宋 萍, 鄧 慧, 張孟賢

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院腫瘤科,武漢 430022

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma,GBM)是最常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)惡性腫瘤,約占后者的48%[1]。GBM診斷中位年齡為65歲左右,全球每年每10萬(wàn)人中有3～5人患病,男性多于女性[2]。既往對(duì)GBM的診斷主要基于其組織病理學(xué)特征,如壞死和微血管增生。世界衛(wèi)生組織2021年提出,LDH野生型星形細(xì)胞瘤即使沒(méi)有高級(jí)組織病理學(xué)特征,當(dāng)存在至少一個(gè)以下分子特征:如并發(fā)7號(hào)染色體擴(kuò)增或10號(hào)染色體缺失、EGFR擴(kuò)增或TERT啟動(dòng)子突變,也可以診斷為GBM[3]。由此提高了分子診斷在GBM診斷中的地位。目前GBM患者的標(biāo)準(zhǔn)治療方案包括最大限度的手術(shù)切除輔助替莫唑胺化療聯(lián)合放療,診斷后的中位總生存期約為14.6個(gè)月,幾乎所有GBM患者在治療后均會(huì)復(fù)發(fā),其5年生存率約為5%[4]。腫瘤治療電場(chǎng)(tumor treating field,TTF)聯(lián)合標(biāo)準(zhǔn)治療方案或聯(lián)合替莫唑胺治療新發(fā)GBM,可顯著提高患者的生存率[5]。而GBM的免疫治療、靶向治療以及復(fù)發(fā)GBM的TTF治療尚未見(jiàn)有明顯療效的報(bào)道。

傳統(tǒng)整體轉(zhuǎn)錄組測(cè)序主要反映數(shù)千個(gè)細(xì)胞的平均基因表達(dá),沒(méi)有考慮到樣本中各個(gè)細(xì)胞基因表達(dá)的異質(zhì)性。而單細(xì)胞測(cè)序是從單個(gè)細(xì)胞的水平上,對(duì)基因組、轉(zhuǎn)錄組、表觀基因組等進(jìn)行測(cè)序分析的技術(shù),主要涉及單細(xì)胞基因組學(xué)測(cè)序、單細(xì)胞蛋白組學(xué)測(cè)序、單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序、以及單細(xì)胞表觀基因組測(cè)序等。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(single-cell RNA sequencing,scRNA-seq)可在單個(gè)細(xì)胞的分辨率下解析基因的表達(dá),是研究細(xì)胞異質(zhì)性及探索腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移相關(guān)的細(xì)胞類型等方面的有利選擇[6]。其基本流程包括:單細(xì)胞分離和捕獲、細(xì)胞裂解、逆轉(zhuǎn)錄(將其RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA)、cDNA擴(kuò)增和文庫(kù)制備[7]。2009年對(duì)哺乳動(dòng)物小鼠的單胚層和卵母細(xì)胞進(jìn)行了scRNA-seq[8],是世界上第一例單細(xì)胞測(cè)序。當(dāng)時(shí)僅能檢測(cè)少量細(xì)胞,且成本高昂,限制了這種技術(shù)的大規(guī)模使用。隨著單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的不斷成熟,已經(jīng)有幾十種不同的測(cè)序技術(shù)被研究出來(lái)。2015年,Drop-seq[9]以及inDrop[10]兩種技術(shù)將微流體技術(shù)和scRNA-seq相結(jié)合,Cyto-seq將微孔板技術(shù)與scRNA-seq相結(jié)合,使快速、低成本地分析數(shù)千個(gè)細(xì)胞的基因表達(dá)成為可能。2017年以來(lái),分別基于Drop-seq和Cyto-seq原理的10X Genomics Chromium以及BD Rhapsody測(cè)序平臺(tái)相繼問(wèn)世,標(biāo)志著低成本的商業(yè)化單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)時(shí)代的到來(lái)。除了這些技術(shù),Smart-seq[11]、MARS-seq[12]、Microwell-seq[13]等技術(shù)也在被使用,其中Smart-seq技術(shù)能夠得到全長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄本,但其局限性為低通量、高成本,近年來(lái)科學(xué)家們?cè)诖思夹g(shù)的基礎(chǔ)之上不斷進(jìn)行改進(jìn),開發(fā)出了Smart-seq2[14]、Smart-seq3[15]技術(shù),不斷降低測(cè)序成本,提高樣品處理量。目前scRNA-seq技術(shù)已經(jīng)開發(fā)出許多分析方法,主要包括數(shù)據(jù)預(yù)處理、一般分析和探索性分析。數(shù)據(jù)的預(yù)處理包括質(zhì)控、比對(duì)和量化;一般分析包括低質(zhì)量細(xì)胞過(guò)濾、歸一化、高度可變基因選擇、降維、聚類和細(xì)胞類型注釋;探索性分析包括差異基因分析、功能富集、基因集變異分析、轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)、細(xì)胞軌跡、細(xì)胞-細(xì)胞相互作用、細(xì)胞周期和空間轉(zhuǎn)錄組分析[16]。

在GBM領(lǐng)域,基于scRNA-seq的研究有很大的進(jìn)展。2014年P(guān)atel等[17]對(duì)5例GBM樣本進(jìn)行scRNA-seq,揭示了GBM內(nèi)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的多樣性,此后越來(lái)越多的關(guān)于GBM的scRNA-seq研究不斷開展,包括通過(guò)對(duì)GBM中的細(xì)胞進(jìn)行聚類以鑒定出具有在特征基因、生物學(xué)特性、預(yù)后等方面具有差異的腫瘤細(xì)胞群體[17-20],鑒定出分布于腫瘤不同部位、出現(xiàn)于腫瘤發(fā)展過(guò)程中不同時(shí)段、具有不同作用的免疫細(xì)胞群體[21-24];分析癌細(xì)胞的發(fā)展軌跡以確定GBM腫瘤細(xì)胞的來(lái)源[25-27];利用基因間的表達(dá)相關(guān)性和基因的聚類來(lái)構(gòu)建基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[20,28-30];在GBM治療方面,通過(guò)對(duì)治療前后免疫微環(huán)境的分析,提出解決耐藥問(wèn)題以及增加治療敏感性的潛在靶點(diǎn)[31-36]。總之,scRNA-seq技術(shù)具有闡明腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制的巨大潛力,有利于腫瘤的個(gè)體化治療以及優(yōu)化各種治療方案,為GBM的精準(zhǔn)治療策略提供新的思路。

1 scRNA-seq探索腫瘤異質(zhì)性

腫瘤異質(zhì)性是指腫瘤演進(jìn)過(guò)程中分子生物學(xué)及基因方面發(fā)生的改變,從而使不同腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)速度、侵襲能力、對(duì)藥物的敏感性等產(chǎn)生差異[37]。GBM的異質(zhì)性不僅體現(xiàn)在不同的患者之間,也存在于同一患者的腫瘤細(xì)胞之間,其異質(zhì)性由多種因素共同驅(qū)動(dòng),如遺傳、表觀遺傳和微環(huán)境等[38]。不同患者的腫瘤具有不同的染色體畸變,每個(gè)患者的腫瘤細(xì)胞都有一組獨(dú)特的小范圍突變,這些突變劃分了每個(gè)腫瘤中不同的腫瘤細(xì)胞群[25]。

1.1 GBM的個(gè)體間異質(zhì)性

scRNA-seq揭示不同患者個(gè)體間分子及免疫浸潤(rùn)情況的差異。既往的整體轉(zhuǎn)錄組研究顯示GBM具有顯著的瘤間異質(zhì)性,GBM可以被定義為4個(gè)亞型:前神經(jīng)亞型(proneural subtype,PN)、經(jīng)典亞型(classical subtype,CL)、間充質(zhì)亞型(mesenchymal subtype,MES)、神經(jīng)亞型(neural subtype,NE)[39]。Wang等[40]通過(guò)對(duì)單細(xì)胞公共數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析得出結(jié)論,NE可能是腫瘤邊緣正常組織污染,因此將其排除在外。其余3個(gè)腫瘤亞型的基因表達(dá)、免疫微環(huán)境、腫瘤的生物學(xué)行為以及預(yù)后都不盡相同,PN、MES和CL亞型分別與血小板源性生長(zhǎng)因子受體(platelet derived growth factor receptor,PDGFRA)、Ⅰ型神經(jīng)纖維瘤病(neurofibromatosis type1,NF1)和表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor,EGFR)的基因表達(dá)異常相關(guān)聯(lián),CL和MES具有更高的侵襲行為,而PN具有相關(guān)良性行為[39]。MES評(píng)分高的患者伴隨著腫瘤微環(huán)境中豐富的巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞浸潤(rùn)[40]。一項(xiàng)基于單細(xì)胞公共數(shù)據(jù)庫(kù)的scRNA-seq研究顯示,不同亞型的細(xì)胞在同一患者體內(nèi)的分子相似性大于同一亞型細(xì)胞在不同患體內(nèi)的分子相似性,腫瘤細(xì)胞的拷貝數(shù)變異(copy number variation,CNV)狀態(tài)和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在同一患者中更加具有相似性,這表明腫瘤的瘤間異質(zhì)性比瘤內(nèi)異質(zhì)性更明顯[27]。

1.2 GBM腫瘤細(xì)胞間的異質(zhì)性

通過(guò)scRNA-seq可以鑒定同一患者腫瘤內(nèi)不同狀態(tài)的腫瘤細(xì)胞以及不同狀態(tài)腫瘤細(xì)胞之間基因、侵襲能力、腫瘤微環(huán)境的差異。2019年Neftel等[18]對(duì)20個(gè)成人和8個(gè)兒童GBM的共24131個(gè)細(xì)胞進(jìn)行scRNA-seq,發(fā)現(xiàn)GBM中的惡性細(xì)胞以神經(jīng)祖細(xì)胞(neural progenitor cell,NPC)樣、少突膠質(zhì)祖細(xì)胞(oligodendrocyte precursor cell,OPC)樣、星形膠質(zhì)細(xì)胞(astrocytes cell,AC)樣和間充質(zhì)細(xì)胞(mesenchymal,MES)樣的狀態(tài)存在。EGFR突變與AC樣狀態(tài)的相對(duì)豐度有關(guān),CDK4和PDGFRA的擴(kuò)增分別與NPC樣和OPC樣狀態(tài)的豐度相關(guān),而Chr5q的缺失、NF1的改變、大量免疫浸潤(rùn)和缺氧則影響MES樣狀態(tài)的頻率。AC樣狀態(tài)與MES樣狀態(tài)分別對(duì)應(yīng)MES、CL亞型,在PN的富集評(píng)分中,NPC樣和OPC樣狀態(tài)沒(méi)有顯著差異。NPC樣狀態(tài)是處于增殖狀態(tài)的細(xì)胞,可能是腫瘤細(xì)胞的起源。MES樣狀態(tài)中上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)基因上調(diào),誘導(dǎo)免疫介質(zhì),表達(dá)高水平的免疫因子,在免疫抑制的微環(huán)境中起重要作用,從而促進(jìn)腫瘤的增殖[24]。一項(xiàng)scRNA-seq研究鑒定了3種不同類型的MES樣狀態(tài),分別為缺氧相關(guān)的MES樣狀態(tài)(hypoxia-related,MES-Hyp)、星形膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)的MES樣狀態(tài)(astrocyte-related,MES-Ast)以及二者的中間狀態(tài)。這種不同狀態(tài)的形成可能與異常的免疫微環(huán)境相關(guān)。MES-Hyp優(yōu)先與NF1缺失、整體巨噬細(xì)胞豐度、巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞比值和M2相關(guān)的巨噬細(xì)胞相關(guān)。相反,MES-Ast與T細(xì)胞豐度和細(xì)胞毒性相關(guān)[41]。

1.3 GBM的時(shí)空異質(zhì)性

腫瘤的時(shí)空異質(zhì)性是指腫瘤細(xì)胞亞群在疾病部位之間和內(nèi)部的遺傳差異不均勻分布以及癌細(xì)胞分子組成的隨時(shí)間變化而變化[37]。既往根據(jù)多區(qū)域采樣的整體轉(zhuǎn)錄組研究同一個(gè)體的腫瘤可為多個(gè)亞型混合模式,亞型可以隨時(shí)間的推移而發(fā)生改變[39]。而scRNA-seq研究單個(gè)細(xì)胞的狀態(tài),每個(gè)腫瘤都是由處于多種細(xì)胞狀態(tài)的細(xì)胞組成的,這些細(xì)胞可能會(huì)增殖或過(guò)渡到其他狀態(tài),這是由于某些遺傳因素決定了特定的過(guò)渡速率,進(jìn)而定義了一個(gè)穩(wěn)態(tài)分布[18]。He等[20]發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞從周期細(xì)胞向NPC/OPC樣狀態(tài)再向MES樣狀態(tài)進(jìn)化,這表明GBM癌細(xì)胞的動(dòng)態(tài)進(jìn)化驅(qū)動(dòng)了膠質(zhì)瘤的腫瘤內(nèi)異質(zhì)性。Wang等[26]的研究揭示兩種膠質(zhì)瘤干樣細(xì)胞類型:前神經(jīng)干樣細(xì)胞型(proneural glioblastoma stem-like cells,pGSCs)、間充質(zhì)干樣細(xì)胞型(mesenchymal glioblastoma stem-like cells,mGSCs)。pGSCs在腫瘤前沿和浸潤(rùn)區(qū)域富集,mGSCs在腫瘤核心中更富集。這兩種干細(xì)胞處于同一個(gè)變異軸上,間充質(zhì)干細(xì)胞為前神經(jīng)干細(xì)胞的祖細(xì)胞。間充質(zhì)干細(xì)胞型在缺氧區(qū)富集,與不良預(yù)后相關(guān),而前神經(jīng)干細(xì)胞型則無(wú)法預(yù)測(cè)預(yù)后。Xiong等[27]結(jié)合Verhaak等[39]及Wang等[26]的scRNA-seq相關(guān)研究將腫瘤細(xì)胞分為PN、MES、CL、mGSCs以及pGSCs共5種類型,mGSCs來(lái)源于ME和CL亞型,而pGSCs主要來(lái)源于PN亞型,RNA速度顯示GSC亞型從間充質(zhì)表型轉(zhuǎn)變?yōu)樯窠?jīng)前表型。Lee等[19]利用scRNA-seq分析了來(lái)自多個(gè)位置和不同時(shí)間點(diǎn)的腫瘤細(xì)胞,多灶性腫瘤比局部鄰近腫瘤更具有遺傳多樣性,表現(xiàn)出空間遺傳異質(zhì)性。腫瘤的核心比腫瘤邊緣有更多的缺氧和粘附相關(guān)基因,腫瘤核心往往有大量具有增殖功能的細(xì)胞,且腫瘤的核心和腫瘤邊緣各種腫瘤細(xì)胞狀態(tài)和免疫細(xì)胞的比例也不同[22]。因此scRNA-seq揭示了GBM腫瘤內(nèi)不同不部位分布著不同狀態(tài)腫瘤細(xì)胞,以及這些細(xì)胞之間的演變。

2 scRNA-seq描述腫瘤免疫微環(huán)境

腫瘤免疫微環(huán)境包括腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞、細(xì)胞因子、細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,EMC)等。這些免疫細(xì)胞分為抗腫瘤和促腫瘤成分,它們之間的相互作用決定了抗腫瘤免疫的趨勢(shì)[42]?？鼓[瘤免疫細(xì)胞主要包括效應(yīng)T細(xì)胞(包括細(xì)胞毒性CD8+T細(xì)胞和效應(yīng)CD4+T細(xì)胞)、自然殺傷細(xì)胞(natural killer cells,NK細(xì)胞)、樹突狀細(xì)胞(dendritic cells,DCs)和M1相關(guān)巨噬細(xì)胞。促瘤免疫細(xì)胞主要為Treg細(xì)胞、髓系抑制細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)、M2型巨噬細(xì)胞等。在GBM腫瘤微環(huán)境中,大多數(shù)免疫細(xì)胞是腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor-associated macrophages,TAMs),占細(xì)胞總數(shù)的30%～40%[43],T細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)不到0.23%[44]。

2.1 腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞

scRNA-seq研究描述了GBM中腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的異質(zhì)性。GBM中的TAMs由兩種細(xì)胞群組成:常駐小膠質(zhì)細(xì)胞和骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞,前者占15%,后者占85%[45],近期的scRNA-seq研究發(fā)現(xiàn),兩者在腫瘤核心和周邊以及新發(fā)和復(fù)發(fā)的GBM中分別占有不同的比例。常駐小膠質(zhì)細(xì)胞和骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞分別優(yōu)先占據(jù)具有促炎標(biāo)志物表達(dá)的瘤周間隙和具有抗炎標(biāo)志物及促血管生成因子表達(dá)的腫瘤核心[22]。在新診斷的GBM中常駐小膠質(zhì)細(xì)胞占主導(dǎo),但在復(fù)發(fā)的GBM中骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞比例增加并占主導(dǎo)地位,尤其在缺氧的環(huán)境中,表達(dá)促炎細(xì)胞因子[46]。Cui等[38]通過(guò)scRNA-seq描繪了腫瘤免疫微環(huán)境腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的啟動(dòng)和抑制狀態(tài),TCGA不同的亞型中可以觀察到不同狀態(tài)的TAMs,幾乎所有的TAMs都是骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞,在CL亞型腫瘤中,抑制的小膠質(zhì)細(xì)胞占大部分,而在PN亞型中主要為抑制的巨噬細(xì)胞和啟動(dòng)的小膠質(zhì)細(xì)胞,二者各占40%。近期一項(xiàng)研究使用scRNA-seq描繪了4種類型的TAMs,TAM-0與細(xì)胞因子的產(chǎn)生及脂蛋白的代謝相關(guān);TAM-2過(guò)表達(dá)細(xì)胞周期相關(guān)基因;TAM-3高表達(dá)干擾素應(yīng)答基因;TAM-1對(duì)缺氧有反應(yīng),并與MES樣細(xì)胞具有顯著關(guān)聯(lián)[24]。另一項(xiàng)scRNA-seq相關(guān)研究顯示小膠質(zhì)細(xì)胞和單核/巨噬細(xì)胞均可進(jìn)一步分為不同功能的亞型,還發(fā)現(xiàn)男性患者中,小膠質(zhì)細(xì)胞和部分單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的MHCⅡ基因比女性表現(xiàn)出更強(qiáng)的表達(dá)上調(diào),這可能是免疫治療對(duì)男性患者療效更好的原因之一[47]。

2.2 其他免疫細(xì)胞

scRNA-seq研究顯示多種免疫細(xì)胞在GBM中表現(xiàn)為免疫抑制狀態(tài),并初步探討了相關(guān)機(jī)制。T細(xì)胞常定位于GBM的浸潤(rùn)邊緣和血管周圍[48],常常高表達(dá)一些標(biāo)記物如:PD-1、LAG-3、TIM-3和IDO,使其成為無(wú)功能或耗竭亞群[49]。Ravi等[50]通過(guò)scRNA-seq鑒定出6種CD4+T細(xì)胞亞群和6種CD8+T細(xì)胞亞群,證實(shí)了CD8+T細(xì)胞和小部分CD4+Th17樣細(xì)胞最終分化為衰竭T細(xì)胞,髓系細(xì)胞通過(guò)釋放IL-10介導(dǎo)T細(xì)胞功能障礙。與外周血相比腫瘤病變部位的Treg細(xì)胞和衰竭T細(xì)胞的比例增加[49]。scRNA-seq研究顯示腫瘤組織中的NK細(xì)胞,與外周血相比獲得了溶解功能降低相關(guān)改變的表型,使其失去細(xì)胞毒作用[49,51]。MDSCs是一種未成熟的髓系細(xì)胞,具有免疫抑制和腫瘤促進(jìn)特性,相比于早期,晚期GBM免疫微環(huán)境中的MDSCs數(shù)量增加[23]。Yeo等[23]發(fā)現(xiàn)一個(gè)高度增殖的GBM相關(guān)小膠質(zhì)細(xì)胞群體,它可能在激活GBM患者的緊急骨髓生成和招募MDSCs到GBM免疫微環(huán)境中發(fā)揮決定性作用。

2.3 非免疫細(xì)胞

scRNA-seq研究顯示非免疫細(xì)胞及ECM也在腫瘤的免疫微環(huán)境中發(fā)揮一定的作用。既往研究表明ECs可定義為兩大類,一類是腫瘤衍生內(nèi)皮細(xì)胞(tumor derived endothelial cells,TDECs),另一類是腫瘤相關(guān)血管(tumor associated vessels,TAVs),Carlson等[52]通過(guò)scRNA-seq描繪了這兩類ECs不同的分子特征。在對(duì)TAV軌跡分析中發(fā)現(xiàn)TAV從促血管生成的ECs向靜止的、內(nèi)穩(wěn)態(tài)的ECs過(guò)渡。TDECs由兩個(gè)不同的內(nèi)皮亞群組成:TDBECs和TDLECs,TDBECs具有豐富的血管發(fā)育特征,而TDLECs具有促炎和淋巴細(xì)胞特征。透明質(zhì)酸(hyaluronic acid,HA)作為ECM的主要成分,不僅可以干預(yù)巨噬細(xì)胞的招募和浸潤(rùn)還可以調(diào)節(jié)PD-L1的表達(dá),從而促進(jìn)免疫抑制的微環(huán)境[46]。

3 scRNA-seq挖掘瘤內(nèi)細(xì)胞間的通訊

3.1 間充質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)通路

MES亞型相對(duì)于其他亞型具有更強(qiáng)的侵襲性,而腫瘤微環(huán)境中存在許多通路使腫瘤細(xì)胞向MES亞型轉(zhuǎn)變,scRNA-seq技術(shù)可對(duì)這些通路進(jìn)行預(yù)測(cè)。一項(xiàng)scRNA-seq研究發(fā)現(xiàn)SPP1基因主要在巨噬細(xì)胞中表達(dá),CD44主要在MES樣細(xì)胞中表達(dá),所有細(xì)胞間相互作用中,巨噬細(xì)胞與MES樣細(xì)胞之間SPP1/CD44的相互作用強(qiáng),由此可以推測(cè)SPP1/CD44細(xì)胞通路在腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化間充質(zhì)狀態(tài)的過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用[20]。Hara等[30]通過(guò)對(duì)腫瘤模型進(jìn)行scRNA-seq,結(jié)合功能實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞衍生的抑癌素M(oncostatin M,OSM)與GBM細(xì)胞上的GP130復(fù)合物的受體(OSMR或LIFR)相互作用并激活STAT3,從而誘導(dǎo)了GBM的間充質(zhì)狀態(tài)。另一項(xiàng)scRNA-seq研究發(fā)現(xiàn)來(lái)自髓系細(xì)胞的非轉(zhuǎn)移性糖蛋白B(glycoprotein nonmetastatic B,GPNMB)可與大多數(shù)間充質(zhì)靶點(diǎn)相互作用。GPNMB高表達(dá)巨噬細(xì)胞亞群作為細(xì)胞通信的樞紐,不僅誘導(dǎo)PN向MES腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)化,還與樹突樣細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)而損害T細(xì)胞的活化。因此靶向GPNMB可以增加T細(xì)胞活化,抑制腫瘤細(xì)胞向間充質(zhì)轉(zhuǎn)化,有利于創(chuàng)造一個(gè)對(duì)腫瘤治療有益的微環(huán)境[29]。由此可見(jiàn),腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞在腫瘤的間充質(zhì)轉(zhuǎn)化中發(fā)揮著巨大的作用。

3.2 免疫微環(huán)境相關(guān)通路

通過(guò)scRNA-seq,在腫瘤細(xì)胞與腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞之間觀察到10對(duì)配體-受體促進(jìn)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞M2型極化,從而引發(fā)抗炎反應(yīng)及促腫瘤屬性[24]。Yeo等[23]建立GBM小鼠模型,發(fā)現(xiàn)腫瘤免疫微環(huán)境中大部分的細(xì)胞因子及其受體都存在于免疫細(xì)胞而非腫瘤細(xì)胞中,Cxcl12陽(yáng)性內(nèi)皮細(xì)胞和Cxcr4陽(yáng)性MDSCs之間的潛在回路,可能促進(jìn)了髓系抑制性細(xì)胞的募集和浸潤(rùn),從而導(dǎo)致了免疫抑制的微環(huán)境。Zhang等[46]研究GBM免疫微環(huán)境中腫瘤的代謝模式時(shí)發(fā)現(xiàn),透明質(zhì)酸通過(guò)IL-1/CHI3L1軸和TGF-β/CHI3L1軸參與巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)和募集。HA還可調(diào)節(jié)PD-L1的表達(dá),促進(jìn)免疫抑制微環(huán)境。另一項(xiàng)整體RNA測(cè)序結(jié)合scRNA-seq研究顯示MET過(guò)表達(dá)有助于STAT4/PD-L1通路的激活,從而使腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞抗炎介質(zhì)和血管生成相關(guān)基因的表達(dá)顯著升高,而促炎介質(zhì)的表達(dá)水平降低[28]。除此之外,T細(xì)胞與髓系細(xì)胞、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞之間的相互作用,往往導(dǎo)致T細(xì)胞功能損害,從而營(yíng)造了一個(gè)促腫瘤的免疫抑制的微環(huán)境[29,50]。

4 scRNA-seq在GBM治療中的應(yīng)用

4.1 免疫治療

scRNA-seq可以預(yù)測(cè)使T細(xì)胞功能抑制或者增強(qiáng)的靶點(diǎn)。免疫治療為癌癥治療提供了一種新的選擇,其中程序性死亡配體1(programmed death ligand-1,PD-L1)和程序性細(xì)胞死亡蛋白1(programmed cell death protein 1,PD-1)軸已被證實(shí)可以有效地幫助癌細(xì)胞逃避免疫系統(tǒng)。GBM對(duì)免疫治療具有明顯的耐藥性,一項(xiàng)scRNA-seq顯示抗PD-1治療后,髓系細(xì)胞高表達(dá)T細(xì)胞抑制檢查點(diǎn),從而阻止了腫瘤浸潤(rùn)性T細(xì)胞的激活[31]。Chen等[53]發(fā)現(xiàn)MARCO高表達(dá)亞群與間充質(zhì)、缺氧、抗炎特征以及不良預(yù)后相關(guān)。GBM在長(zhǎng)期抗PD-1免疫治療過(guò)程中,MARCO的表達(dá)明顯下降,預(yù)示著MARCO(+)巨噬細(xì)胞可能不利于檢查點(diǎn)免疫治療,在未來(lái)抗PD-1和靶向MARCO聯(lián)合治療可能是一個(gè)提高免疫治療效果的新方向。Goswami等[32]發(fā)現(xiàn)高表達(dá)CD73的巨噬細(xì)胞的特征基因與GBM的生存呈負(fù)相關(guān),對(duì)比7例未經(jīng)治療的GBM樣本及5例經(jīng)過(guò)抗PD-1治療過(guò)的GBM樣本,抗PD-1治療并沒(méi)有改善CD73高表達(dá)所導(dǎo)致的T細(xì)胞浸潤(rùn)不佳的免疫微環(huán)境,而CD73-荷瘤小鼠聯(lián)合抗PD-1以及抗CTLA-4治療,其免疫微環(huán)境中免疫刺激性巨噬細(xì)胞及T細(xì)胞比例增加。MES狀態(tài)免疫微環(huán)境中含有更多的浸潤(rùn)性T細(xì)胞,因此腫瘤的MES狀態(tài)可能對(duì)免疫治療具有更好的反應(yīng)[30]。

4.2 靶向治療

scRNA-seq可以揭示不同類型腫瘤細(xì)胞對(duì)不同靶向藥物的敏感性,解釋靶向藥物耐藥問(wèn)題。Alhalabi等[54]建立了一個(gè)PDGFRA擴(kuò)增的GBM模型,結(jié)合scRNA-seq發(fā)現(xiàn),其胰島素受體底物-1和底物-2(IRS1和IRS2)位點(diǎn)的拷貝數(shù)擴(kuò)增,使得達(dá)沙替尼存在時(shí)腫瘤仍然能夠快速生長(zhǎng)。另有研究表明MES亞型或MES樣細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)原癌基因激酶(proto-oncogene kinase Src,SRC)的激活特征,因此MES亞型能夠更好地響應(yīng)SRC抑制劑達(dá)沙替尼的治療。前神經(jīng)GSCs和經(jīng)典GSCs相比,間充質(zhì)GSCs對(duì)SRC抑制劑更敏感。Liu等[55]發(fā)現(xiàn),GBM中Wnt激活誘導(dǎo)了循環(huán)腫瘤細(xì)胞的干細(xì)胞性和化療耐藥性,這提示靶向Wnt可能為消除GBM治療中這些難治性細(xì)胞提供機(jī)會(huì)。AKAP12在各種抗VEGFR耐藥的腫瘤包括GBM中表達(dá)上調(diào),與腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞的豐度呈正相關(guān),還與GBM的缺氧、血管生成、轉(zhuǎn)移相關(guān),因此AKAP12與抗VEGF靶向治療的耐藥相關(guān)[56]。

4.3 化療

scRNA-seq可以描繪化療前后腫瘤免疫微環(huán)境的改變。高劑量的替莫唑胺治療除了直接發(fā)揮抗癌細(xì)胞作用外,也影響了GBM的免疫微環(huán)境,可能通過(guò)增加小膠質(zhì)細(xì)胞、減少M(fèi)DSCs和巨噬細(xì)胞的抑制群體,促進(jìn)CD8+T細(xì)胞存活,從而促進(jìn)促炎表型[23]。Zhao等[57]研究了單個(gè)細(xì)胞對(duì)藥物的反應(yīng),發(fā)現(xiàn)依托泊苷對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖有影響;而帕諾司他治療影響腫瘤和非腫瘤群體,誘導(dǎo)了腫瘤細(xì)胞中金屬硫蛋白家族基因和成熟神經(jīng)元基因的表達(dá),并顯著地重建了腫瘤微環(huán)境中的髓系群體,可使小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的促炎標(biāo)志下調(diào)以及CD168+巨噬細(xì)胞減少。由此可見(jiàn)化療藥物不僅可以作用于腫瘤細(xì)胞,也導(dǎo)致對(duì)腫瘤不利的免疫微環(huán)境。

scRNA-seq為解決腫瘤化療藥物耐藥問(wèn)題提供方向。盡管TMZ對(duì)分化的GBM細(xì)胞有效,但它不能有效地殺死GBM干細(xì)胞,被認(rèn)為是GBM發(fā)展的根源。Gong等[36]建立了一個(gè)替莫唑胺耐藥的GBM模型,發(fā)現(xiàn)替莫唑胺耐藥腫瘤中含有更多的靜止性癌癥干細(xì)胞(guiescent cancer stem cells,CSCs),這些CSCs表現(xiàn)出較低的自我更新和增殖能力,從而規(guī)避常規(guī)化療。在這些CSCs中發(fā)現(xiàn)一群NES+/SOX2+/CADM1+三陽(yáng)性亞群,其耐藥性更加顯著,可能是由于EGFR的缺乏及其下游通路的減少所導(dǎo)致的,進(jìn)一步研究表明EGF可提高TMZ耐藥腫瘤對(duì)TMZ的敏感性。Liu等[58]確定ZNF117是GSC分化的主要調(diào)控因子,介導(dǎo)GSC向少突膠質(zhì)細(xì)胞分化,后續(xù)結(jié)合體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了這一結(jié)論。因此靶向ZNF117的分化治療聯(lián)合TMZ化療,有可能增加GBM化療的敏感性。

4.4 局部治療

scRNA-seq研究局部治療前后免疫微環(huán)境的變化。腫瘤切除誘導(dǎo)復(fù)發(fā)腫瘤細(xì)胞中的小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)、血管生成以及幾種干細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)上調(diào)。由腫瘤細(xì)胞和腫瘤相關(guān)的小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞分泌多種營(yíng)養(yǎng)素(pleiotrophin,PTN),PTN可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖、自我更新和干細(xì)胞程序[59]。Couturier等[33]在對(duì)新發(fā)和復(fù)發(fā)GBM進(jìn)行scRNA-seq時(shí)發(fā)現(xiàn),放射治療可以誘導(dǎo)MES樣腫瘤細(xì)胞及反應(yīng)性星型膠質(zhì)細(xì)胞的產(chǎn)生,可能是由免疫細(xì)胞在應(yīng)對(duì)腫瘤治療時(shí)產(chǎn)生的促炎癥狀態(tài)所導(dǎo)致的。而這種MES細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄程序上與OPC及星形膠質(zhì)祖細(xì)胞相似,這可能是腫瘤治療后復(fù)發(fā)的原因之一。scRNA-seq和整體RNA測(cè)序數(shù)據(jù)集顯示,M1和M2巨噬細(xì)胞的比例與放療指數(shù)RSI評(píng)分之間存在關(guān)系,以及放射敏感腫瘤與M1/M2巨噬細(xì)胞比例之間存在正相關(guān)關(guān)系,因此靶向M2型巨噬細(xì)胞的治療可能能增強(qiáng)GBM放療的敏感性[35]。一項(xiàng)scRNA-seq研究TAM群體對(duì)放療反應(yīng)的變化,發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞的比例增加,導(dǎo)致免疫抑制表型[34]。

5 總結(jié)

scRNA-seq在分型方面具有更高的精準(zhǔn)度,同一腫瘤中可同時(shí)存在多種不同狀態(tài)的腫瘤細(xì)胞,這些腫瘤細(xì)胞具有不同的遺傳背景、免疫微環(huán)境和侵襲能力,具有一定的進(jìn)化方向。scRNA-seq可在分子水平上對(duì)GBM微環(huán)境中各類細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè),其中TAMs在GBM中不僅發(fā)揮著重要的免疫抑制功能還與腫瘤細(xì)胞的MES狀態(tài)密切相關(guān),不同亞型的腫瘤中以及同一腫瘤的核心與周邊分布著功能不同的TAMs。在治療方面,近年來(lái)scRNA-seq針對(duì)抗PD-1治療效果不佳做出了許多研究,結(jié)合靶向巨噬細(xì)胞的治療有可能增加T細(xì)胞的抗腫瘤效果。scRNA-seq還可以研究腫瘤的耐藥問(wèn)題,為解決腫瘤各種治療的耐藥問(wèn)題提出新思路。但是目前scRNA-seq依舊有許多局限性,如:①需要細(xì)胞分離、清除細(xì)胞碎片和死亡細(xì)胞,以獲得活的、單個(gè)的新鮮細(xì)胞,這可能會(huì)改變其轉(zhuǎn)錄組,且遺傳物質(zhì)過(guò)低的細(xì)胞容易被遺漏。②這些數(shù)據(jù)只從單個(gè)細(xì)胞中恢復(fù)了幾千個(gè)獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄本,遠(yuǎn)低于整個(gè)轉(zhuǎn)錄組譜。③丟失了關(guān)鍵的空間信息,不利于理解細(xì)胞功能和病理變化。④需要用質(zhì)量控制、批次矯正、樣本歸一化等研究方法降低scRNA-seq數(shù)據(jù)技術(shù)的噪聲和生物變異,最小化RNA損失和保持信息的保真度是scRNA-seq技術(shù)中的一個(gè)關(guān)鍵挑戰(zhàn)。越來(lái)越多的工具被專門提出用于分析scRNA-seq數(shù)據(jù),每種方法都有自己的優(yōu)缺點(diǎn),因此為了有效地處理scRNA-seq數(shù)據(jù)的高變異性,應(yīng)注意選擇適當(dāng)?shù)姆治龇椒╗6]。總之,scRNA-seq技術(shù)的不斷創(chuàng)新和伴隨而來(lái)的生物信息學(xué)方法的進(jìn)步,極大地促進(jìn)了生物學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)的研究。