盧承印, 羅志強, 簡功輝, 齊新宇, 熊 輝△, 李汪洋

1湖南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院骨傷科,長沙 410005 2湖南中醫(yī)藥大學第二中醫(yī)臨床醫(yī)學院,長沙 410005

人體骨骼具有顯著的再生特性,是身體中少數幾個可以重建其正常細胞組成、方向和機械強度的結構之一[1]。但因受到損傷程度、感染、局部血供以及患者年齡等因素的影響,臨床上仍有5%～10%的骨折患者會出現延遲愈合或不愈合[2]。這種情況一旦出現,往往需要多次手術治療,給患者帶來極大的痛苦和高額的治療費用。因此,深入了解骨骼再生的具體機制,促進骨折愈合,是骨傷科領域重點研究的課題。

骨折愈合是一個多環(huán)節(jié)參與的復雜的修復過程,受眾多因素的影響。研究發(fā)現[3],在骨折愈合的過程中,血管生成和骨生成之間存在復雜的相互作用,二者以密切的時空和相互依賴的方式耦合:成骨細胞能夠分泌血管生長因子以促進血管生長并影響其功能,而血管內皮細胞能夠釋放血管分泌信號以調節(jié)骨骼的重塑和修復。這種血管生成與骨生成之間密切的關系被稱為“成血管-成骨耦聯”[4]。隨著2014年Kusumbe等[5]首次報道在小鼠長骨中鑒定出一種具有誘導骨形成能力的特殊血管亞型,即H型血管,進一步豐富了成血管-成骨耦聯的作用機制。研究表明,H型血管可以通過刺激骨髓中骨祖細胞增殖和分化,并分泌細胞因子來積極引導骨形成,進而促進骨折愈合[6-7]。因此,深入研究H型血管的功能將為骨折愈合提供新的見解和思路?；诖?本文通過在中國知網(CNKI)數據庫中以(“H型血管”)AND(“血管新生”O(jiān)R“骨形成”O(jiān)R“成血管-成骨耦聯”)為主題詞進行檢索,在PubMed數據庫中以(“H-type vessels”O(jiān)R“type H blood vessels”)AND(“Fracture”O(jiān)R“Angiogenesis”O(jiān)R“Osteogenesis”O(jiān)R“Angio-osteo coupling”)為MeSH詞和自由詞組合進行文獻檢索。經過篩選和詳細閱讀檢索到的文獻,對H型血管參與成血管-成骨耦聯的作用機制及調控H型血管新生的相關分子與信號通路進行綜述,以期為骨折的臨床治療和機制研究提供參考。

1 H型血管的定義與特點

血管由多種細胞組成,其中內皮細胞在血管發(fā)生和血管形成的過程中發(fā)揮著核心調節(jié)作用。2014年Nature雜志首次報道[5],根據內皮細胞的形態(tài)、表面標記物染色結果以及功能特征,從小鼠的干骺端和骨髓腔的毛細血管中鑒定出兩種不同的血管亞型,分別為高表達血小板內皮細胞粘附分子1(PECAM-1/CD31)及唾液糖蛋白內粘蛋白(EMCN)的H型血管和低表達CD31及EMCN的L型血管。其中H型血管主要分布于干骺端和骨內膜下,通過遠端血管弓相互連接,類似于直柱狀;而L型血管主要分布在骨干區(qū)域,在骨髓腔中顯示出高度分支的毛細血管網。兩種類型的血管在骨骺與骨干的連接處緊密相連,并在骨髓腔中形成一個完整的血管床。富氧血液從動脈入骨后,先流入H型血管,隨后流入骨骺與骨干連接處的L型血管,最終流入中央靜脈[8]。

研究發(fā)現,雖然H型血管內皮細胞僅占所有內皮細胞的1.77%和全部骨髓內皮細胞的0.015%,但超過70%的Osterix+成骨祖細胞、82%的Runx2+早期成骨細胞以及膠原蛋白1α+型成骨細胞、PDGFRβ+血管周細胞等骨祖細胞選擇性地分布在H型血管周圍[5],從而產生成骨細胞和骨細胞促進骨形成。而在L型血管周圍幾乎沒有骨祖細胞的分布[9]。此外,H型血管有高度分化成動脈的趨勢,這些動脈為骨缺損區(qū)域的局部血管網絡提供必要的營養(yǎng),以滿足骨缺損區(qū)域成骨的代謝需求[10-11]。這些研究結果均表明,相較于L型血管,H型血管在成骨方面發(fā)揮著更為重要的作用。

2 成血管-成骨耦聯機制

成血管-成骨耦聯機制是指在骨組織形成和修復過程中,血管新生和骨組織生成之間的相互作用的關系。骨是一種高度血管化的組織,其發(fā)育、成熟、重塑和再生依賴于血供的嚴格調節(jié)[12],在各類器官中血管生成是發(fā)生最早的事件之一,骨折后血供的好壞更直接影響骨的修復過程,影響其愈合速度。骨形成和骨改建均離不開血管生成,二者在時空上相互耦合:在時間上,血管新生早于骨形成,血管入侵是骨形成及礦化的前提條件;在空間上,新生血管為骨組織提供氧氣、激素、營養(yǎng)物質,調節(jié)骨骼的重塑和修復,還能清除骨細胞代謝所產生的廢物。而骨組織也可以影響血管的形成和功能,在骨組織中,成骨細胞會分泌一系列的細胞因子,如血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)等。這些細胞因子可以影響血管內皮細胞的增殖和分化,促進血管的形成,同時,它們也可以影響血管的功能,如調節(jié)血管的收縮和擴張,維持血管的通透性等。總之,成血管-成骨耦聯機制是指血管和骨組織之間的相互作用關系,這種相互作用關系可以促進骨組織的生長和修復,同時也可以影響血管的形成和功能,是骨組織再生和修復的重要機制之一[13]。

3 H型血管在成血管-成骨耦聯中的作用機制

H型血管作為一種毛細血管亞型,能夠與多種骨細胞相互作用,從而促進成血管與成骨之間的耦聯。首先,盡管H型內皮細胞在內皮細胞中所占的比例較低,但骨組織中的關鍵細胞群,如Osterix+成骨祖細胞、Runx2+早期成骨細胞、膠原蛋白1α+型成骨細胞和PDGFRβ+血管周細胞等選擇性地位于H型血管周圍,表明H型血管是促進骨再生的關鍵因子[5]。其次,H型血管內皮細胞能夠釋放出包括促進成骨細胞分化、增殖和骨基質合成的信號分子,以及調節(jié)血管生成和功能的生物活性分子,如Noggin和VEGF等。這些分子可能對周圍的骨組織細胞產生影響,刺激骨祖細胞的增殖和分化以調節(jié)成骨,從而在成血管-成骨耦聯中起到調節(jié)作用[14]。此外,H型血管作為特殊的血管類型,能夠在發(fā)育過程中分化為動脈,這些動脈的形成是骨組織中局部血管網形成的基礎,同時提供必要的營養(yǎng),以滿足骨缺損區(qū)域成骨的代謝需求[11]。這些結果表明,H型血管在介導血管生長、維持其周圍成骨譜系細胞數量以及在成骨和血管生成耦聯方面發(fā)揮著重要作用。

4 調控H型血管生成促進成血管-成骨耦聯的相關分子機制

由于H型血管在骨再生過程中具有促進成血管-成骨耦聯的能力,因此在骨折治療過程中調控H型血管生成,促進骨折區(qū)域H型血管增加,成為一種有前景的治療方法。迄今為止,HIF-1α、Notch、PDGF-BB、SLIT3等多種信號通路與分子,已被證明通過調控H型血管新生,參與到成血管-成骨耦聯的作用機制當中。見圖1、表1。

表1 部分調控H型血管促進成血管-成骨耦聯的藥物或干預方法Table 1 Partial regulatory drugs or interventions that promote angiogenesis-osteogenesis coupling in type H blood vessels formation

4.1 低氧誘導轉錄因子-1α

低氧誘導轉錄因子-1(hypoxia-inducible transcription factor-1,HIF-1)是一種介導細胞對氧氣變化反應,控制生理和病理新生血管生成的異源二聚體轉錄因子[25],由α亞基和β亞基組成,其中HIF-1α亞基的表達和活性受細胞內氧濃度的調節(jié)。在富氧環(huán)境中,抑癌蛋白pVHL可與羥基化的HIF-1α結合,隨后在Fe2+和氧氣的作用下降解,而在低氧狀態(tài)下,pVHL失活,從而影響HIF-1α的降解,導致HIF-1α表達增加,進而與HIF-1β結合形成HIF-1[26]。HIF-1作為一種轉錄因子,能夠與低氧反應元件結合,反式激活血管內皮生長因子(VEGF)等下游靶基因的表達,參與到調控血管新生的過程當中。

研究表明,HIF-1α是H型血管形成的重要啟動因子,在成血管-成骨耦聯中發(fā)揮關鍵作用[27]。Kusumbe等[5]研究發(fā)現,當小鼠HIF-1α基因敲除后,脛骨干骺端和骨內膜的H型血管表達顯著減少,而內皮細胞VHL基因的特異性敲除后,能夠使H型血管新生及骨小梁形成增加,并增加更多數量的Runx2+和Osterix+骨祖細胞。進一步研究發(fā)現,甲磺酸去鐵胺可促進HIF-1α的活性和穩(wěn)定性,顯著增加H型血管的表達。此外,Li等[15]制備了一種含生物活性脂質的超臨界CO2泡沫復合支架(FTY/MBG-PLGA),通過激活Erk1/2通路顯著上調HIF-1α的表達,并使H型血管的形成顯著增強,從而將血管生成與成骨結合起來,實現滿意的血管化骨再生。以上研究均表明,HIF-1α在調節(jié)H型血管生成,促進成血管與成骨間的耦聯中發(fā)揮著至關重要的作用。

4.2 Notch信號通路

Notch信號通路是一條高度保守且廣泛參與細胞通訊和發(fā)育的信號傳導通路,主要通過Notch受體(Notch1～4)和其配體(DLL1、3、4和Jagged1、2)之間的相互作用來傳遞信號[28]。盡管在大多數組織中,Notch信號激活可能通過抑制促血管生成因子的表達來抑制血管的出芽,從而對血管形成產生負面調節(jié)[29-30]。但最新研究發(fā)現[31-33],在骨組織中,Notch信號通路與骨微環(huán)境血管生成正向相關,可促進小鼠長骨中血管內皮細胞的增殖和血管生成。Ramasamy等[16]的實驗研究證明,對小鼠使用Notch受體失活劑(Fbwx)干預,能夠增加信號傳導,使H型血管、Runx2+骨祖細胞的數量及內皮細胞Noggin蛋白的分泌增加,Noggin蛋白作為骨形態(tài)發(fā)生蛋白的抑制劑,能夠促進成骨細胞的增殖分化和軟骨細胞的成熟肥大。而通過減少DLL4配體,對Notch信號進行傳導抑制,則會導致H型血管、Runx2+骨祖細胞及Noggin蛋白表達減少,使成骨細胞分化、骨形成和軟骨內骨化也被阻斷。由此表明,Notch信號通路在直接促進H型血管生成以及促進成血管-成骨耦聯中發(fā)揮重要作用。

4.3 血小板衍生生長因子-BB

血小板衍生生長因子-BB(platelet growth factor BB,PDGF-BB)是PDGF家族中的一種趨化和有絲分裂因子,主要由巨噬細胞(尤其是M2亞型)和破骨前體細胞分泌,能促進內皮祖細胞和間充質干細胞的遷移、增殖和分化,對促進血管生成和成骨至關重要[34]。研究表明,PDGF-BB通過與間充質干細胞和內皮祖細胞表面的受體PDGFRβ結合,激活PI3K/Akt信號通路,進而調節(jié)其遷移、分化和礦化,調控血管生成和成骨[35]。當發(fā)生骨缺損時,單核細胞/巨噬細胞譜系細胞如酒石酸鹽抗性酸性磷酸酶陽性(TRAP+)單核細胞和成骨細胞移動到骨缺損區(qū)域并分泌PDGF-BB,從而誘導骨膜衍生細胞(PDC)的表達和募集到骨膜表面,以支持血管和骨的形成[36]。

PDGF-BB是H型血管生成的關鍵因子[37]。Xie等[35]的研究表明,PDGF-BB在骨形成過程中促進了H型血管的形成,通過局部給予PDGF-BB或刺激破骨前體細胞分泌PDGF-BB可顯著增加H型血管內皮細胞的數量,而當PDGF-BB在成年小鼠中的表達水平降低時,H型血管的數量顯著減少,同時骨小梁和皮質骨量減少。Huang等[17]對骨質疏松模型小鼠使用β-咔啉生物堿(去氫駱駝蓬堿)治療,發(fā)現其能通過增加破骨前體細胞的數量和外源性PDGF-BB,促進H型血管的生成,從而誘導血管生成與骨形成的耦聯,促進骨再生。Shen等[18]的實驗研究也顯示,中藥提取物骨碎補總黃酮可通過PDGF-BB/PDGFR-β軸促進H型血管形成,從而增強牽張成骨過程中的成血管-成骨耦聯,促進骨折愈合。以上研究表明,PDGF-BB在促進H型血管生成及成血管-成骨耦聯機制中發(fā)揮重要作用。

4.4 神經軸突導向因子3

神經軸突導向因子(slit guidance ligand 3,SLIT3)屬于SLIT家族,是一種結構上高度保守的大分子分泌性糖蛋白,最早在中樞神經系統(tǒng)發(fā)育過程中發(fā)現,能夠調控神經軸突的定向生長[38]。SLIT3主要通過與靶細胞表面的受體ROBO(Roundabout)蛋白家族相互作用來發(fā)揮功能[39]。研究發(fā)現,除神經系統(tǒng)以外,SLIT3在腦、心臟、骨骼肌、臍靜脈等其他組織中也廣泛分布[40-41],并參與額外的生理功能,如血管生成等,是一種有效的促血管生成因子[42]。

Xu等[6]的研究顯示,SLIT3通過與其內皮細胞上的受體ROBO1結合,直接靶向骨H型血管來間接促進骨形成速率及骨量累積。在成骨細胞SHN3調節(jié)蛋白(成骨細胞活性抑制劑)特異性敲除的小鼠中發(fā)現SLIT3的表達增加,并表現出更好的骨形成和更高的H型血管表達,同時觀察到骨折愈合加速,而通過外源性SLIT3的給藥也能夠增加小鼠H型血管的數量,促進骨折愈合并防止骨丟失[43],表明成骨細胞來源的SLIT3能夠調節(jié)H型血管的表達,進而促進骨再生。Kim等[44]的研究則發(fā)現,破骨細胞分泌的SLIT3也能夠刺激成骨細胞募集和增殖進入骨重塑位點,增強成骨作用,敲除破骨細胞中的SLIT3會表現為H型血管減少,破骨細胞生成增多以及骨量降低。但與Kim研究結果相反,Li等[45]的研究結果顯示,破骨細胞并非SLIT3的主要生成來源,破骨細胞本身和其分化過程中并不產生SLIT3,且破骨細胞中SLIT3的條件性缺失對破骨細胞祖細胞的數量、體外破骨細胞分化、總骨量或骨吸收/形成沒有影響。以上研究表明,雖然SLIT3在骨中的來源尚存在爭議,但靶向SLIT3信號通路的確能夠調節(jié)H型血管生成,并促進成血管-成骨耦聯。

4.5 血管內皮生長因子

血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是促進血管生成的經典因子,包含有VEGFA、B、C、D以及胎盤生長因子(placenta growth factor,PLGF)等5種亞型,其中VEGFA型的成血管能力最強,也是目前研究最為充分的亞型。VEGFA通過與VEGFR2受體結合,促進內皮細胞的增殖和遷移。在骨髓中,VEGF可由軟骨細胞、破骨細胞、成骨細胞以及免疫細胞等分泌,并受到HIF-1α、PDGF-BB、Noggin等多種細胞因子和轉錄因子的調控,在成血管-成骨耦聯機制中發(fā)揮重要作用。Chen等[19]的研究顯示,人參皂苷Rg1能夠促進骨祖細胞分泌VEGF,激活Noggin/Notch通路,增加H型血管生成以及骨形成,并促進血管生成和成骨的耦聯。Wei等[20]對大鼠脛骨骨折模型采用土鱉蟲貼敷的方法治療,結果顯示該方法能夠通過激活VEGF/ERK1/2信號通路,增加脛骨骨痂處血管數量(CD31陽性)和面積,促進骨折愈合。以上研究均表明,VEGF在促進H型血管形成以及成血管-成骨耦聯機制方面發(fā)揮重要作用。

4.6 干擾素基因刺激因子

干擾素基因刺激因子(the stimulator of interferon genes,STING)是先天免疫的關鍵因素之一,其主要功能是在檢測到細胞內的DNA病毒感染或細胞內DNA損傷時,激活免疫反應以保護機體免受感染和疾病的侵害。近年來多項研究表明STING與血管生成及骨形成之間存在關聯[46-48]。Chen等[21]的研究顯示,在STING激活后,炎癥反應延長,H型血管生成減少,同時體內骨愈合過程減緩,而STING的抑制劑H-151或C-176則能夠增強H型血管的形成,加速骨愈合。以上研究表明,適度抑制STING的激活可能是一種潛在的免疫療法,可以通過增強H型血管形成進而促進成血管-成骨耦聯,促進骨愈合。

4.7 其他可能的影響因素

除以上相關分子及信號通路外,還有一些因子或干預方式也被發(fā)現可能具有調控H型血管生成,促進成血管-成骨耦聯的作用。Xu等[49]的研究顯示,低強度脈沖超聲(low-intensity pulsed ultrasound,LIPUS)能夠顯著增加脊柱融合過程中成骨細胞的數量,并伴有H型血管生成的增加。Bai等[23]的研究表明,低強度激光(low level laser therapy,LLLT)在促進干細胞成骨分化和血管生成中起重要作用,能夠促進H型血管和骨組織的形成,通過耦合血管生成和骨生成來增強骨修復和再生。此外,還有研究顯示,感覺神經在血管生成和骨生成之間具有重要作用[50],其中感覺神經蛋白信號素3A(Semaphorin3A,Sema3A)與H型血管密切相關,Sema3A在骨形成區(qū)域高表達,同時與H型血管在骨形成的整個過程中緊密共定位,且Sema3A的出現早于血管生成,表明H型血管的生成很可能受Sema3A的調控[51]。同時有研究證實通過在膠原支架中添加元素硅(Si)能夠刺激感覺神經分泌Sema3A來促進血管化骨再生[24]。除以上幾種因子和方式外,機械負荷[52]、RANKL-RANK信號通路[53]、基質金屬蛋白酶(MMPs)[22]等也被發(fā)現具有調控H型血管生成和促進成血管-成骨耦聯的作用,但以上干預方式仍有待進一步研究以闡明其發(fā)揮作用的具體機制[54]。

5 小結與展望

綜上所述,自2014年H型血管首次被鑒定并發(fā)現在成血管-成骨耦聯中具有重要作用以來,越來越多的骨科領域的學者們開始研究其作用機制并挖掘能夠調控H型血管生成,促進成血管-成骨耦聯的相關藥物及干預手段,從而為促進骨折愈合提供新的思路和方法。隨著研究的不斷深入,HIF-1α、Notch、PDGF-BB等調控H型血管生成的信號通路和細胞因子作用機制已逐漸明確,相關藥物和治療方法也隨之研發(fā)。此外,除骨折領域外,H型血管的作用機制也被應用于骨質疏松、骨關節(jié)炎以及股骨頭壞死等骨科相關疾病的發(fā)病機制和治療中進行研究,通過調節(jié)H型血管的生成,可以優(yōu)化骨組織的血供,促進受損骨組織的修復和再生。這表明,H型血管深入研究有望為這些骨科疾病帶來新的治療策略,進一步拓寬其在醫(yī)學領域內的應用范圍。

然而,盡管我們對H型血管的作用有了更深的認識,在這個領域仍有許多的未知和挑戰(zhàn)。首先,血管生成和骨生成是一個多靶點多通路的復雜網絡,目前關于促進H型血管生成的研究多集中在單一靶點或通路,因此還需要進行多靶點多通路的協同干預研究,從而實現骨折愈合的多方位調控,以期達到更好的治療效果。其次,對于各種信號通路和細胞因子影響H型血管生成的機制尚未完全明確,例如調控H型血管生成的SLIT3因子來源還存在爭議等,因此還需要通過更多的分子生物學和細胞生物學研究來進一步闡明。此外,目前針對H型血管促進成血管-成骨耦聯的相關研究大多仍局限于動物實驗,未來將這些動物實驗的成果轉化到人類患者,仍需開展更多的臨床前研究,以評估其安全性和有效性。

隨著相關研究的不斷深入,對H型血管在骨折愈合過程中促進成血管-成骨耦聯的機制將會進一步明確,各種促進H型血管生成的因子和通路之間的協同效應以及它們如何在骨折愈合早、中、晚期不同階段和不同環(huán)境(低氧、炎癥或機械壓力)中發(fā)揮作用,將為骨折愈合提供更為精確和個性化的治療策略。同時,隨著生物材料和組織工程技術在骨折領域的快速發(fā)展,通過3D打印、硅化膠原支架、超臨界CO2發(fā)泡等技術制造的新型的支架材料,不僅能夠提供骨折部位所需的機械支持,同時有利于細胞粘附、增殖和遷移,并通過負載的藥物或生物活性因子調節(jié)血管生成和成骨。因此,將這些生物組織工程材料與H型血管的作用機制進行結合,通過多學科交叉的創(chuàng)新方法研究骨折愈合和骨科疾病治療,將會為骨科疾病的治療提供新的思路。

總之,隨著未來學者們對H型血管作用機制的深入探索和理解,各種調控H型血管生成以促進成血管-成骨耦聯的藥物和治療策略的研發(fā),將有望成為臨床促進骨折愈合的一個重要方向。