蔣學(xué)林,劉長(zhǎng)江

(新疆醫(yī)科大學(xué)第六附屬醫(yī)院,新疆 烏魯木齊 830002)

橋本甲狀腺炎也稱為慢性淋巴細(xì)胞性甲狀腺炎,是目前最常見(jiàn)的器官特異性自身免疫性疾病,其主要特征在于甲狀腺特異性抗體的產(chǎn)生、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)及甲狀腺濾泡破壞,導(dǎo)致甲狀腺功能減退[1]。橋本甲狀腺炎發(fā)病隱匿且病程遷延,若不進(jìn)行及時(shí)治療,會(huì)損害全身組織器官,甚至引發(fā)癌變[2-3]。自噬是維持真核細(xì)胞數(shù)量的正常代謝途徑,主要由溶酶體介導(dǎo),其功能障礙與多種疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。研究表明,橋本甲狀腺炎患者的甲狀腺組織中自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)水平低于正常組織,提示甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞自噬異常,并引起了細(xì)胞凋亡,從而參與橋本甲狀腺炎的疾病進(jìn)展[4]。因此,探尋調(diào)節(jié)橋本甲狀腺炎中甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞自噬與凋亡的有效方案,可為橋本甲狀腺炎的預(yù)防、控制和治療提供新方向和新思路。洋地黃毒苷是一種源自洋地黃的天然強(qiáng)心苷,臨床上主要用于改善慢性心功能不全。近年來(lái)大量研究集中于洋地黃毒苷的抗癌潛力及機(jī)制上,表明洋地黃毒苷具有抑制腫瘤生長(zhǎng)、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化及腫瘤細(xì)胞干性等作用[5-6]。此外,洋地黃毒苷還可以減少促炎因子的產(chǎn)生,抑制炎癥性疾病和自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展[7],但洋地黃毒苷對(duì)橋本甲狀腺炎的潛在作用機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)體外脂多糖刺激人甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞系Nthy-roi3-1來(lái)模擬甲狀腺炎癥模型,探究了洋地黃毒苷對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的Nthy-roi3-1細(xì)胞自噬與凋亡的影響及其可能的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1主要材料與試劑 人甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞系Nthy-roi3-1(廣州博輝生物科技有限公司),洋地黃毒苷(四川省維克奇生物科技有限公司),脂多糖(北京伊塔生物科技有限公司),自噬抑制劑3-MA(美國(guó)Selleck公司),胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基及胰酶(美國(guó)Sigma公司),CCK-8細(xì)胞增殖活性檢測(cè)試劑盒(上海酶研生物科技有限公司),Triton X-100(美國(guó)Thermo Fisher公司),DAPI(北京康瑞納生物科技有限公司),抗熒光淬滅封片劑、RIPA裂解液、BCA法蛋白濃度檢測(cè)試劑盒及ECL化學(xué)發(fā)光液(上海碧云天生物科技公司),PVDF膜(美國(guó)Millipore公司),Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司),抗體微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)、Bcl-2同源結(jié)構(gòu)域蛋白抗體(Beclin 1)、p70S6K、Alexa Fluor 488熒光標(biāo)記山羊抗兔IgG、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(英國(guó)Abcam公司),抗體磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、蛋白激酶B(Akt)、磷酸化哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)及GAPDH(北京索萊寶生物科技有限公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與分組處理 在Nthy-roi3-1細(xì)胞中添加含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基,置于37 ℃恒溫、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每2 d換液1次,按照1∶3比例傳代培養(yǎng)。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Nthy-roi3-1細(xì)胞按照每孔5×104個(gè)接種于96孔板,實(shí)驗(yàn)分為5組:對(duì)照組采用正常培養(yǎng)基培養(yǎng),脂多糖組采用含10 ng/mL 脂多糖的培養(yǎng)基培養(yǎng),脂多糖+洋地黃毒苷低劑量組采用含10 ng/mL 脂多糖與0.5 μmol/L洋地黃毒苷的培養(yǎng)基培養(yǎng),脂多糖+洋地黃毒苷中劑量組采用含10 ng/mL 脂多糖與1.0 μmol/L洋地黃毒苷的培養(yǎng)基培養(yǎng),脂多糖+洋地黃毒苷高劑量組采用含10 ng/mL 脂多糖與2.0 μmol/L洋地黃毒苷的培養(yǎng)基培養(yǎng),各組均培養(yǎng)24 h。

1.2.2細(xì)胞活力檢測(cè) 將Nthy-roi3-1細(xì)胞置于37 ℃恒溫、5%CO2培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)后,棄掉原培養(yǎng)基,按照1.2.1進(jìn)行分組處理,每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔,置于培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24,48,72 h,每孔加入10 μL CCK-8試劑液,將細(xì)胞與試劑液混勻,繼續(xù)孵育2 h,結(jié)束后用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔在450 nm處的光密度。

1.2.3細(xì)胞中LC3陽(yáng)性表達(dá)檢測(cè) 收集按1.2.1處理后的各組Nthy-roi3-1細(xì)胞,接種于含蓋玻片的6孔培養(yǎng)板上培養(yǎng)至融合度達(dá)到90%以上,PBS洗滌,4%多聚甲醛固定,0.1%Triton X-100透化20 min,5%牛血清白封閉30 min,在玻片上加入LC3兔多克隆抗體(1∶200),放入濕盒,4 ℃孵育過(guò)夜。次日,PBS洗滌,接著加入熒光標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體(1∶500),室溫避光孵育1 h。PBS洗滌后,DAPI染核,抗熒光淬滅封片劑封片,晾干,通過(guò)熒光顯微鏡觀察各組Nthy-roi3-1細(xì)胞熒光染色情況并獲取圖像。

1.2.4細(xì)胞凋亡檢測(cè) 收獲各組Nthy-roi3-1細(xì)胞,PBS洗滌后,加入胰酶消化,通過(guò)離心機(jī)4 ℃、4 000 r/min離心5 min,棄上清,將沉淀重懸于100 μL結(jié)合緩沖液中,依次加入5 μLAnnexin V-FITC和5 μL PI染色液,輕輕混勻后在室溫下避光孵育15 min,再次離心去除上清,吸取500 μL結(jié)合緩沖液添加到流式管中,重懸細(xì)胞,使用流式細(xì)胞儀分析各組細(xì)胞凋亡情況。

1.2.5細(xì)胞中自噬及Akt/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blot法檢測(cè):在收集的各組Nthy-roi3-1細(xì)胞中添加適量RIPA裂解液,冰上靜置30 min,通過(guò)離心機(jī)4 ℃、12 000 r/min離心10 min,吸取上清液,測(cè)定蛋白濃度。將蛋白與Loading buffer混合,100 ℃加熱變性,通過(guò)電泳分離并電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,再將膜浸入5%脫脂牛奶中,室溫封閉1 h,TBST洗膜,加入相應(yīng)一抗工作液(1∶1 000),置于4 ℃孵育過(guò)夜,次日,取膜復(fù)溫,TBST洗膜,再加入相應(yīng)二抗工作液(1∶5 000),室溫孵育1 h,再次用TBST清膜。利用ECL化學(xué)發(fā)光液顯影,將蛋白可視化,以GAPDH作為內(nèi)參蛋白,使用Image J軟件分析各目的蛋白條帶的灰度值。

1.2.6自噬抑制劑處理細(xì)胞與實(shí)驗(yàn)檢測(cè) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Nthy-roi3-1細(xì)胞按照每孔5×104個(gè)接種于96孔板,分為4組進(jìn)行處理:對(duì)照組采用正常培養(yǎng)基培養(yǎng),脂多糖組采用含10 ng/mL脂多糖的培養(yǎng)基培養(yǎng),脂多糖+洋地黃毒苷組采用含10 ng/mL脂多糖與2.0 μmol/L洋地黃毒苷的培養(yǎng)基培養(yǎng),脂多糖+洋地黃毒苷+自噬抑制劑組采用含10 ng/mL 脂多糖、2.0 μmol/L洋地黃毒苷及5 mmol/L 3-MA的培養(yǎng)基培養(yǎng),各組均培養(yǎng)24 h。處理結(jié)束后,收集4組Nthy-roi3-1細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率,Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞中自噬及Akt/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況。

2 結(jié) 果

2.1未抑制自噬洋地黃毒苷對(duì)脂多糖誘導(dǎo)Nthy-roi3-1細(xì)胞的影響

2.1.1各組Nthy-roi3-1細(xì)胞活力比較 培養(yǎng)48 h和72 h,脂多糖組細(xì)胞活力均明顯低于對(duì)照組(P均<0.05),脂多糖+洋地黃毒苷各組細(xì)胞活力均明顯高于脂多糖組(P均<0.05),且脂多糖+洋地黃毒苷各組細(xì)胞活力隨洋地黃毒苷劑量增加而逐漸升高,組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 各組Nthy-roi3-1細(xì)胞培養(yǎng)不同時(shí)間后細(xì)胞活力比較

2.1.2各組Nthy-roi3-1細(xì)胞自噬情況比較 與對(duì)照組比較,脂多糖組細(xì)胞中LC3熒光染色強(qiáng)度明顯減弱;與脂多糖組比較,脂多糖+洋地黃毒苷各組細(xì)胞中LC3熒光染色強(qiáng)度隨洋地黃毒苷劑量增加而逐漸增強(qiáng)。見(jiàn)圖2。

2.1.3各組Nthy-roi3-1細(xì)胞凋亡情況比較 脂多糖組細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照組(P<0.05);脂多糖+洋地黃毒苷各組細(xì)胞凋亡率均明顯低于脂多糖組(P均<0.05),脂多糖+洋地黃毒苷中、高劑量組細(xì)胞凋亡率均明顯低于脂多糖+洋地黃毒苷低劑量組(P均<0.05),脂多糖+洋地黃毒苷高劑量組明顯低于脂多糖+洋地黃毒苷中劑量組(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

圖3 各組Nthy-roi3-1細(xì)胞凋亡情況比較

2.1.4各組Nthy-roi3-1細(xì)胞中自噬及Akt/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況 與對(duì)照組比較,脂多糖組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin1蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯降低(P均<0.05),p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR及p70S6K蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯升高(P均<0.05);與脂多糖組比較,脂多糖+洋地黃毒苷各組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin1蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯升高(P均<0.05),p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR及p70S6K蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯降低(P均<0.05);脂多糖+洋地黃毒苷各組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin1蛋白相對(duì)表達(dá)量隨洋地黃毒苷劑量增加而逐漸升高,p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR及p70S6K蛋白相對(duì)表達(dá)量隨洋地黃毒苷劑量增加而逐漸降低,組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見(jiàn)圖4及圖5。

圖4 各組Nthy-roi3-1細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白表達(dá)情況

圖5 各組Nthy-roi3-1細(xì)胞中Akt/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況

2.2抑制自噬對(duì)洋地黃毒苷調(diào)節(jié)脂多糖誘導(dǎo)Nthy-roi3-1細(xì)胞的影響

2.2.1各組細(xì)胞凋亡情況比較 脂多糖組細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照組(P<0.05),脂多糖+洋地黃毒苷組細(xì)胞凋亡率明顯低于脂多糖組(P<0.05),脂多糖+洋地黃毒苷+自噬抑制劑組細(xì)胞凋亡率明顯高于脂多糖+洋地黃毒苷組(P<0.05)。見(jiàn)圖6。

圖6 各組Nthy-roi3-1細(xì)胞凋亡情況比較

2.2.2各組細(xì)胞中自噬及Akt/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況比較 與對(duì)照組比較,脂多糖組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin1蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯降低(P均<0.05),p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR及p70S6K蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯升高(P均<0.05);與脂多糖組比較,脂多糖+洋地黃毒苷組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin1蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯升高(P均<0.05),p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR及p70S6K蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯降低(P均<0.05);與脂多糖+洋地黃毒苷組比較,脂多糖+洋地黃毒苷+自噬抑制劑組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin1蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯降低(P均<0.05),p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR及p70S6K蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯升高(P均<0.05)。見(jiàn)圖7及圖8。

圖7 各組Nthy-roi3-1細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白表達(dá)情況

圖8 各組Nthy-roi3-1細(xì)胞中Akt/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況

3 討 論

甲狀腺作為最大的內(nèi)分泌腺,對(duì)于機(jī)體的正常生長(zhǎng)發(fā)育和新陳代謝至關(guān)重要。甲狀腺基本結(jié)構(gòu)和功能單位是甲狀腺濾泡,其周圍環(huán)繞著甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞,當(dāng)腺體功能低下時(shí),甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞由立方狀變?yōu)楸馄綘?這一形態(tài)改變與橋本甲狀腺炎的發(fā)生密切相關(guān)[8]。橋本甲狀腺炎作為最常見(jiàn)的自身免疫性內(nèi)分泌疾病之一,其病因尚不明確,遺傳易感性、免疫紊亂、環(huán)境因素和表觀遺傳因素均對(duì)該疾病產(chǎn)生影響。目前主要的治療方法是進(jìn)行甲狀腺激素替代治療,可以恢復(fù)甲狀腺功能,但不能完全根治,長(zhǎng)期服用還會(huì)引起一系列不良反應(yīng)[9]。通過(guò)深入探究橋本甲狀腺炎的病因及機(jī)制來(lái)尋找針對(duì)性靶點(diǎn)或有效藥物,對(duì)于患者的臨床治療具有重要意義。

洋地黃毒苷能夠減輕心肌重塑和增強(qiáng)心肌收縮力,改善血流動(dòng)力學(xué),具有抗心力衰竭的作用[10-11]。目前已發(fā)現(xiàn)洋地黃毒苷對(duì)多種腫瘤生長(zhǎng)有抑制作用,如洋地黃毒苷可通過(guò)誘導(dǎo)G2/M細(xì)胞周期停滯,觸發(fā)線粒體凋亡,抑制宮頸癌生長(zhǎng)[12];在結(jié)腸癌中,洋地黃毒苷以信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)激活因子3(STAT3)非依賴性方式抑制KRAS突變結(jié)腸癌細(xì)胞中缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)的表達(dá),從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡并抑制其增殖和遷移[13]。此外,在流感病毒存在下,洋地黃毒苷能夠抑制棉鼠肺組織中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、生長(zhǎng)相關(guān)癌基因/角細(xì)胞趨化因子(GRO/KC)、巨噬細(xì)胞炎性蛋白-2(MIP-2)、單核細(xì)胞趨化因子-1(MCP-1)及干擾素γ(IFN-γ)的表達(dá),對(duì)流感和冠狀病毒感染都有治療潛力[14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,洋地黃毒苷能夠增強(qiáng)脂多糖誘導(dǎo)下Nthy-roi3-1細(xì)胞活力,由此推測(cè)洋地黃毒苷可能在炎性環(huán)境下對(duì)人甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞起保護(hù)作用。

自噬可以去除或降解受損的細(xì)胞器和大分子物質(zhì),參與細(xì)胞成分的基本轉(zhuǎn)化,使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)循環(huán)利用,實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的自我更新,從而為細(xì)胞提供維持其穩(wěn)態(tài)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和能量[15]。凋亡存在于各種細(xì)胞生物體中,是一種受促凋亡因子和抗凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)的程序性細(xì)胞死亡[16]。自噬和凋亡之間有著千絲萬(wàn)縷的聯(lián)系,兩者的相互作用可以在一定程度上達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡,從而維持細(xì)胞的基本生理功能,而當(dāng)兩者之間的平衡被打破時(shí),就會(huì)發(fā)生疾病。以往研究表明,自噬抑制可以激活橋本甲狀腺炎患者體內(nèi)的活性氧水平,誘導(dǎo)甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞凋亡[17],因此,促進(jìn)自噬可能是減少橋本甲狀腺炎中甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞凋亡的重要途徑。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,脂多糖誘導(dǎo)的Nthy-roi3-1細(xì)胞中自噬標(biāo)志蛋白LC3熒光染色強(qiáng)度明顯減弱,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin1蛋白表達(dá)也顯著下調(diào),而細(xì)胞凋亡率明顯增高,說(shuō)明自噬水平受到抑制從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;在脂多糖誘導(dǎo)下同時(shí)加入洋地黃毒苷進(jìn)行處理,結(jié)果顯示Nthy-roi3-1細(xì)胞中自噬標(biāo)志蛋白LC3熒光染色強(qiáng)度明顯增強(qiáng),LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin1蛋白表達(dá)顯著上調(diào),細(xì)胞凋亡率降低,這一結(jié)果提示洋地黃毒苷可能通過(guò)促進(jìn)自噬來(lái)減少脂多糖誘導(dǎo)的Nthy-roi3-1細(xì)胞凋亡。

Akt/mTOR信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)自噬,是自噬的負(fù)調(diào)節(jié)因子,抑制該通路可直接激活自噬[18-19]。在本研究中,通過(guò)脂多糖誘導(dǎo)的Nthy-roi3-1細(xì)胞中p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR及p70S6K蛋白表達(dá)顯著上調(diào),說(shuō)明該信號(hào)通路被激活而抑制了自噬;而經(jīng)過(guò)脂多糖和洋地黃毒苷共處理的Nthy-roi3-1細(xì)胞中p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR及p70S6K蛋白表達(dá)顯著下調(diào),因此推測(cè)洋地黃毒苷對(duì)自噬的促進(jìn)作用可能與抑制Akt/mTOR信號(hào)通路有關(guān)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這一推測(cè),本研究在脂多糖和洋地黃毒苷處理時(shí)加入自噬抑制劑3-MA,結(jié)果顯示LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin1蛋白表達(dá)顯著下調(diào),p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR及p70S6K蛋白表達(dá)顯著上調(diào),由此表明洋地黃毒苷通過(guò)抑制Akt/mTOR信號(hào)通路促進(jìn)了脂多糖誘導(dǎo)下的Nthy-roi3-1細(xì)胞自噬。

綜上所述,脂多糖誘導(dǎo)的人甲狀腺濾泡上皮Nthy-roi3-1細(xì)胞活性降低,自噬受到抑制,細(xì)胞凋亡增加,而洋地黃毒苷能夠促進(jìn)脂多糖誘導(dǎo)的人甲狀腺濾泡上皮Nthy-roi3-1細(xì)胞自噬,從而抑制細(xì)胞凋亡,該作用與其抑制Akt/mTOR信號(hào)通路的激活有關(guān)。本研究為洋地黃毒苷治療橋本甲狀腺炎提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù),但橋本甲狀腺炎病理機(jī)制復(fù)雜,洋地黃毒苷能否在體內(nèi)發(fā)揮良好的治療效果以及是否還涉及調(diào)控其他重要通路,有待后續(xù)進(jìn)一步深入探討。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。