噬細胞中miR-142-3p下調(diào),并證明了miR-142-3p可以通過靶向ATG16和ATG4阻斷吞噬體的成熟。在H37Ra感染的THP-1巨噬細胞中miR-106a下調(diào),miR-106a可以通過靶向ATG1、ATG7和ATG16抑制自噬。在MTB感染過程中強制表達miR-106a可以提高MTB存活率,而抑制miR-106a表達則可以降低MTB在細胞內(nèi)的存活率,該研究為結(jié)核病的診治提供了一個潛在的靶點[35]。在H37Rv感染的人原代樹突狀細胞中miR-155表達上調(diào),而在BCG和熱滅活的感染模型中miR-155表達的效果并不明顯,這表明miR-155的表達調(diào)控需要有毒性的活細菌刺激,該研究發(fā)現(xiàn)miR-155通過靶向抑制ATG3的表達進而抑制自噬[22]。另一項研究發(fā)現(xiàn),在活動性TB患者的巨噬細胞中l(wèi)ncRNA PCED1B-AS1表達下調(diào),并證明了PCED1B-AS1作為miR-155的“海綿”阻斷miR-155表達進而調(diào)控自噬,在體外模型中敲除PCED1B-AS1基因后細胞凋亡被抑制,自噬被促進。有趣的是,該研究還發(fā)現(xiàn)PCED1B-AS1的抑制可以明顯減弱腫瘤壞死因子-α誘導(dǎo)的凋亡[36],在我們之前的研究中發(fā)現(xiàn)在骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者中,自噬水平增加,腫瘤壞死因子-α的表達增加,破骨細胞的凋亡受到抑制,調(diào)控PCED1B-AS1維持骨關(guān)節(jié)結(jié)核患者骨平衡可能是一個潛在的靶點[37]。

2.3 ncRNAs在自噬體成熟和裂解階段調(diào)控自噬

自噬體與溶酶體的融合主要依賴于SNARE復(fù)合物,然而目前研究對這一過程的精確調(diào)控所知甚少[12]。其他蛋白如UVRAG也參與了自噬體的成熟階段,miRNA-125a-3p靶向UVRAG抑制自噬體的成熟[11]。也有研究發(fā)現(xiàn)MTB通過分泌蛋白質(zhì)酪氨酸激酶A來抑制吞噬體酸化和成熟[38],以及調(diào)節(jié)巨噬細胞鐵離子、氫離子濃度來影響自噬體和溶酶體的融合[39],其具體調(diào)控機制是否涉及ncRNAs調(diào)控仍需進一步研究。在自噬溶酶體裂解階段,ATG12直接參與了裂解,miR-33可以靶向ATG12進而抑制自噬[21]。ATG1和ATG13參與了溶酶體水解酶的轉(zhuǎn)運,miR-106a可以靶向ATG1抑制自噬[35]。

2.4 ncRNAs在巨噬細胞識別病原相關(guān)分子模式階段調(diào)控自噬

ncRNAs還可以在巨噬細胞識別病原相關(guān)分子模式階段調(diào)控自噬,Gu等[40]發(fā)現(xiàn)在MTB感染的小鼠巨噬細胞中miR-23a-5p表達上調(diào)并靶向TLR2蛋白,導(dǎo)致TLR2-MyD88-NF-κB信號通路的活性降低。TLR2是Toll樣受體家族的一員,在TLR2識別MTB分泌的病原相關(guān)分子模式后可以招募MyD88并通過下游信號分子激活NF-κB信號途徑,進而介導(dǎo)人單核細胞系的凋亡與自噬。同時MTB分泌的多種抑制性凋亡效應(yīng)物可以被TLR2識別進而實現(xiàn)免疫逃逸,如結(jié)核菌酸、索狀因子、海藻糖等。該研究揭示了MTB通過影響TLR2-MyD88-NF-κB信號通路實現(xiàn)免疫逃逸的另一重要機制[6,41]。此外巨噬細胞模式識別受體被激活后還可觸發(fā)p38-MAPK、ROP1-ERK等通路,進而激活PI3K-Beclin-1復(fù)合物及其下游信號。Ke等[42]發(fā)現(xiàn),活動性肺結(jié)核患者的單核細胞中l(wèi)incRNA-EPS表達下調(diào),并且單核細胞的自噬增強,凋亡減弱,該研究還證明了lincRNA-EPS下調(diào)可以通過激活JUN-MAPK信號通路抑制凋亡并增強自噬。在斑馬魚模型中發(fā)現(xiàn)了一種被稱為DNA損傷調(diào)節(jié)自噬相關(guān)蛋白(DNA damage-regulated autophagy modulator protein,DRAM)的蛋白家族,該蛋白可以在TLR2-MyD88-NF-κB通路的下游發(fā)揮作用激活自噬[43]。在一項研究中發(fā)現(xiàn)hsa-miR-144-5p(miR-144*)在BCG、H37Rv和H37Ra感染的人外周血單核細胞中以時間或劑量依賴性的方式上調(diào),miR-144*的過度表達可以靶向人類單核細胞和巨噬細胞中DRAM的3′UTR,從而抑制了吞噬體的形成。在肺結(jié)核和肺外結(jié)核患者的人類外周血單核細胞和組織中miR144*的水平升高,DRAM2的表達降低,這表明miR144*可能是一個潛在的診斷和治療靶點[44]。另一項研究也發(fā)現(xiàn),在BCG感染的小鼠巨噬細胞中,miR-125b-5p的表達上調(diào),并且其同樣可以靶向DRAM2進而抑制BCG感染的巨噬細胞自噬[45]。Chen等[46]發(fā)現(xiàn)在潛伏性結(jié)核患者中,miR-899的表達上調(diào),miR-899可以通過靶向抑制TWEAK的途徑抑制自噬以維持MTB的潛伏狀態(tài),TWEAK可以通過激活A(yù)MPK誘導(dǎo)自噬。重要的是,該研究還發(fā)現(xiàn)了TNF-α可以誘導(dǎo)miR-899的升高,并且在使用TNF-α抑制劑阿達木單抗治療后,潛伏性結(jié)核的患者miR-899降低,TWEAK升高并出現(xiàn)肉芽腫的破壞以及潛伏性TB的再激活,這表明miRNAs在潛伏性結(jié)核中也具有重要作用,同時也是診斷潛伏性TB以及再激活的生物標志物。

3 小結(jié)與展望

現(xiàn)階段ncRNAs調(diào)控自噬的研究證明了ncRNAs在MTB感染巨噬細胞自噬發(fā)生過程的多個階段參與了調(diào)控,其機制組成了一個復(fù)雜的信號交互網(wǎng)絡(luò)(圖1)。而MTB與巨噬細胞的相互作用十分復(fù)雜,涉及到細胞自噬、凋亡等免疫防御機制,還涉及到凋亡與自噬的相互調(diào)控。MTB也可以通過多種途徑實現(xiàn)免疫逃逸,本文綜述的ncRNAs調(diào)控機制是MTB免疫逃逸機制的一部分(表1)。然而目前的研究還遠遠不夠,仍有許多問題沒有解決,例如部分ncRNAs表達水平在MTB感染細胞中僅比對照組高一倍,這部分ncRNAs是否起主要調(diào)控作用仍需進一步闡明。在MTB感染中自噬體成熟階段所涉及ncRNAs的調(diào)控研究較少,目前已發(fā)現(xiàn)的調(diào)控機制中是否有ncRNAs的參與也需要進一步證明?？傊?更多ncRNAs調(diào)控MTB感染巨噬細胞自噬的研究值得期待,這對于進一步闡述MTB免疫逃逸機制和開發(fā)新型的抗結(jié)核藥物以及TB的早期診斷具有重要價值。

表1 參與調(diào)控MTB感染后巨噬細胞自噬的ncRNAs及其功能Table 1 ncRNAs and its function involved in regulating autophagy of MTB-infected macrophages

圖1 MTB感染中ncRNAs調(diào)控巨噬細胞自噬機制示意圖Fig.1 ncRNAs regulate macrophage autophagy in MTB infection